蛋白激发子Hrip1在诱导农作物抗蚜中的应用

摘要

本发明公开了蛋白激发子Hrip1在诱导农作物抗蚜中的应用，其中，农作物为小麦，蚜虫是麦长管蚜。其应用包括以下步骤：采用蛋白激发子Hrip1对小麦种子进行浸种，蛋白激发子Hrip1的用量为30～90ug/ml，浸种的环境为黑暗环境。60ug/ml的Hrip1浸种处理小麦能够在一定程度上增加蚜虫的死亡率，较对照组平均增加10％左右。在盆栽实验中，浸种+喷雾处理，能够显著抑制蚜虫的种群数量，喷雾前抑制水平为36.43％，喷雾后7天内抑制水平均大于50％。

说明书

技术领域

本发明涉及蛋白质激发子技术领域，特别是涉及一种蛋白质激发子的应用。

背景技术

在自然界复杂的环境中，植物经常受到病原菌，植食性昆虫和动物的侵害，因此在长期的自然进化过程中，植物逐渐形成了一系列抵御入侵者侵袭的防卫机制。这些防御机制包括植物本身的物理和化学屏障以及一系列诱导性的防卫反应。在诱导植物防御反应的研究中，激发子作为诱导子可以激发植物防御反应，引起植物生理生化和分子方面的变化，如细胞壁合成前体的生成，抗毒素物质的积累，防御相关酶活性提高和防御基因的表达等(Zhao,J.,L.C.Davis,R.Verpoorte(2005).诱导植物次级代谢产物产生的激发子信号转导.生物技术进展23(4):283-333；Scheel,D.and J.E.Parker(1990).植物防御基因激活途径的激发子识别和信号转导.生物学45(6):569-575；Vlot,A.C.,D.F.Klessig,S.W.Park(2008).系统获得性抗性：信号不明.当代植物学观点11(4):436-442.)，从而提高植物抗性。喷洒外源茉莉酸，可以显著增强马铃薯对马铃薯蚜虫的抗性(Cohen,Y.,U.Gisi,T.Niderman(1993).茉莉酸及茉莉酸甲酯诱导马铃薯和番茄对致病疫霉产生抗性.病理学83(10):1054-1062)，降低麦长管蚜的种群数量(Bruce,T.J.,J.L.Martin,J.A.Pickett,B.J.Pye,L.E.Smart,L.J.Wadhams(2003).顺-茉莉酮诱导抗性.有害生物管理科学59:1031-1036)，也可以诱导植物相邻未处理叶片的PI的基因表达(Farmer,E.E.,C.A.Ryan(1992).茉莉酸前提激活损伤诱导蛋白酶抑制子合成.植物细胞4(2):129-134.)。外源蔗糖或果糖处理，可以降低玉米螟的叶片产卵量，也可降低苹果蠹蛾在苹果叶片上的着落率(S.Derridj,I.A.,N.Lombakia,EFerre,H.Galy,J.Lambion,J.Auger(2011).可溶性糖诱导植物产生抗性.AFPP–第四届会议国际作物保护会议.法国：里尔)。甜菜夜蛾幼虫的唾液提取物诱导玉米幼苗产生挥发性物质吸引寄生蜂和天敌，以减少甜菜夜蛾幼虫的危害(Alborn,H.,T.Turlings,T.Jones,G.Stenhagen,J.Loughrin,J.Tumlinson(1997).甜菜夜蛾幼虫唾液分泌物诱导植物产生挥发性物质.科学276(5314):945-949.)。麦长管蚜唾液处理小麦叶片后，会显著降低麦长管蚜的产卵量(Zhang,Y.,J.Fan,F.Francis,J.Chen(2017).麦长管蚜唾液分泌物激发小麦抗虫性.农业与食品化学65(40):8798.)。

Hrip1是发明人从极细链格孢菌(Alternaria tenuissima)中分离到的一种蛋白激发子,前期研究证明,Hrip1蛋白渗入烟草叶片后能够引发烟草叶片的钙离子流入、介质碱化、激活水杨酸途径的蛋白激酶并且提高植物体内相关防卫基因的表达(Kulye,M.,H.Liu,Y.Zhang,H.Zeng,X.Yang,D.Qiu(2012).Hrip1，一种来自腐生真菌Alternariatenuissima的蛋白质激发子，诱导烟草细胞死亡，表达防御相关基因，激活系统获得性抗性.植物细胞与环境35(12):2104–2120.)。具有提高植物抗病和抗旱的功能(Peng,X.C.,D.W.Qiu,H.M.Zeng,L.H.Guo,X.F.Yang,Z.Liu(2015).一种来自Alternaria tenuissima的激发子增加拟南芥的抗逆性.转基因研究24(1):135)。

发明内容

中国发明专利ZL201110149203.3(提高植物抗性和诱导植物防御反应的蛋白质及其基因、应用)和ZL201310097741.1(蛋白激发子Hrip1在提高和改善植物的耐盐和抗旱能力中的作用)的说明书和权利要求书的全文内容引用至此。

在上述专利申请中，发明人公开了一种能够提高植物抗性及诱导植物防御反应的来自于极细链格孢菌(Alternaria tenuissima)JH505菌株的蛋白质及编码该蛋白质的核苷酸序列，其中的蛋白质是一种蛋白质激发子，命名为Hrip1(过敏反应诱导蛋白1，Hypersensitive response inducing protein 1)(其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示)；其编码基因为Hrip1基因(其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示)。

本发明的目的是提供一种蛋白激发子Hrip1在诱导农作物抗蚜中的应用。其技术方案具体如下：

蛋白激发子Hrip1在诱导农作物抗蚜中的应用，其中，所述农作物为小麦。

本发明所述的蛋白激发子Hrip1在诱导农作物抗蚜中的应用，其中，所述蚜虫是麦长管蚜。

本发明所述的蛋白激发子Hrip1在诱导农作物抗蚜中的应用，其中，包括以下步骤：采用蛋白激发子Hrip1水溶液对小麦种子进行浸种。

本发明所述的蛋白激发子Hrip1在诱导农作物抗蚜中的应用，其中，所述蛋白激发子Hrip1的用量为30～90ug/ml；优选为60ug/ml。

本发明所述的蛋白激发子Hrip1在诱导农作物抗蚜中的应用，其中，所述浸种的环境为黑暗环境。

本发明上述的蛋白激发子Hrip1在诱导农作物抗蚜中的应用，其中，采用蛋白激发子Hrip1对小麦进行喷雾处理。

本发明所述的蛋白激发子Hrip1在诱导农作物抗蚜中的应用，其中，所述喷雾中蛋白激发子Hrip1的用量为30～90ug/ml；优选为60ug/ml。

本发明所述的蛋白激发子Hrip1在诱导农作物抗蚜中的应用，其中，在寄主选择性试验中，包括以下步骤：

以30～90ug/ml的蛋白激发子Hrip1对小麦种子黑暗浸种24小时；然后播种；10天后，对小麦进行蛋白激发子Hrip1喷雾处理，用量为30～90ug/ml；

1天后，分别取处理组和对照组小麦各一盆，置于60cm*60cm*60cm防虫网箱中，相距12cm，中间放置一张12cm*4cm的硬纸板；取30头麦长管蚜成蚜，置于纸板中央；

24小时后分别记录处理组和对照组小麦上的蚜虫数量。

同现有技术相比，本发明的突出效果在于：

(1)本发明使用蛋白质激发子Hrip1对小麦进行浸种及喷雾处理，诱导小麦产生抗蚜能力，并揭示了小麦对蛋白激发子Hrip1的免疫应答反应。

(2)60ug/ml的Hrip1浸种处理小麦能够在一定程度上增加蚜虫的死亡率，较对照组平均增加10％左右。在盆栽实验中，浸种+喷雾处理，能够显著抑制蚜虫的种群数量，喷雾前抑制水平为36.43％，喷雾后7天内抑制水平均大于50％。以上结果说明Hrip1能够显著增强小麦的抗蚜能力。

(3)激发子诱导的植物对植食性昆虫的防御方式包括植物本身的物理和化学屏障以及一系列诱导性的防卫反应。研究表明，木质素含量较高的植物对蚜虫的抗性更高(Hu,Q.,J.Zhao,J.Cui(1993).大豆次级代谢产物木质素与抗蚜能力的关系.植物保护19(1):8-9；李刘杰，汪强，韩燕来和谭金芳(2009).钾水平对小麦酚类物质、木质素代谢和接种蚜虫群体动态的影响.中国农学通报2009,25(17):143-148；季春梅,曹辰兴,雷关红,王涛,陈玉茶(2011).黄瓜诱导抗蚜性与次生代谢相关酶活性的关系.山东农业科学10:32-35)。另外，植物体内的糖含量越高，蚜虫的代谢压力越大，对蚜虫的生存越不利。在辣椒、棉花及小麦上都有相关研究表明抗蚜品种具有更高含量的可溶性糖(谢永寿,杨奇华,谢以铨,谢晓帆(1987).冬小麦品种中糖及氨基酸含量与抗麦长管蚜的关系.植物保护学报(1)；刘旭明,杨奇华(1993)."棉花抗蚜的生理生化机制及其与棉蚜种群数量消长关系的研究."植物保护学报20(1):25-29；陈青(2002)."几种生化物质与辣椒抗蚜性的相关性."园艺学报29(6):533-536)。在本研究中，Hrip1处理的小麦叶片内可溶性糖含量增加，从而对蚜虫有抗性。综上，Hrip1诱导小麦木质素和可溶性糖积累，从而使小麦表现出对麦长管蚜的抗性。

下面结合附图说明和具体实施例对本发明所述的蛋白激发子Hrip1在诱导农作物抗蚜中的应用作进一步说明。

附图说明

图1为麦长管蚜寄主选择性试验的实验示意图；

图2为Hrip1对蚜虫寿命的影响；

图3为麦长管蚜寄主选择性试验结果；

图4为Hrip1处理前后，小麦叶片木质素含量变化；

图5为Hrip1处理前后，小麦叶片可溶性糖含量变化。

具体实施方式

蛋白激发子Hrip1在诱导农作物抗蚜中的应用，其中，农作物为小麦，品种为中麦175。蚜虫是麦长管蚜(Sitobion avenae)。

1实验

1.1微生物激发子Hrip1对蚜虫寿命的影响

经过前期实验的筛选，以60ug/ml(约2umol/L)的Hrip1水溶液对小麦种子黑暗浸种24小时，随后水培至第三天，苗长约2-4cm，用湿润的脱脂棉包裹麦苗根部，转移至试管中(长16cm，直径1.5cm)，接入麦长管蚜成蚜(记为0天)，管口塞入脱脂棉。24小时后，移除成蚜，保留若蚜。随后每四天换一次麦苗，并统计蚜虫死亡数，直至所有蚜虫死亡为止。每处理40株苗，实验重复3次。实验全过程在人工培养箱中进行，温度23±1℃，光周期为16h：8h(L：D)，RH为60％，下同。

1.2微生物激发子Hrip1对麦长管蚜种群数量的影响

以60ug/ml的Hrip1对小麦种子(中麦175)黑暗浸种24小时，播种(每盆6颗种子，花盆直径12cm)。每处理4盆重复，以水为对照。小麦2叶期(播种后6-7天)时接种麦长管蚜，每盆10头。10天后，对不同处理的小麦分别进行蛋白喷雾(60ug/ml)。于喷雾前及喷雾后1天、3天、5天、7天统计蚜虫数量，并计算蛋白质激发子Hrip1对麦长管蚜的防治效果。实验重复3次。

1.3麦长管蚜寄主选择性试验

以60ug/ml的Hrip1对小麦种子(中麦175)黑暗浸种24小时，播种(每盆10颗种子)，10天后，对小麦进行Hrip1喷雾处理(60ug/ml)。以喷自来水为对照。1天后，分别取处理组和对照组小麦各一盆，置于60cm*60cm*60cm防虫网箱中，相距12cm，中间放置一张12cm*4cm的硬纸板。取30头麦长管蚜成蚜，置于纸板中央(如图1所示)。24小时后分别记录处理组和对照组小麦上的蚜虫数量。每处理设4个重复，实验进行3次。

1.4微生物激发子Hrip1处理小麦叶片后木质素含量的变化

以60ug/ml的Hrip1对小麦种子黑暗浸种24小时，播种(每盆10颗种子)，10天后进行Hrip1喷雾处理(60ug/ml)。以水为对照。24小时后，采集小麦叶片约5g，80℃烘干24小时，随后采用TGA法对木质素的含量进行测定(Brinkmann,K.,L.Blaschke,A.Polle(2002).近红外反射光谱校准和脂蛋白应用的基础：不同木质素检测方法的比较.化学生态学28(12):2483-2501.)。每处理设3个重复，实验进行3次。以碱性木质素为标准物质，配置0.0025，0.005，0.01，0.02，0.03，0.04，0.05mg/ml的系列浓度溶液，制作标准曲线。

1.5Hrip1对小麦叶片可溶性糖含量的影响

以60ug/ml的Hrip1对小麦种子黑暗浸种24小时，播种(每盆10颗种子)，10天后进行Hrip1喷雾处理(60ug/ml)，以水处理作为对照。1天后，采集小麦叶片约0.5g，使用苯酚-硫酸法对可溶性糖含量进行测定(Dubois,M.,K.A.Gilles,J.K.Hamilton,P.A.Rebers,F.Smith(1956).比色法测糖含量.分析化学28(3):350-356.)。每处理设5个重复，实验进行2次。以蔗糖为标准物质，配置0.01，0.02，0.03，0.04，0.05mg/ml的系列浓度溶液，制作标准曲线。

1.6数据统计分析

采用Excel及SPSS(Version 18.0)软件对数据进行统计分析。

2结果与分析

2.1麦长管蚜取食Hrip1处理的小麦后死亡率提高

用Hrip1对小麦种子进行浸种处理，小麦苗期的抗蚜能力有一定程度的增强。从图2中可以看出，60ug/ml Hrip1处理组的麦长管蚜从第12天至第28天，其死亡率较对照组高约10％左右。说明，小麦经过Hrip1蛋白液浸种后，苗期的抗蚜能力有一定程度的提高。

蚜虫死亡率(％)＝蚜虫死亡数/总接种蚜虫数*100％

2.2麦长管蚜取食Hrip1处理的小麦后种群数量下降

小麦经过Hrip1浸种及喷雾处理后，麦长管蚜取食幼苗期后种群数量受到明显抑制。如表1所示，喷雾前，Hrip1处理组对蚜虫种群数量的抑制率为36.4％，说明在盆栽条件下，Hrip1浸种能够提高小麦苗期的抗蚜能力。在Hrip1喷雾后一星期内，处理组麦长管蚜的种群数量抑制率均在50％以上。说明喷雾能够在浸种的基础上显著提高小麦的抗蚜能力。

种群数量抑制水平(％)＝(对照组蚜虫数量-处理组蚜虫数量)/对照组蚜虫数量*100％

表1微生物激发子Hrip1对麦长管蚜种群数量的抑制作用(％)

注：daa＝Hrip1施用后天数，下同。

2.3Hrip1处理的小麦对麦长管蚜有明显趋避作用

从麦长管蚜选择性试验结果看，麦长管蚜成蚜偏好取食对照组小麦，说明Hrip1处理的小麦有明显的趋避蚜虫作用。对照组蚜虫平均数量为16.9头，处理组蚜虫平均数量为8.8头。

2.4Hrip1处理增加小麦叶片木质素含量

小麦叶片木质素含量测定结果显示，Hrip1处理过的小麦叶片木质素含量明显高于对照(P<0.05)。对照组平均含量为2.29mg/g*DW，处理组平均含量为2.60mg/g*DW(DW：dryweight，干重)。

木质素浓度(ug/ml)＝24.797*A₂₈₀-0.004

木质素含量(mg/g*DW)＝1000*(24.797*A₂₈₀-0.004)*稀释倍数*体积*ml/(叶片干重*g)

2.5Hrip1处理增加小麦叶片可溶性糖含量

Hrip1处理后，小麦叶片中可溶性糖含量增加(P<0.05)。对照组可溶性糖含量为7.62mg/g*FW，处理组可溶性糖含量为8.81mg/g*FW(FW：fresh weight，鲜重)。

蔗糖浓度(mg/ml)＝10.477*A₄₉₀-0.046

蔗糖含量(mg/g*FW)＝(10.477*A₄₉₀-0.046)*稀释倍数*体积*ml/(叶片鲜重*g)

3结论

用60ug/ml的Hrip1蛋白液浸种及喷雾处理，小麦苗期对麦长管蚜的抗性明显增强，蚜虫死亡率增加10％；蚜虫种群数量降低50％以上；选择性试验证明蚜虫趋向取食对照组小麦，Hrip1蛋白处理的小麦对蚜虫有明显的趋避作用，说明蛋白激发子Hrip1明显提高小麦的抗蚜能力。

在实验1.2中，Hrip1水溶液浓度还可以为30～90ug/ml(表2)。最终实验结果表明，60ug/ml的效果最佳。

表2微生物激发子Hrip1对麦长管蚜种群数量的抑制作用(％)

以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110>中国农业科学研究院植物保护研究所

<120>蛋白激发子Hrip1在诱导农作物抗蚜中的应用

<160>2

<170>SIPOSequenceListing 1.0

<210>1

<211>164

<212>PRT

<213>过敏反应诱导蛋白1(Hypersensitive response inducing protein 1)

<400>1

Met Thr Pro Ser Ala Ile Leu Pro Val Val Pro Ala Ala Ala Ala Val

1 5 1015

Ala Ala Pro Thr Thr Met Ala Gly Ala Gly Gly Gly Gly Cys Val Pro

202530

Thr Ser Thr Thr Ile Ser Ala Thr Leu Leu Val Thr Ser Pro Thr Ser

354045

Gly Ser Val Ala Pro Thr Pro Leu Ser Val Pro Pro Thr Gly Ser Thr

505560

Ile Ala Ala Pro Val Gly Ala Gly Ala His Cys Ser Gly Ser Gly Thr

65707580

Ser Val Pro Ala Ser Ala Gly Cys Gly Val Ala Ala Ala Ala Leu Leu

859095

Pro Ala Leu Ala Gly Pro Gly Ala Gly Ala Thr Thr Gly Ile Thr His

100 105 110

Ser Thr Thr Cys Ser Gly Ala Gly Thr Leu Ser Gly Ala Ala Ile Leu

115 120 125

Val Ala Ser Leu Gly Cys His Ala Gly Gly Ala Leu Ala Val Cys Thr

130 135 140

Gly Gly Pro Gly Thr Pro Ala Pro Gly Ala Val Ala Leu Val Cys Ala

145 150 155 160

Leu Pro Gly Cys

<210>2

<211>878

<212>DNA

<213>Hrip1

<400>2

gaaaatctca atcaagtaat ttccaacttc ccaacttaac ctgatattat ctttccagtg60

cgaccaacag tcaccacact tcctagcctc atcgacacga agttccactt ttgtctacaa 120

ccaacatcac aaaatcaaga tgtacttctc gaatatactc ccggtagtgt tcgccgctgc 180

tgccgtggcc gctcctacta ctatgaacgg ccgtggcgag gaaggctgcg ttcccacctc 240

ctacaccatc tcagactaca agctagtcac ttctccgacc tctggaagcg ttgattttac 300

gttcaagtct gtcttcccca ccggcagcac catcgacgac ccagtccagg ccggcgctca 360

ctgcagtggc tctggaacct ctgtacccaa cagcaacgag tgtcaggtcg ctaaccgtcg 420

tcttctattc gaccttcgtg gacctcaaga tgaagcctac taccagatca cccattcctg 480

gacctgctca ggcaaccagt ggctatccgg caatgcgatc aaagtcgact cgcttgagtg 540

tcacaacgag ggcgacaagc gcgtctgcac tggtggaccc cagaccttcg cgcctcagaa 600

cgtgcgcaag gtctgtaact tgcctcagtg ctgatggctt cggtcagctc cttgttgtcc 660

caaagttgaa ccgtaggtcc atctcctgga taggcggtgt atcagcggtg tgaagggtgt 720

aaatcgactt tggatcttcg tgggcataat ttggtgttat catgattctg gttttctctc 780

tgaacttcct ttctcttctc aatcaaggtg aacatgtgca tagcatcaaa tgtagaaaat 840

gaaatataac acacattcaa cttcttcaaa aaaaaaaa 878