一种酸性脂肪酶基因LipC及其编码的酸性脂肪酶的制备方法

摘要

本发明提供了一种酸性脂肪酶基因LipC及其编码的酸性脂肪酶的制备方法，属于基因工程技术领域。所述酸性脂肪酶基因LipC的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，利用包括酸性脂肪酶基因LipC的重组表达菌株制备酸性脂肪酶的方法，包括以下步骤：1)活化培养重组菌株C‑OB

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种酸性脂肪酶基因LipC及其编码的酸性脂肪酶的制备方法。

背景技术

脂肪酶又称三酰基甘油水解酶(EC 3.1.1.3)，是一类能在油水界面或非水相系统中催化酯类物质发生水解、酯化、酯交换以及合成等化学反应的生物催化剂，具有化学选择性、立体选择性和底物专一性等特点，是当代酶工业最受瞩目的酶种之一。自然界中的许多动物、植物、微生物均能产脂肪酶。其中，微生物脂肪酶催化反应条件温和，并且不会导致环境污染，且易于培养，可通过育种手段提高产酶量，且有比动植物脂肪酶更广的作用温度、作用pH值和底物特异性，因而，从微生物代谢产物中寻求脂肪酶成为科研工作者的研究热点。

近年来，人们对脂肪酶耐热、耐酸等酶学特性提出了新的要求，且已成为国内外一个新的研究热点。酸性脂肪酶广泛地应用于食品风味改进、油脂水解与改性、皮革脱脂、药物修饰、生物柴油等工业领域，但目前多数脂肪酶的最适反应pH值在6～9之间，少数脂肪酶耐受的最低pH值为5左右；多数耐受温度较高的脂肪酶耐酸性差，在生产中由于耐热或耐酸性较差而失活，或酶作用的最适温度和pH值不在生产工艺要求范围内而受限制。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种耐热性、耐酸性良好的脂肪酶基因LipC及其编码的酸性脂肪酶的制备方法。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：一种酸性脂肪酶基因LipC，所述酸性脂肪酶基因LipC具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

本发明提供了所述基因LipC编码的酸性脂肪酶，所述酸性脂肪酶具有如SEQ IDNo.2所示的氨基酸序列。

本发明提供了包括上述基因LipC的重组表达载体，所述重组载体包括原始表达载体和基因LipC。

优选的，所述重组表达载体还包括折叠酶基因LifB，所述折叠酶基因LifB的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

优选的，所述原始表达载体为pETDUET-1。

本发明提供了一株包括所述重组表达载体的重组菌株C-OB₅，所述重组菌株C-OB₅的保藏编号为GCMCC>

本发明还提供了所述的重组表达菌株制备酸性脂肪酶的方法，包括以下步骤：1)活化培养重组菌株C-OB₅获得种子液；2)将所述种子液接种于自动诱导发酵培养基中依次进行高溶氧发酵和低溶氧发酵后，收集菌体细胞，破胞后获得酸性脂肪酶；所述高溶氧发酵的温度为29～31℃，搅拌转速为120～180rpm，通气量为480～520L/h；所述低溶氧发酵的温度为24～26℃，搅拌转速为220～280rpm，所述低溶氧发酵过程不通气。

优选的，所述高溶氧发酵的时间为4～8h；所述低溶氧发酵的时间为32～40h。

优选的，所述自动诱导发酵培养基包括以下浓度的组分：蛋白胨8～12g/L，酵母粉4～6g/L，甘油4.5～5.5g/L，葡萄糖0.4～0.6g/L，乳糖4.5～5.5g/L，Na₂HPO₄·12H₂O>46.5～7.0g/L，NH₄Cl>2SO₄0.65～0.75g/L，MgSO₄·7H₂O0.45～0.55g/L，氨苄0.5～1.5mg/ml。

优选的，所述种子液的接种量为0.1～0.15％；所述种子液的OD₆₀₀为1.5～2.0。

本发明的有益效果：本发明提供的酸性脂肪酶基因LipC编码的酸性脂肪酶的最适反应pH范围为2.5～4，最适反应温度范围为45～60℃，耐热性和耐酸性好，应用范围广。

进一步的，本发明提供的酸性脂肪酶的制备方法，将所述折叠酶基因LifB编码的蛋白作为伴侣蛋白与酸性脂肪酶基因LipC共表达，制备获得的酸性脂肪酶的表达量高，酶活力高；所述酸性脂肪酶的蛋白表达量为1.54mg/ml，酶活力达到336.7U/ml。

附图说明

图1为实施例1中重组表达载体pET-CB的构建图谱；

图2为实施例2中酸性脂肪酶Ni柱纯化的SDS电泳图；

图3为实施例3中酸性脂肪酶最适反应pH的曲线图；

图4为实施例3中酸性脂肪酶最适反应温度的曲线图。

生物保藏说明

本发明提供的重组菌株C-OB₅(Escherichia coli)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏时间为2017年5月8日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为GCMCC>

具体实施方式

本发明提供了一种酸性脂肪酶基因LipC，所述酸性脂肪酶基因LipC的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，共1314bp。

在本发明中所述酸性脂肪酶基因LipC来源于唐菖蒲伯克霍尔德菌(Burkholderiagladioli)，本发明中从所述唐菖蒲伯克霍尔德菌中扩增获得所述酸性脂肪酶基因；在本发明具体实施过程中，以所述唐菖蒲伯克霍尔德菌的全基因组DNA为模板通过PCR扩增获得所述酸性脂肪酶基因。在本发明中所述PCR扩增的引物优选的为P1和P2；所述P1的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；所述P2的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。在本发明中所述PCR扩增的体系优选的如表1所示；所述PCR扩增的程序优选的为94℃变性1min，然后94℃变性40s，60℃复性40s，72℃延伸80s，30个循环后，72℃保温10min。

表1扩增获得酸性脂肪酶基因LipC的扩增体系

5*Prime STAR Buffer10μldNTP4μlPrimeSTAR酶0.5μlP11μlP21μlDNA模板<200ngddH₂O补足50μl

本发明提供了所述基因LipC编码的酸性脂肪酶，所述酸性脂肪酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，包括437个氨基酸。

本发明提供了包括上述基因LipC的重组表达载体，所述重组载体包括原始表达载体和基因LipC。在本发明中，所述原始表达载体优选为pETDUET-1。

在本发明中，所述重组表达载体优选的还包括折叠酶基因LifB，所述折叠酶基因LifB的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，共包括1047bp。

在本发明中所述折叠酶基因LifB来源于唐菖蒲伯克霍尔德菌(Burkholderiagladioli)的全基因组序列；所述折叠酶基因LifB编码的蛋白作为伴侣蛋白与酸性脂肪酶基因LipC共表达，获得有活性的酸性脂肪酶。在本发明中所述折叠酶基因LifB，是以所述唐菖蒲伯克霍尔德菌的全基因组DNA为模板通过PCR扩增获得。在本发明中所述PCR扩增的引物优选的为P3和P4；所述P3的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；所述P4的核苷酸序列如SEQID No.7所示。在本发明中所述PCR扩增的体系优选的如表2所示；所述PCR扩增的程序优选的为94℃变性1min，然后94℃变性40s，55℃复性30s，72℃延伸1min，30个循环后，72℃保温10min。

表2扩增获得折叠酶基因LifB的扩增体系

2*Prime STAR GC Buffer25μldNTP6μlPrimeSTAR酶0.5μlP11μlP21μlDNA模板<200ngddH₂O补足50μl

在本发明中，包括酸性脂肪酶基因LipC和折叠酶基因LifB的重组表达载体的制备方法包括以下步骤：s1)将所述折叠酶基因LifB与原始表达载体pETDUET-1连接获得重组表达载体PET-LifB；s2)将所述酸性脂肪酶基因LipC与重组表达载体PET-LifB连接获得包括酸性脂肪酶基因LipC和折叠酶基因LifB的重组表达载体pET-CB。

在本发明中，所述折叠酶基因LifB的制备方法参见上述步骤中折叠酶基因LifB的制备方法，在此不再赘述。在本发明中，所述原始表达载体pETDUET-1优选的采用商业化市售pETDUET-1载体即可；所述原始表达载体pETDUET-1优选的转入宿主菌中进行保藏；本发明对所述宿主菌没有特殊限定，采用本领域常规的大肠杆菌Top10、JM109和DH5α均可；在本发明具体实施过程中，优选的利用质粒提取试剂盒从所述大肠杆菌Top10提取获得所述原始表达载体pETDUET-1。在本发明中所述质粒提取试剂盒优选的为天根生化科技(北京)有限公司质粒提试剂盒，操作方法见所述试剂盒的使用说明书。

在本发明中，将所述原始载体pETDUET-1用限制性内切酶进行双酶切后连接。在本发明中所述限制性内切酶优选的为NdeI和Xho I；所述NdeI和Xho I优选的为Takara公司生产的快速内切酶。在本发明中；所述酶切后的载体pETDUET-1优选纯化后连接，所述纯化回收优选的使用核酸纯化回收试剂盒(OMEGA Gel Extraction Kit(200))。在本发明中所述双酶切的温度优选的为37℃；所述双酶切的时间优选的为0.8～1.2h；所述双酶切的体系优选的包括Nde Ⅰ 1μl，Xho I1μl，质粒DNA＜1μg，灭菌的双蒸水加至20μl。

本发明在所述双酶切后获得酶切后的载体pETDUET-1；本发明将所述折叠酶基因LipB和酶切后的载体pETDUET-1连接后获得重组表达载体pET-LipB。在本发明中，所述折叠酶基因LipB和酶切后的载体pETDUET-1的摩尔比优选的为1：(1.5～2.5)，更优选的为1:2。本发明中，所述连接优选的使用Takara宝日医生物技术(北京)有限公司的In-Fusion HDCloning Plus试剂盒，操作方法按其使用说明书。

本发明在获得所述重组表达载体pET-LipB后，优选的还包括对所述重组表达载体pET-LipB的验证步骤。在本发明中所述验证步骤包括将所述重组表达载体pET-LipB转化到大肠杆菌Top10感受态细胞中培养、提取质粒、酶切、测序。在本发明中，所述转化采用本领域常规的化学转化法；所述酶切与上述步骤中的酶切一致；所述测序优选的由上海英潍捷基贸易有限公司进行，将所述测序获得的测序结果与折叠酶基因LifB核苷酸序列进行比对，结果完全正确后确认将折叠酶基因LifB插入到pETDUET-1质粒的MCS2位点上，获得重组表发载体pET-LifB。

本发明在获得重组表发载体PET-LifB后，将所述酸性脂肪酶基因LipC与重组表达载体pET-LifB连接获得包括酸性脂肪酶基因LipC和折叠酶基因LifB的重组表达载体pET-CB。在本发明中，将所述重组表达载体PET-LifB用限制性内切酶进行双酶切后连接。在本发明中所述限制性内切酶优选的为EcoR I和Not I。在本发明中；所述酸性脂肪酶基因LipC和酶切后的载体pET-LifB优选纯化后连接，所述纯化回收优选的使用核酸纯化回收试剂盒(OMEGA Gel Extraction Kit(200))。在本发明中所述双酶切的温度优选的为37℃；所述双酶切的时间优选的为0.8～1.2h；所述双酶切的体系优选的包括EcoR I 1μl，Not I 3μl，质粒DNA＜1μg，灭菌的双蒸水加至20μl。

本发明在获得所述EcoR I和Not I的双酶切后的载体pET-LifB后；进行连接。在本发明中，所述酸性脂肪酶基因LipC和酶切后的载体pET-LifB的摩尔比优选的为1：(1.5～2.5)，更优选的为1:2。本发明中，所述连接优选的使用Takara宝日医生物技术(北京)有限公司的In-Fusion HD Cloning Plus试剂盒，操作方法按其使用说明书。

本发明在获得所述重组表达载体PET-BC后，优选的还包括对所述重组表达载体pET-BC的验证步骤。本发明中所述重组表达载体pET-BC的验证步骤与上述重组表达载体pET-LifB的验证步骤一致，在此不再赘述。本发明获得的重组表达载体pET-BC的图谱如附图1所示，LifB基因位于重组表达载体的MCS2位点上；所述酸性脂肪酶基因LipC插入到pET-LifB质粒的MCS1位点上。

本发明还提供了一株包括所述重组表达载体的重组菌株C-OB₅，所述重组菌株C-OB₅的保藏编号为GCMCC>5在2017年5月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。在本发明中所述重组菌株C-OB₅通过将所述重组表达载体pET-BC转化到大肠杆菌中获得。在本发明中，所述大肠杆菌优选的为大肠杆菌Origami>

本发明还提供了利用所述的重组表达菌株制备酸性脂肪酶的方法，包括以下步骤：1)活化培养重组菌株C-OB₅获得种子液；2)将所述种子液接种于自动诱导发酵培养基中依次进行高溶氧发酵和低溶氧发酵后，收集菌体细胞，破胞后获得酸性脂肪酶；所述高溶氧发酵的温度为29～31℃，搅拌转速为120～180rpm，通气量为480～520L/h；所述低溶氧发酵的温度为24～26℃，搅拌转速为220～280rpm，所述低溶氧发酵过程不通气。

在本发明中，活化培养重组菌株C-OB5获得种子液。在本发明中，所述活化培养优选的包括两代活化培养；具体的为将所述重组菌株C-OB₅接种至含氨苄1mg/ml的LB培养基中培养10～14h后，转接新的含氨苄1mg/ml的LB培养基培养4～8h获得种子液。在本发明中，所述活化培养的温度优选的为29～31℃，更优选的为30℃；所述活化培养的转速优选的为200～240rpm，更优选的为220rpm。

本发明在获得所述种子液后，将种子液接种于自动诱导发酵培养基中依次进行高溶氧发酵和低溶氧发酵后，收集菌体细胞，破胞后获得酸性脂肪酶。在本发明中所述自动诱导发酵培养基优选的包括以下浓度的组分：蛋白胨8～12g/L，酵母粉4～6g/L，甘油4.5～5.5g/L，葡萄糖0.4～0.6g/L，乳糖4.5～5.5g/L，Na₂HPO₄·12H₂O>46.5～7.0g/L，NH₄Cl>2SO₄0.65～0.75g/L，MgSO₄·7H₂O>2HPO₄·12H₂O>46.8g/L，NH₄Cl>2SO₄0.71g/L，MgSO₄·7H₂O>600优选的为1.5～2.0，更优选的为1.6～1.8。

在本发明中，所述种子液接种于自动诱导发酵培养基中首先进行高溶氧发酵，在本发明中所述高溶氧发酵的温度为29～31℃，优选的为30℃；所述高溶氧发酵的搅拌转速为120～180rpm，优选的为150rpm；所述高溶氧发酵的通气量为480～520L/h，优选的为500L/h；所述高溶氧发酵的时间优选的为4～8h，更优选的为6h；所述通气为通空气。

本发明在所述高溶氧发酵后进行低溶氧发酵；所述低溶氧发酵的温度为24～26℃，优选的为25℃；所述低溶氧发酵的搅拌转速为220～280rpm，优选的为250rpm；本发明中所述低溶氧发酵过程不通气；所述低溶氧发酵的时间优选的为32～40h，更优选的为36h。本发明中所述高溶氧发酵和低溶氧发酵的设备优选的为发酵罐，更优选的为30L发酵罐。

本发明在所述低溶氧发酵后，收集菌体细胞，破胞后获得酸性脂肪酶。在本发明中所述收集菌体的细胞的方法采用本领域常规的菌体细胞收集方法即可，无其他特殊要求。在本发明具体实施过程中，采用离心的方法收集菌体细胞。所述离心的转速优选的为6000～10000rpm，更优选的为8000rp；所述离心的时间优选的为8～12min；更优选的为10min。

本发明中所述破胞的方法采用本领域常规的细胞破裂方法即可，在本发明具体实施过程中采用超声处理进行破胞获得细胞裂解液；所述超声的功率优选的为350～450w，更优选的为400w；所述超声处理的总时间优选的为12～18min，更优选的为15min；所述超声处理的程序为间歇性超声；具体为超声2s；间歇4s。本发明在超声后，对所述细胞裂解液进行固液分离，收集液相组分获得酸性脂肪酶粗液。在本发明中所述固液分离优选的为离心，所述离心的转速优选的为，所述离心的时间优选的为12000～18000rpm，优选的为15000rpm；所述离心的时间优选的为8～12min，更优选的为10min。

本发明在获得所述酸性脂肪酶粗液后，优选的对其进行纯化和酶学性质鉴定。在本发明中所述纯化采用本领域常规的亲和层析；优选的采用镍离子亲和层析柱进行；所述镍离子亲和层析柱层析的步骤和参数采用本领域常规的步骤和参数即可，无其他特殊要求。本发明中所述酶学性质测定包括酶活力的测定、最适反应pH的测定和最适反应温度的测定。上述酶学性质的测定均采用本领域常规的酶学性质测定方法。

下面结合实施例对本发明提供的一种酸性脂肪酶基因LipC及其编码的酸性脂肪酶的制备方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1：重组表达载体pET-BC的构建

重组表达载体pET-LifB的构建

以唐菖蒲伯克霍尔德菌(Burkholderiagladioli)全基因序列为模板PCR扩增获得LifB折叠酶基因，PCR引物及反应条件如下：

引物：P3：atatacatatggcagatctcctggctggttccagcgcgcc P4：gtttctttaccagactcgagctacccgcccgcgccgagc

反应条件：94℃变性1min，然后94℃变性40s，55℃复性30s，72℃延伸1min，30个循环后，72℃保温5min。

表2折叠酶基因LifB的扩增体系

2*Prime STAR GC Buffer25μldNTP6μlPrimeSTAR酶0.5μlPrimer11μlPrimer21μlDNA模板<200ngddH₂OUp>

琼脂糖电泳结果显示，基因大小为1047bp。PCR产物按照胶回收试剂盒(OMEGA GelExtraction Kit(200))的方法进行回收，使用20μl无菌水洗脱，得到纯化的PCR产物。

质粒pETDUET-1的双酶切：挑取含有该质粒的大肠杆菌Top10单菌落，过夜培养。使用质粒提取试剂盒提取质粒，用Nde Ⅰ和Xho I按以下体系双酶切，酶切时间1h。酶体系为：Nde Ⅰ 1μl，Xho I1μl，质粒DNA＜1μg，灭菌的双蒸水加至20μl。酶切回收得到经过双酶切的pETDUET-1载体。

上述双酶切使用的限制性内切酶为Takara公司生产的快速内切酶，酶切后的纯化回收使用核酸纯化回收试剂盒(OMEGA Gel Extraction Kit(200))，质粒提取试剂盒为天根生化科技(北京)有限公司质粒小提试剂盒，操作方法按其使用说明书。

连接：将纯化后的LifB折叠酶基因与双酶切后的pETDUET-1载体按1：2的摩尔比例进行连接，连接使用Takara宝日医生物技术(北京)有限公司的In-Fusion HD CloningPlus试剂盒，操作方法按其使用说明书。

转化及筛选：取10μl连接产物与100μl大肠杆菌Top10感受态细胞中，冰浴30min，与42℃水浴锅热激90s，冰浴90s后加入600μl SOD培养基，37℃200rpm培养45min。将培养物涂布于含100μl/ml氨苄的LB平板，培养过夜后挑选单菌落。单菌落于5mlLB培养基中过夜培养后提取质粒，进行双酶切验证，酶切片段与基因大小相同的即为阳性克隆。

基因核酸序列测序：将获得的正确阳性克隆送至上海英潍捷基贸易有限公司进行测序，测序结果与折叠酶基因LifB核苷酸序列进行比对，结果完全正确后确认将折叠酶基因LifB插入到pETDUET-1质粒的MCS2位点上，获得新的重组质粒命名为pET-LifB，可用于下一步实验。

酸性脂肪酶基因LipC的制备：

引物：P1：caggatccgaattcggggccggccaccgtttccga

P2：gcattatgcggccgctcaatgctgcgtttccggcgccag

反应条件：94℃变性1min，然后94℃变性40s，60℃复性40s，72℃延伸80s，30个循环后，72℃保温10min。

表1酸性脂肪酶基因LipC扩增体系

5*Prime STAR Buffer10μldNTP4μlPrimeSTAR酶0.5μlPrimer11μlPrimer21μlDNA模板<200ngddH₂OUp>

琼脂糖电泳结果显示，基因大小为1314bp。

质粒pET-LifB的双酶切：挑取含有该质粒的大肠杆菌Top10单菌落，过夜培养。使用质粒提取试剂盒提取质粒，用EcoR I和Not I按以下体系双酶切，酶切时间1h。酶体系为：EcoR I 1μl，Not I 3μl，质粒DNA＜1μg，灭菌的双蒸水加至20μl。酶切回收得到经过双酶切的pET-LifB载体。

上述双酶切使用的限制性内切酶为Takara公司生产的快速内切酶，酶切后的纯化回收使用核酸纯化回收试剂盒(OMEGA Gel Extraction Kit(200))，质粒提取试剂盒为天根生化科技(北京)有限公司质粒小提试剂盒，操作方法按其使用说明书。

连接：将纯化后的LipC脂肪酶基因与双酶切后的pET-LifB载体按1：2的摩尔比例进行连接，连接使用Takara宝日医生物技术(北京)有限公司的In-Fusion HD CloningPlus试剂盒，操作方法按其使用说明书。

转化及筛选：取10μl连接产物与100μl大肠杆菌Top10感受态细胞中，冰浴30min，与42℃水浴锅热激90s，冰浴90s后加入600μl SOD培养基，37℃200rpm培养45min。将培养物涂布于含100μl/ml氨苄的LB平板，培养过夜后挑选单菌落。单菌落于5mlLB培养基中过夜培养后提取质粒，进行双酶切验证，酶切片段与基因大小相同的即为阳性克隆。

基因核酸序列测序：将获得的正确阳性克隆送至上海英潍捷基贸易有限公司进行测序，测序结果与脂肪酶基因LipC核苷酸序列进行比对，结果完全正确后确认将脂肪酶基因LipC插入到pET-LifB质粒的MCS1位点上，由此获得可共表达折叠酶及脂肪酶的重组质粒命名为pET-CB，可用于下一步实验质粒构建图谱如图1所示。

实施例2重组菌株C-OB₅的构建

酸性脂肪酶在大肠杆菌Origami 2(DE3)中的高效表达

转化:用化学转化法将实施例1中的重组表达载体pET-CB转化至大肠杆菌Origami2(DE3)中，具体方法为:在100μl大肠杆菌E.coli Origami 2(DE3)感受态细胞中加入2μl重组质粒pET-BC混合均匀；冰浴30min，与42℃水浴锅热激90s，冰浴90s后加入600μl SOD液体培养基，37℃200rpm培养45min。将培养物涂布于含100μl/ml氨苄的LB平板，培养过夜后挑选单菌落。

蛋白诱导表达:含有pET-BC的大肠杆菌Origami 2(DE3)在自动诱导培养基中28℃250rpm诱导培养24h。取100ml菌液8000rpm，4℃离心10min，收集菌体，用含有10％甘油的15ml(50mM，pH7.4)PBS缓冲液重悬菌体，超声400w，超2s，停4s，破胞15min，15000rpm高速离心10min，收集上清为酸性脂肪酶粗液。

自动诱导培养基配方为：蛋白胨1％、酵母膏0.5％、NaCl0.5％、甘油0.5％、葡萄糖0.05％、乳糖0.4％(w/v)。

实施例3酸性脂肪酶的纯化及酶学性质研究

脂肪酶纯化：用镍离子亲和层析柱(GE公司的Ni Sepharose 6Fast Flow)纯化实施例2中获得的酸性脂肪酶粗液，纯化的蛋白大小约为45KD(如图2所示)，符合理论预期。具体实施方案如下：使用10mM咪唑洗脱10个柱体积，30～50mM咪唑洗脱20个柱体积，最后使用250mM咪唑洗脱10个柱体积，收集中间5ml。用脱盐柱(GE公司的SephadexG25)进行脱盐，具体操作方法参照GE公司的操作手册进行。

脂肪酶活力测定方法为：

A液：用异丙醇配制16.5mmol/L的pNPP(对硝基苯棕榈酸酯)溶液。

B液：含有2％(w/v)TritonX-100及0.1％(w/v)阿拉伯胶的0.05mol/L柠檬酸-Na₂HPO₄缓冲液(pH值为3.0)。

测定时将A液与B液以1:9(体积比)比例混合，取50μL适量稀释的粗酶液加入450μL上述AB混合液中，于37℃反应10min，立即加入500μL10％(w/v)的三氯乙酸终止反应，测定前加入1mL 0.5M的Na₂CO₃调整pH值达到碱性。

酶活单位(U)定义：每分钟分解pNPP产生1μmol对硝基苯酚所需的酶量定义为一个酶活单位。

酶学性质研究

最适反应pH的检测

以不同pH值的缓冲液溶解底物对硝基苯棕榈酸酯，测定脂肪酶活力，pH3.0条件下的脂肪酶活力为对照(100％)，不同pH体系下的脂肪酶活力如图3所示，该酶的最适pH值为3.0。

最适反应温度的检测

以pH3.0的缓冲液溶解底物对硝基苯棕榈酸酯，在不同温度条件下测定脂肪酶活力，结果显示最适反应温度为55℃，如图3所示，该酶的最适反应温度为55℃。

实施例4利用所述的重组表达菌株制备酸性脂肪酶的方法

发酵所用培养基配方如下：

LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 5g/L，1mg/ml氨苄。

自动诱导发酵培养基配方为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，甘油5g/L，葡萄糖0.5g/L(单独灭菌)，乳糖5g/L(单独灭菌)，Na₂HPO₄·12H₂O>46.8g/L，NH₄Cl>2SO₄0.71g/L，MgSO₄·7H₂O>

发酵步骤如下：

(1)将上述步骤所得的重组菌C-OB5经活化后，接种至于50ml LB培养液(含氨苄)，30℃220r/m培养过夜，再按0.8％的接种量转接于250ml LB培养液(含氨苄)，30℃220r/m培养6h左右，制得发酵种子液。

(2)于30L发酵罐中，发酵培养基灭菌后按无菌操作方法加入单独灭菌成分，以0.13％接种量接种发酵种子液；发酵前期6h，保持30℃，搅拌150r/m，通气500L/h，发酵过程设定pH不调节，发酵6h后，降温至25℃，转速调至250r/m。保持低温低溶氧的状态，直至发酵结束。发酵42h后收集菌体破胞测得酸性脂肪酶活力为336.7U/ml，蛋白表达量为1.54mg/ml。

由上述实施例可知，本发明提供的酸性脂肪酶基因LipC编码的酸性脂肪酶的最适pH范围为3，最适温度范围为55℃，耐热性和耐酸性好，应用范围广。本发明提供的酸性脂肪酶的制备方法制备获得的酸性脂肪酶的表达量高，酶活力高；所述酸性脂肪酶的蛋白表达量为1.54mg/ml，酶活力达到336.7U/ml。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 广西科学院

<120> 一种酸性脂肪酶基因LipC及其编码的酸性脂肪酶的制备方法

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1314

<212> DNA

<213> Burkholderia gladioli

<400> 1

atgtcatcca aactctccct ggccgccgcc gcggccgtgt cctgcctgct gggcctggcc 60

gcgtcgccgg ccagcgccgg gccggccacc gtttccgatc cgttctacac ctataccggc 120

aacacgcccc tggcatcgat tccggccggc acggtgctca agacgcgcga gctcacctat 180

cacgtggccg gcatcccgac cgcgctgaag gccgagcaat tgctgtatcg caccaacaac 240

gcgcagaacc agccggtggt caacgtcacc tcggtgatcc gcagccaggt cagcaacggc 300

cacgccatct cctaccagtc ggcctacgac tcgctgaacc catacgacga accctcgcag 360

gtgatcgccg gcgatcgcga catcaccaag ttcgtcaatc tcggcaccct gatctacagc 420

gccgaatcga tcccgctctc ggcgctgctg ctcggctaca acgtgatcgt gcccgatacg 480

caaggccaga ccgccgactt cgcggccggc cccgaatacg gcatgaccac gctcgactcg 540

atccgcgcgg cgctcaatac ctcgtccacg ggcctcacgc ccgcgagcaa ggtggcgatg 600

atcggttatt ccggcggcgc gatcgccacc aactgggccg cgcaactggc gccgagctac 660

gcgcccgacg tcaaccagca gctggtgggc gcggccgagg gcggcgtgct ggtcgacccc 720

gcccacaacc tcaagtacgt ggacggcagc atcgtctggg gcggcgtggc cgcggccgcg 780

ctggcggggc tctctagagg cttcggcttc gacctgacgc cttacctgag cgataccggc 840

gtggcggttt tcaaggacat ccagagccag tcgctcgcct acatcctgcc gaggtacacg 900

ggcctgcgct ggaagaccct gttcaagccg caatacgcga acgacatcaa cagcatcccg 960

gtgtacgtga cctacgccaa caaggtgaac gcggggctgg ccccctcgcc gaccatcccg 1020

atgtacatcg gccagggcac catcggcatc gtggacggca ccttcagcct gcaggtgggc 1080

gacggcgtga tgctggccca cgacgtgcgc gccctggcgc agaagttctg cgcgagcggc 1140

acgccggtgg tccatgtcga atatccgctc gaccatttcg gctcggtcgc gacctgggcc 1200

gccggcatgc tgccctggct ctacgatcgc ttcgccggca agcccgcgcc cagcacctgc 1260

gcgctgacgg ccctgctgcc gagcagctcg ctggcgccgg aaacgcagca ttga 1314

<210> 2

<211> 437

<212> PRT

<213> Burkholderia gladioli

<400> 2

Met Ser Ser Lys Leu Ser Leu Ala Ala Ala Ala Ala Val Ser Cys Leu

1 5 1015

Leu Gly Leu Ala Ala Ser Pro Ala Ser Ala Gly Pro Ala Thr Val Ser

202530

Asp Pro Phe Tyr Thr Tyr Thr Gly Asn Thr Pro Leu Ala Ser Ile Pro

354045

Ala Gly Thr Val Leu Lys Thr Arg Glu Leu Thr Tyr His Val Ala Gly

505560

Ile Pro Thr Ala Leu Lys Ala Glu Gln Leu Leu Tyr Arg Thr Asn Asn

65707580

Ala Gln Asn Gln Pro Val Val Asn Val Thr Ser Val Ile Arg Ser Gln

859095

Val Ser Asn Gly His Ala Ile Ser Tyr Gln Ser Ala Tyr Asp Ser Leu

100 105 110

Asn Pro Tyr Asp Glu Pro Ser Gln Val Ile Ala Gly Asp Arg Asp Ile

115 120 125

Thr Lys Phe Val Asn Leu Gly Thr Leu Ile Tyr Ser Ala Glu Ser Ile

130 135 140

Pro Leu Ser Ala Leu Leu Leu Gly Tyr Asn Val Ile Val Pro Asp Thr

145 150 155 160

Gln Gly Gln Thr Ala Asp Phe Ala Ala Gly Pro Glu Tyr Gly Met Thr

165 170 175

Thr Leu Asp Ser Ile Arg Ala Ala Leu Asn Thr Ser Ser Thr Gly Leu

180 185 190

Thr Pro Ala Ser Lys Val Ala Met Ile Gly Tyr Ser Gly Gly Ala Ile

195 200 205

Ala Thr Asn Trp Ala Ala Gln Leu Ala Pro Ser Tyr Ala Pro Asp Val

210 215 220

Asn Gln Gln Leu Val Gly Ala Ala Glu Gly Gly Val Leu Val Asp Pro

225 230 235 240

Ala His Asn Leu Lys Tyr Val Asp Gly Ser Ile Val Trp Gly Gly Val

245 250 255

Ala Ala Ala Ala Leu Ala Gly Leu Ser Arg Gly Phe Gly Phe Asp Leu

260 265 270

Thr Pro Tyr Leu Ser Asp Thr Gly Val Ala Val Phe Lys Asp Ile Gln

275 280 285

Ser Gln Ser Leu Ala Tyr Ile Leu Pro Arg Tyr Thr Gly Leu Arg Trp

290 295 300

Lys Thr Leu Phe Lys Pro Gln Tyr Ala Asn Asp Ile Asn Ser Ile Pro

305 310 315 320

Val Tyr Val Thr Tyr Ala Asn Lys Val Asn Ala Gly Leu Ala Pro Ser

325 330 335

Pro Thr Ile Pro Met Tyr Ile Gly Gln Gly Thr Ile Gly Ile Val Asp

340 345 350

Gly Thr Phe Ser Leu Gln Val Gly Asp Gly Val Met Leu Ala His Asp

355 360 365

Val Arg Ala Leu Ala Gln Lys Phe Cys Ala Ser Gly Thr Pro Val Val

370 375 380

His Val Glu Tyr Pro Leu Asp His Phe Gly Ser Val Ala Thr Trp Ala

385 390 395 400

Ala Gly Met Leu Pro Trp Leu Tyr Asp Arg Phe Ala Gly Lys Pro Ala

405 410 415

Pro Ser Thr Cys Ala Leu Thr Ala Leu Leu Pro Ser Ser Ser Leu Ala

420 425 430

Pro Glu Thr Gln His

435

<210> 3

<211> 1047

<212> DNA

<213> Burkholderia gladioli

<400> 3

atggtgcgat ccgatcgtcc ggtgcgcgcc gcgcgggccg ggcgcgtcgc gctgttcgcg 60

gcgagcggct tcgtcgcggc cggcgcgatc gcctggtggc tactgccgcc gggcggcgag 120

cctcgccacg acgcggccgc ggtcgttgcg tccgcaaccg tttcggcgag cgacgggcag 180

gtgcgggagg cggcgccgct ggccgccacg ctgccggcct cgctggctgg ttccagcgcg 240

ccgcgcctgc cgctcgatgc cggcggcagg ctggcgagga cgcgcgcggt gcgcgacttc 300

ctcgactact gcctgagcgc gcagcacgac ctcacgccgg ccgggctcga cgcgctggtg 360

cgtcgcgaga tcgccgcgca actggagggc agcccggcgc agcaggacgc gctcgatgcc 420

tggcaacgct atcgcgccta tttcgatgga atcgcgcggc tgccgggcgg cggctcggtg 480

ctcggcgaca agctcgatcc ggccgccatg cagctcgcgc tcgaacagcg cgcgacgctg 540

gccagccgca cgctcggcga atgggccgag cccttcttcg gcgaggagca gcgccgccag 600

cggctcgacc tggagcggat ccggatcgcg cgcgatcccg cgctcagcga cgagcagaag 660

gccgcgcgcc tggccgcgct cgatgcgcaa ctgacgccgg ccgagcgcgc gcagcaggcg 720

gcgatccgtg cccagcagga tgccgtgtcg aagatcgcgg ccatgcagca ggccggcgcg 780

acgccggagc agatgcgcac ccagctcgcg caggcgctcg ggcccgaggc agccgcgcgc 840

gccgccaagc tgcagcagga cgacgatgcc tggcaggggc gctaccaggc ctatgcggcc 900

gaacgcgatc ggattctcgc gcaggggctc tcgcccgacg atcgcgacgc gcgcatcgcg 960

cagttgcggc agcagacctt taccgagccc ggcgaggcga ttcgcgcggc ctcgctcgat 1020

cgcggcgcgc tcggcgcggg cgggtag 1047

<210> 4

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

caggatccga attcggggcc ggccaccgtt tccga 35

<210> 5

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gcattatgcg gccgctcaat gctgcgtttc cggcgccag 39

<210> 6

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atatacatat ggcagatctc ctggctggtt ccagcgcgcc 40

<210> 7

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gtttctttac cagactcgag ctacccgccc gcgccgagc 39