真菌蛋白激发子Hrip1诱导水稻抗病性及互作蛋白的鉴定

摘要

真菌蛋白激发子Hrip1是从极链格孢菌(Alternaria alternata)中分离得到的一种超敏反应诱导蛋白，分子量为17.6KD。Hrip1诱导烟草细胞坏死、介质碱化、钙离子流动和ROS积累等一系列防御反应，并且提高烟草对TMV的系统抗性。为了进一步研究Hrip1蛋白在水稻上的功能，明确Hrip1诱导水稻产生防御反应的机制。本研究在毕赤酵母细胞中表达蛋白激发子Hrip1，并研究Hrip1诱导水稻抗稻瘟病的作用;通过酵母双杂交技术筛选Hrip1在水稻中的互作蛋白，同时利用GST pull down进一步证明了二者的相互作用;为了研究互作蛋白的功能，利用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术得到了互作蛋白基因敲除的水稻突变株。获得了以下研究成果:
　　1、成功进行了Hrip1的真核细胞表达
　　成功构建了毕赤酵母重组表达载体pPICZαA-Hrip1，转化毕赤酵母，通过Zeoc in浓度梯度筛选获得了正确的酵母转化子。通过甲醇诱导表达和亲和层析纯化得到了纯化的重组蛋白。Westernblot检测证明了表达该蛋白为Hrip1。重组蛋白Hrip1具有天然Hrip1蛋白的活性，可以引起草叶片过敏性坏死反应，最低作用浓度为10μM。
　　2、Hrip1诱导水稻的抗病性反应
　　用浓度为30μM的Hrip1处理水稻，48小时后喷雾接种稻瘟菌孢子悬浮液，结果表明Hrip1能够明显提高水稻对稻瘟菌的抗性，水稻细胞内源水杨酸含量升高，并在48小时达到最高值;防御反应相关酶PAL、POD、CAT活性也显著提高。这些结果表明，Hrip1可以诱导水稻的防御反应，可能通过水杨酸途径激活了水稻对稻瘟菌的抗性。
　　3、筛选获得了Hrip1水稻互作蛋白
　　为了探究Hrip1诱导水稻产生抗病性的机制，通过酵母双杂交实验，成功在水稻cDNA文库中筛选到一个Hrip1互作蛋白，命名为Hrip1-BP。Hrip1-BP在拟南芥中的同源蛋白为CSN5，是一个类泛素蛋白，在植物与病原物的互作中发挥重要作用。
　　4、体外验证了Hrip1与水稻中互作蛋白的特异性
　　根据水稻库中Hrip1-BP的序列信息，设计特异引物，得到了Hrip1-BP的全长表达序列。通过构建pGEX-6p-2-Hrip1-BP重组载体，转化大肠杆菌表达菌株BL21，成功得到了可溶性Hrip1-BP重组蛋白。用GST pull down技术验证了Hrip1-BP能够与Hrip1相互作用。
　　5、获得了敲除互作蛋白基因水稻突变体
　　为了进一步阐明Hrip1-BP在Hrip1诱导水稻免疫反应中的作用，采用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术，对水稻中Hrip1-BP进行敲除。通过对目的基因的第一外显子区域的两处位点进行了定向编辑，最终得到了47株突变株，基因型包括双等位突变、纯合突变和杂合突变。

目录

声明

摘要

第一章 引言

1．1 激发子概述

1．1．1 过敏蛋白

1．1．2 几丁质

1．1．3 鞭毛蛋白

1．2 植物的免疫系统

1．3 激发子受体的研究现状

1．3．1 细菌鞭毛蛋白受体FLS2

1．3．2 细菌转录延伸因子受体EFR

1．3．3 其它受体

1．4 研究蛋白互作方法

1．4．1 体内蛋白互作

1．4．2 体外蛋白互作

1．5 Hrip1研究背景

1．6 研究目的及意义

第二章 Hrip1的真核表达与纯化

2．1 实验材料

2．1．1 植物、菌株和质粒

2．1．2 试剂和仪器

2．2 实验方法

2．2．1 Hrip1真核表达载体的构建

2．2．2 毕赤酵母感受态的制备、转化

2．2．3 Hrip1的真核表达

2．2．6 Hrip1的Western-blotting鉴定

2．3．1 Hrip1真核表达载体的构建

2．3．2 重组蛋白的表达和纯化

2．3．3 重组蛋白的鉴定

2．3．4 重组蛋白的生物活性检测

2．4 小结与讨论

第三章 Hrip1诱导水稻抗病性

3．1．1 植物和菌株

3．1．2 实验试剂和仪器

3．2 实验方法

3．2．1 稻瘟菌孢子制作

3．2．3 Hrip1处理后水稻水杨酸含量测定

3．2．4 Hrip1处理后水稻防御酶活性测定

3．3 实验结果

3．3．1 Hrip1诱导水稻抗病性

3．3．2 水杨酸含量的测定

3．3．3 防御相关酶活性的测定

3．4 小结与分析

第四章 Hrip1水稻互作蛋白的筛选

4．1 实验材料

4．1．1 菌株和质粒

4．1．2 实验试剂和耗材

4．1．3 培养基与试剂配方

4．2 实验方法

4．2．1 诱饵载体的构建

4．2．2 诱饵载体转化酵母细胞

4．2．3 诱饵载体自激活鉴定

4．2．3 水稻文库筛选

4．2．4 阳性克隆的确定

4．3 实验结果

4．3．1 诱饵载体pDBleu-Hrip的构建

4．3．2 诱饵载体的自激活检测

4．3．3 水稻cDNA文库的筛选

4．4 小结与分析

第五章 互作蛋白的基因克隆、原核表达和体外互作验证

5．1 实验材料

5．1．1 菌株、质粒和植物

5．1．2 实验试剂和仪器

5．2 实验方法

5．2．1 互作蛋白的基因克隆

5．2．2 互作蛋白原核表达载体的构建

5．2．3 互作蛋白的原核表达

5．2．4 GST pull-down实验

5．3 实验结果

5．3．1 互作蛋白基因的克隆

5．3．2 互作蛋白原棱表达载体的构建

5．3．3 互作蛋白的原桉表达与纯化

5．3．4 GST pull-down体外验证蛋白互作

5．4 小结与分析

第六章 互作蛋白水稻突变体植株的获得

6．1 实验材料

6．1．1 植物、菌株和载体

6．1．2 试剂和仪器

6．1．3 培养基与试剂配制

6．2 实验方法

6．2．1 靶位点的选择

6．2．2 CRISPR／Cas9载体的构建

6．2．3 水稻的遗传转化

6．2．4 转基因植株的检测

6．3 实验结果

6．3．1 靶位点的设计

6．3．2 CRISPR／Cas9重组载体的构建

6．3．3 水稻的遗传转化和鉴定

6．3．4 转基因水稻的基因编辑分析

6．4 小结与讨论

第七章 全文结论

参考文献

致谢

作者简历