调控金针菇子实体发育的转录因子PDD1及其编码基因与应用

摘要

本发明公开了一种调控金针菇子实体发育的转录因子PDD1及其编码基因与应用。本发明的转录因子PDD1的编码基因序列如序列表中序列1所示；该转录因子的氨基酸序列如序列表中序列2所示。本发明通过在金针菇中进行pdd1的过表达和RNAi实验发现，pdd1是金针菇菌丝生长和子实体发育过程中必需的正调控因子，影响着金针菇原基期和成熟期，子实体数量、高度及湿重。本发明还公开了一株具有出菇周期短、产量高的金针菇突变菌株(pdd1OE#31)，不仅具有提前进入成熟期的特性，还能够提高金针菇的产量，缩短金针菇的生产周期，减少能耗和人工成本，具有巨大的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一个正向调控金针菇(Flammulinavelutipes)菌丝生长和子实体发育的转录因子PDD1，以及一株具有出菇周期短、产量高的pdd1过表达突变菌株(pdd1^OE#31)。

背景技术

金针菇(Flammulinavelutipes)又名冬菇、朴菇、毛柄金钱菇等，是典型的担子类食用菌，在全世界尤其是亚洲国家广泛栽培。金针菇含有丰富的蛋白质、膳食纤维和糖类，此外还含有丰富的维生素B1、B2、B3和维生素C、D、E。金针菇作为一种传统的食用菌，不仅具有丰富的营养价值，而且具有重要的药用价值。近年来的研究表明，金针菇具有抗肿瘤、延长寿命、降低胆固醇、抗疲劳、免疫调节等功效。这些营养和药用价值都是以子实体为实现载体，子实体的产量和质量直接决定了营养和药用的价值。

近年来随着金针菇大面积种植，陆续有许多关于金针菇增产技术和方法的研究，主要包括营养条件的优化和遗传育种。营养条件的优化包括改良栽培方式、优化栽培料配方和添加促增产物质。比如采用窄袋栽培、红光诱导出菇、卧式两头出菇等栽培方式促进子实体生长，或者选用更合适的碳源、氮源，用稻壳代替玉米芯促进菌丝生长，或者通过外源添加三十烷醇、特效植物营养素(SPNE)、黄豆面等物质刺激子实体产生等方式。但是，这些方法侧重对外部环境进行改变以适应菌株生长，增产能力有限，而且需要考虑成本。而遗传育种是针对菌株自身做出改变去适应环境的变化，目前应用于金针菇遗传育种的方式主要包括自然选育、诱变育种、杂交育种和基因工程育种，比如经过自然选育和诱变得到出菇周期短的“三明一号”、抗霉能力强的“西师8001”和高产的“辐金一号”等优良性状菌株，以及经过不同亲本交配得到的早熟金针菇“农金六号”、抗病金针菇A45等。以上三种育种方法在分子生物学发展初期较为常用，虽然能选育出性状优良的菌株，但是筛选较为盲目，而且耗费人工和时间。另外一种是基因工程育种，目标明确，周期较短，但是此方法需要基于对调控子实体发育基因的深入理解。随着分子生物学在金针菇中的应用，逐渐有一些关于金针菇子实体发育基因的报道。如fvh1在金针菇子实体发育时期高表达，疏水蛋白编码基因Fv-hyd1过表达后使原基形成提前，组氨酸激酶基因和GATA Zinc finger转录因子参与冷诱导原基形成过程，Mads8、N1477、HK535基因在原基和菌丝中有差异表达，敲低腺苷脱氨酶编码基因Fv-ada会抑制金针菇菌丝生长，苯丙氨酸氨裂解酶编码基因Fvpal的表达与金针菇子实体形成相关，金针菇交配型基因的分析，漆酶编码基因参与金针菇子实体的形成，过表达Fv-JRL1促进金针菇菌丝生长和子实体发育，但是这些研究局限于对基因结构或者基因功能的研究，对其基因在金针菇中的应用还有待开展。

发明内容

本发明要解决的技术问题是如何调控金针菇菌丝生长和子实体发育，培育出产量高、出菇周期短的金针菇。

为了解决上述技术问题，本发明首先提供了一种可调控金针菇菌丝生长和子实体发育的蛋白质。本发明提供的可调控金针菇菌丝生长和子实体发育的蛋白质的名称为PDD1，所述PDD1蛋白质是如下a)或b)或c)或d)的蛋白质：

a)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；

b)在序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；

c)将序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；

d)与序列2所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质。

为了使a)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列2所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1、标签的序列

标签残基序列Poly-Arg5-6(通常为5个)RRRRRPoly-His2-10(通常为6个)HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tag II8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDL

上述c)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述c)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述c)中的蛋白质的编码基因可通过将序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

上述d)中，“同源性”包括与本发明的序列2所示的氨基酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同源性的氨基酸序列。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了与PDD1蛋白质相关的生物材料。

本发明提供的与PDD1蛋白质相关的生物材料为下述A1)至A8)中的任一种：

A1)编码PDD1蛋白质的核酸分子；

A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；

A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；

A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；

A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；

A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；

A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；

A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物。

上述生物材料中，A1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：

1)其编码序列是序列1所示的cDNA分子或基因组DNA分子；

2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码PDD1蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码PDD1蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码PDD1蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有编码PDD1蛋白质的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码PDD1蛋白质且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述生物材料中，A2)所述的含有编码PDD1蛋白质的核酸分子的表达盒是指能够在宿主细胞中表达pdd1的DNA，该DNA不但可包括启动pdd1转录的启动子，还可包括终止pdd1转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。在本发明的具体实施例中，所述启动子具体为gpd启动子片段，所述终止子具体为trpC终止子片段。可用现有的表达载体构建含有所述pdd1基因表达盒的重组载体。

上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。

上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了上述PDD1蛋白质或上述相关生物材料的新用途。

本发明提供了上述PDD1蛋白质或上述相关生物材料在如下(b1)-(b6)中任一种应用：

(b1)调控金针菇菌丝生长；

(b2)调控金针菇子实体发育；

(b3)提高金针菇生物量和/或产量；

(b4)缩短金针菇的出菇周期；

(b5)培育产量高、出菇周期短的转基因金针菇；

(b6)金针菇育种。

上述应用中，所述调控为促进；所述提高金针菇生物量和/或产量体现在如下(c1)-(c3)中任一种：

(c1)增加金针菇子实体数量；

(c2)增加金针菇子实体高度；

(c3)增加金针菇子实体湿重；

所述缩短金针菇的出菇周期体现在促使金针菇的原基期和/或成熟期提前。

本发明在金针菇野生型中分别构建了pdd1过表达突变菌株(pdd1^OE)和pdd1敲低表达突变菌株(pdd1^RNAi)。对金针菇野生型、pdd1过表达突变菌株和pdd1敲低表达突变菌株进行菌丝生长实验，分析表型，发现pdd1敲低表达突变菌株在合成培养基和栽培料上菌丝生长都慢于野生型。而pdd1过表达突变菌株在栽培料上菌丝生长快于野生型，缩短了菌丝生长周期。说明pdd1对金针菇菌丝生长有积极的调控作用。

本发明同时对金针菇野生型、pdd1过表达突变菌株和pdd1敲低表达突变菌株进行出菇实验，并在不同的时间段进行观察和拍照。对所有菌株的出菇表型进行分析，发现野生型菌株在刺激出菇处理后第7天产生原基(金针菇的最初级子实体)，而pdd1过表达突变菌株比野生型提前1天产生更大面积的原基。继续进行出菇培养，发现pdd1过表达突变菌株比野生型提前4天进入成熟收获期，而在pdd1敲低表达突变菌株中，当pdd1被小幅度敲低后，在与野生型相同出菇时间内无原基产生，延长出菇时间能产生极少量原基；但是当pdd1被大幅度敲低后，即便延长出菇时间也不能产生原基。说明pdd1的表达量显著影响了金针菇原基的产生以及子实体的发育，pdd1是金针菇子实体发育过程中必需的正调控因子。

为了解决上述技术问题，本发明最后提供了一种培育产量高、出菇周期短的转基因金针菇的方法。

本发明提供的培育产量高、出菇周期短的转基因金针菇的方法包括提高受体金针菇中PDD1蛋白质的表达量和/或活性，得到转基因金针菇的步骤；所述转基因金针菇的产量高于所述受体金针菇和/或所述转基因金针菇的出菇周期短于所述受体金针菇。

上述方法中，所述转基因金针菇的产量高于所述受体金针菇体现在如下(d1)-(d3)中任一种：(d1)转基因金针菇的子实体数量多于所述受体金针菇；(d2)转基因金针菇的子实体高度高于所述受体金针菇；(d3)转基因金针菇的子实体湿重大于所述受体金针菇；所述转基因金针菇的出菇周期短于所述受体金针菇体现在转基因金针菇的原基期和/或成熟期早于所述受体金针菇。

具体地，本发明提供的产量高、出菇周期短的转基因金针菇相比于受体金针菇，提前1天产生原基并提前4天进入成熟期，子实体数量增加19.85±4.64％，子实体高度增加40.36±7.25％，总湿重增加62.47±8.88％，不仅原基期和成熟期均提前，且总生物量显著增加。

上述方法中，所述提高受体金针菇中PDD1蛋白质的表达量和/或活性的方法为在受体金针菇中过表达PDD1蛋白质。

上述方法中，所述过表达的方法为将PDD1蛋白质的编码基因导入受体金针菇。

上述方法中，所述PDD1蛋白质的编码基因的核苷酸序列是序列1所示的DNA分子。

在本发明的具体实施例中，所述PDD1蛋白质的编码基因通过含有pdd1基因表达盒的重组表达载体导入所述受体植物中。所述重组表达载体为将gpd启动子片段(Pgpd-OE)、pdd1OE片段和终止子片段(TtrpC-OE)用重组试剂盒在XmnI酶切位点与质粒pBHg-BCA1融合后得到的大小为11261bp的载体。

上述方法中，所述受体金针菇可为金针菇菌株FL19(黄色品种)。

本发明首次在金针菇中发现转录因子PDD1及其编码基因pdd1，并发现pdd1是金针菇菌丝生长和子实体发育过程中必需的正调控因子，影响着金针菇的原基期和成熟期，子实体数量、高度及湿重。本发明还提供了一株具有出菇周期短、产量高的金针菇突变菌株(pdd1^OE#31)，不仅具有提前进入原基期和成熟期的特性，还能够提高金针菇的产量，缩短金针菇的生产周期，减少能耗和人工成本，在金针菇优良菌种的选育中具有巨大的应用前景。

附图说明

图1是HMG-box结构蛋白编码基因在金针菇子实体发育不同时期的转录水平图。

图2是转录因子PDD1的结构图。

图3是pdd1在野生型、pdd1过表达突变菌株和pdd1敲低表达突变菌株中转录水平分析结果图。

图4是野生型、pdd1过表达突变菌株和pdd1敲低表达突变菌株在CYM平板上的菌丝生长结果图。

图5是野生型、pdd1过表达突变菌株和pdd1敲低表达突变菌株在栽培料上的菌丝生长结果图。

图6是野生型、pdd1过表达突变菌株和pdd1敲低表达突变菌株在栽培料上的出菇结果图。

图7是野生型、pdd1过表达突变菌株和pdd1敲低表达突变菌株出菇的生物量统计结果图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

下述实施例中涉及的培养基和溶液的配方如下：

LB培养基：1％胰蛋白胨，0.5％酵母浸膏，1％NaCl，加适量蒸馏水溶解，pH7.0，定容，高压蒸汽灭菌。

CYM培养基：1％麦芽糖，2％葡萄糖，0.2％胰蛋白胨，0.2％酵母提取物，加适量蒸馏水溶解，自然pH定容，高压蒸汽灭菌。

出菇栽培料培养基：30％木屑，43.5％棉籽壳，25％麸皮，1％轻质碳酸钙，0.5％石灰，60％水，加水后充分混匀并浸润4-5个小时后，分装到容积为350mL的组培瓶中，每瓶装325g栽培料，高压蒸气灭菌3个小时。

农杆菌转化诱导培养基(IM)：2.05g K₂HPO₄，0.15g>4·7H₂O，0.067g>2·2H₂O，0.0025g>4·7H₂O，0.5g(NH₄)₂SO₄，1.8g葡萄糖，5mL甘油，8.53g2-(N-Morpholino)ethanesulfonic>

2×CTAB buffer：2％CTAB，100mM Tris-HCl(pH8.0)，20mM EDTA(pH8.0)，1.4MNaCl，1％PVP(polyvinyl pyrrolidone)。

Soil DNA extraction buffer(SDEB)：100mM NaCl，50mM EDTA，0.25M Tris-HCl，5％SDS。

下述实施例中的质粒pBHg-BCA1来源于福建农林大学菌物研究中心，记载于文献“Lu,Y.P.,et al.,A Jacalin-Related Lectin Regulated the Formation of AerialMycelium and Fruiting Body in Flammulina velutipes.Int J Mol Sci,2016.17(12).”中。

下述实施例中的质粒pCSN44来源于美国真菌遗传资源中心(Fungal GeneticsStock Center)，记载于文献“Chen,X.,et al.,De-repression of CSP-1activatesadaptive responses to antifungal azoles.Sci Rep,2016.6:p.19447.”中。

下述实施例中的金针菇野生型均为金针菇菌株FL19(黄色)，来源于福建农林大学菌物研究中心。

实施例1、pdd1基因和转录因子PDD1的获得及其序列分析

一、pdd1基因的核苷酸序列和转录因子PDD1的氨基酸序列

在金针菇基因组中找到8个同时具有核定位序列和HMG-box结构蛋白的编码基因，用RNA-seq和定量PCR分析这8个基因在子实体发育不同阶段的转录水平，发现其中一个基因从原基时期开始到伸长期、成熟期逐步上调表达(图1)，可能在金针菇子实体发育中发挥重要功能，并将该基因命名为pdd1(primordium development defect1)，其核苷酸序列为序列1。pdd1基因编码转录因子PDD1，转录因子PDD1的氨基酸序列为序列2。

二、序列分析

将pdd1基因上游和下游序列各延伸2000bp作为参考序列，用Zillions of OligosMapped(ZOOM)软件将转录组的reads定位到参考序列上，分析得出pdd1基因从起始密码子到终止密码子全长为1204bp，包含1个49bp的内含子。

用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)和软件DNAMAN对转录因子PDD1的氨基酸序列进行分析。结果显示：转录因子PDD1为一个具有HMG-box结构域和核定位序列的蛋白(图2)，分子量为42472.68Da，等电点为5.64。

实施例2、pdd1过表达突变菌株和pdd1敲低表达突变菌株的构建

一、pdd1过表达载体的构建

(1)用引物Pgpd-F和Pgpd-OE-R以金针菇野生型菌株的基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到金针菇gpd启动子片段(Pgpd-OE)，该gpd启动子包含gpd基因第一个内含子和外显子，靶序列大小为920bp。引物序列如下：

Pgpd-F:5’-CAGATCCCCCGAATTATTCGAGCTCGGTACAGTCGTG-3’；

Pgpd-OE-R:5’-AGAAAGAGTGGACCTGTAAAATGGTGAGCAAGAC-3’。

PCR反应程序为：98℃ 30s；98℃ 10s，55℃ 90s，72℃ 60s(25cycles)；72℃10min；4℃。

(2)用引物pdd1-F和pdd1-R以金针菇野生型菌株的基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到pdd1OE片段，靶序列大小为1203bp，引物序列如下：

pdd1-F:5’-TTTACAGGTCCACTCTTTCTCAGCCTACTACGACCA-3’；

pdd1-R:5’-AAGTGGATCCTCAAAATGCAAGGCCACTACCT-3’。

PCR反应程序为：98℃ 30s；98℃ 10s，59℃ 90s，72℃ 60s(25cycles)；72℃10min；4℃。

(3)用引物TtrpC-OE-F和TtrpC-R以质粒pCSN44为模板进行PCR扩增，得到trpC终止子片段(TtrpC-OE)，靶序列大小为720bp。引物序列如下：

TtrpC-OE-F:5’-TGCATTTTGAGGATCCACTTAACGTTACTGAAATCA-3’；

TtrpC-R:5’-AATTAACGCCGAATTCATGCCTGCAGGTCGAGAAAG-3’。

PCR反应程序为：98℃ 30s；98℃ 10s，58℃ 90s，72℃ 60s(25cycles)；72℃10min；4℃。

(4)用普通质粒小提试剂盒提取pBHg-BCA1质粒，并用限制性内切酶XmnI酶切消化该质粒，同时用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收酶切产物，得到酶切回收后的pBHg-BCA1。

(5)用片段重组试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司，货号：C113-01)将Pgpd-OE、pdd1OE和TtrpC-OE片段连入酶切回收后的pBHg-BCA1(按照试剂盒说明书进行操作)，转化大肠杆菌DH5α感受态，然后挑单菌落，用验证引物Pgpd-detect-F和TtrpC-detect-R对单菌落进行菌落PCR验证，靶序列大小为1558bp，得到pdd1过表达载体pBHg-BCA1-pdd1OE。引物序列如下：

Pgpd-detect-F:5’-AACCGCCATCTTCCACACTT-3’；

TtrpC-detect-R:5’-AACACCATTTGTCTCAACTCCG-3’。

PCR反应程序为：94℃ 5min s；94℃ 30s，58℃ 90s，72℃ 90s(25cycles)；72℃10min；4℃。

pdd1过表达载体pBHg-BCA1-pdd1OE为将gpd启动子片段(Pgpd-OE)、pdd1OE片段和终止子片段(TtrpC-OE)用片段重组试剂盒在XmnI酶切位点与质粒pBHg-BCA1融合后得到的大小为11936bp的载体。

二、pdd1敲低表达载体的构建

本发明利用发夹结构的RNAi技术构建pdd1敲低表达载体。具体步骤如下：

(1)用引物Pgpd-F和Pgpd-RNAi-R以金针菇野生型菌株的基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到金针菇gpd启动子片段(Pgpd-RNAi)，靶序列大小为920bp。引物序列如下：

Pgpd-F:5’-CAGATCCCCCGAATTATTCGAGCTCGGTACAGTCGTG-3’；

Pgpd-RNAi-R:5’-CCCGACTTGGAACATGACCTGTAAAATGGTGAGCAAGAC-3’。

PCR反应程序为：98℃ 30s；98℃ 10s，55℃ 90s，72℃ 60s(25cycles)；72℃10min；4℃。

(2)用引物pdd1-antisense-F和pdd1-antisense-R以野生型金针菇基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到pdd1-antisense片段，靶序列大小为489bp。引物序列如下：

pdd1-antisense-F:5’-CATTTTACAGGTCATGGGCCCATGTTCCAAGTCGGGTTTAAAGGC-3’；

pdd1-antisense-R:5’-GAGGACTTACCGTCAAGAAAGAACCCACCGTTG-3’。

PCR反应程序为：98℃ 30s；98℃ 10s，65℃ 90s，72℃ 60s(25cycles)；72℃10min；4℃。

(3)用引物TtrpC-RNAi-F和TtrpC-R以质粒pCSN44为模板进行PCR扩增，得到trpC终止子片段(TtrpC-RNAi)，靶序列大小为720bp。引物序列如下：

TtrpC-RNAi-F:5’-CCCGACTTGGAACATGGATCCACTTAACGTTACTGAAATCA-3’；

TtrpC-R:5’-AATTAACGCCGAATTCATGCCTGCAGGTCGAGAAAG-3’。

PCR反应程序为：98℃ 30s；98℃ 10s，58℃ 90s，72℃ 60s(25cycles)；72℃10min；4℃。

(4)用普通质粒小提试剂盒提取pBHg-BCA1质粒，并用限制性内切酶XmnI酶切消化该质粒，同时用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收酶切产物，得到酶切回收后的pBHg-BCA1。

(5)用片段重组试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司，货号：C113-01)将Pgpd-RNAi、pdd1-antisense和TtrpC-RNAi片段连入酶切回收后的pBHg-BCA1(按照试剂盒说明书进行操作)，转化大肠杆菌DH5α感受态，然后挑单菌落，用验证引物Pgpd-detect-F和TtrpC-detect-R对单菌落进行菌落PCR验证，靶序列大小为684bp，得到质粒pBHg-BCA1-pdd1-antisens。引物序列如下：

Pgpd-detect-F:5’-AACCGCCATCTTCCACACTT-3’；

TtrpC-detect-R:5’-AACACCATTTGTCTCAACTCCG-3’。

PCR反应程序为：94℃ 5min；94℃ 30s，58℃ 90s，72℃ 60s(25cycles)；72℃10min；4℃。

(6)用引物pdd1-sense-F和pdd1-sense-R以金针菇野生型菌株的基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到pdd1-sense片段，靶序列大小为540bp。引物序列如下：

pdd1-sense-F:5’-CATTTTACAGGTCATGGGCCCATGTTCCAAGTCGGGTTTAAAGGC-3’；

pdd1-sense-R:5’-GAGGACTTACCGTCAAGAAAGAACCCACCGTTG-3’。

PCR反应程序为：98℃ 30s；98℃ 10s，65℃ 90s，72℃ 60s(25cycles)；72℃10min；4℃。

(7)用限制性内切酶BamHI同时对质粒pBHg-BCA1-pdd1-antisens和片段pdd1-sense片段进行酶切并回收后，用T4Ligase对这两个片段连接过夜。

(8)将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态，然后挑单菌落，用验证引物Pgpd-detect-F和TtrpC-detect-R对单菌落进行菌落PCR验证，靶序列大小为1224bp，得到pdd1敲低表达载体pBHg-BCA1-pdd1RNAi。引物序列如下：

Pgpd-detect-F:5’-AACCGCCATCTTCCACACTT-3’；

TtrpC-detect-R:5’-AACACCATTTGTCTCAACTCCG-3’。

PCR反应程序为：94℃ 5min；94℃ 30s，58℃ 90s，72℃ 90s(25cycles)；72℃10min；4℃。

pdd1敲低表达载体pBHg-BCA1-pdd1RNAi为将gpd启动子片段(Pgpd-RNAi)、pdd1-antisense片段、pdd1-sense片段和trpC终止子片段(TtrpC-RNAi)用片段重组试剂盒在XmnI酶切位点与质粒pBHg-BCA1融合后得到的大小为11761bp的载体。

三、质粒pBHg-BCA1-pdd1OE和pBHg-BCA1-pdd1RNAi转化农杆菌

分别将步骤一和步骤二制备的质粒pBHg-BCA1-pdd1OE和pBHg-BCA1-pdd1RNAi转化AGL-1菌株感受态细胞(北京博迈德基因技术有限公司，货号：BC302-01)中。具体步骤如下：

(1)取两管50μL AGL-1感受态细胞，分别加入1μg质粒pBHg-BCA1-pdd1OE和质粒pBHg-BCA1-pdd1RNAi，用移液枪轻轻的吹吸混匀，冰上放置10min。

(2)将离心管放于液氮种速冻5min。

(3)立即置于37℃静置水浴中5min，不要晃动水面。

(4)将离心管放回冰上，保持5min。

(5)加入1mL LB液体培养基，28℃静置培养2-3h。

(6)吸取菌液涂布于含有50μg/mL卡那霉素和50μg/mL利福平的LB的平板上，28℃先正面放置1h，再倒置培养48-72h。待单菌落长出后挑取单菌落，用验证引物Pgpd-detect-F和TtrpC-detect-R对单菌落进行菌落PCR验证，靶序列大小分别为1558bp(pBHg-BCA1-pdd1OE)和1224bp(pBHg-BCA1-pdd1RNAi)，分别得到最终带有质粒的农杆菌菌株AGL1-pdd1OE和AGL1-pdd1RNAi。引物序列如下：

Pgpd-detect-F:5’-AACCGCCATCTTCCACACTT-3’；

TtrpC-detect-R:5’-AACACCATTTGTCTCAACTCCG-3’。

PCR反应程序为：94℃ 5min；94℃ 30s，58℃ 90s，72℃ 60s(25cycles)；72℃10min；4℃。

四、农杆菌转化金针菇野生型菌株

将步骤三制备的农杆菌菌株AGL1-pdd1OE和AGL1-pdd1RNAi转化金针菇野生型菌株(金针菇菌株FL19)。具体步骤如下：

(1)准备金针菇野生型菌株菌块：提前两天用打孔器将长满金针菇菌丝的CYM培养基打成小圆块(d＝5mm)，于CYM液体培养基中静置培养48h。

(2)将含有目的片段质粒的农杆菌(AGL1-pdd1OE和AGL1-pdd1RNAi)分别转接到含利福平及卡那霉素的LB液体培养基中，28℃震荡培养12-16h(150rpm)。

(3)待农杆菌菌液的OD600达0.5-0.8时，转入灭菌的50mL离心管，封口膜封口后，4500rpm，4℃离心12min，收集菌体。

(4)用IM培养基洗涤农杆菌2次。然后加入5mL的IM培养基(重悬农杆菌菌体)，28℃，150rpm，避光培养4-6小时至OD600为0.3-0.5，以诱导其转化能力。

(5)将步骤(1)中准备好的菌块加入到诱导后的农杆菌中，液体静置培养3-6h后，将菌块转到覆有玻璃纸的IM培养基上，25℃共培养3-6天。

(6)共培养完成后，用无菌水清洗菌块以清除农杆菌，转到含有12.5μg/mL潮霉素B和200μM头孢噻肟钠的CYM筛选平板上，25℃静置培养3-4周待转化子长出。

五、金针菇转化子的筛选

1、样品准备

(1)将从CYM筛选平板上挑出来的单菌落继续转接到含有12.5μg/mL潮霉素B和200μM头孢噻肟钠的CYM筛选平板，筛选5代。

(2)将筛选完5代依然生长良好的菌株转接到不含有潮霉素B的覆有玻璃纸的CYM平板上，长满菌丝后收取菌丝，一部分用于DNA提取，另一部分用于RNA提取。同时以金针菇野生型菌株作为对照。

2、菌株DNA提取及验证

(1)收集金针菇野生型菌丝，迅速扔进液氮保存。

(2)液氮研磨菌丝体，加入400μL提取缓冲液(SDEB)和400μL 2×CTAB缓冲液，涡旋混匀。

(3)加入800μL酚/氯仿(1:1)溶液，充分混匀，12000rpm离心10min。

(4)吸取上清液并转入新的1.5mL离心管中，加入500μL氯仿，充分混匀，12000rpm，离心10min。

(5)吸取适量上清液并转入新的1.5mL离心管中，加入0.6倍体积的异丙醇，混匀，4℃放置10～20min，12000rpm离心10min，弃上清。

(6)75％的乙醇清洗沉淀两次，12000rpm离心10min，弃上清。

(7)短暂离心，将多余的酒精吸出，晾干。

(8)加入适量DNA溶解液(DNA溶解液配制：1mL 10mM Tris-HCl(pH8.0)中加入10μLRNaseA)溶解DNA。

(9)37℃水浴2h，-20℃保存。

(10)分别以金针菇野生型、pdd1过表达突变菌株和pdd1敲低表达突变菌株的DNA为模板，进行PCR扩增验证，用验证引物Pgpd-detect-F和TtrpC-detect-R对单菌落进行菌落PCR验证，靶序列分别为无条带(金针菇野生型)、大小为1558bp(pdd1过表达突变菌株)和大小为1224bp(pdd1敲低表达突变菌株)，同时分别以相应质粒作为阳性对照。引物序列如下：

Pgpd-detect-F:5’-AACCGCCATCTTCCACACTT-3’；

TtrpC-detect-R:5’-AACACCATTTGTCTCAACTCCG-3’。

PCR反应程序为：94℃ 5min；94℃ 30s，58℃ 90s，72℃ 60s(25cycles)；72℃10min；4℃。

3、菌株RNA提取及定量PCR验证转录水平

对上述步骤2中所得到的阳性突变体提取RNA，同时进行定量PCR实验，具体操作如下：

(1)将收集的菌样置于1.5mL离心管并迅速投入液氮中冻存。

(2)液氮研磨菌丝体，加入0.7mL Trizol，混匀，室温放置5min。4℃，12000rpm离心10min，吸取上清于1.5mL Axygen离心管中。

(3)加入0.7mL氯仿，涡旋振荡器上轻微振荡15s，室温放置5min。4℃，12000rpm离心15min。

(4)吸取适量上清，加入0.6倍体积预冷的异丙醇，混匀，室温放置10min。4℃，12000rpm离心10min，弃上清。

(5)75％的冰冷乙醇清洗两次，晾干酒精。

(6)用100μL RNA-free水溶解RNA。

(7)紫外分光光度计检测RNA，记录RNA样品的OD260、OD280及Ratio值。然后根据公式：RNA样品的浓度＝OD260值×40×RNA样品的稀释倍数，计算RNA的浓度。

(8)普通凝胶电泳检测RNA的完整性：1％浓度的琼脂糖凝胶，2μg RNA样品上样量，电压为180V，电泳15min，EB染色后紫外下观察RNA条带。

(9)用cDNA合成试剂盒分别将所有RNA样品反转成cDNA，用于定量PCR。

(10)以上述cDNA样品为模板，用定量PCR引物Q-pdd1-F和Q-pdd1-R对pdd1进行定量扩增，采用2^-ΔΔCt的计算方法对实验数据进行处理。同时以actin为模板作为内参基因，引物为Q-actin-F和Q-actin-R。引物序列如下：

Q-pdd1-F:5’-TCAGCAATGCGTCTGACACG-3’；

Q-pdd1-R:5’-CGTTCATGTTCCAAGTCGGGT-3’；

Q-actin-F:5’-CACCATGTTCCCTGGTATTG-3’；

Q-actin-R:5’-CACCAATCCAGACAGAGTATTT-3’。

定量PCR反应程序为：95℃预变性60s；95℃变性15s、58℃退火15s、72℃延伸45s，40个循环；溶解曲线分析：65℃～95℃，每0.05s增加0.5℃并检测。

(11)对所得的定量PCR数据进行分析，选取相对比野生型，pdd1上调表达的菌株作为pdd1过表达突变菌株，pdd1下调表达的菌株作为pdd1敲低表达突变菌株。共得到pdd1过表达突变菌株3株，分别为：pdd1^OE#7、pdd1^OE#31和pdd1^OE#38，pdd1敲低表达突变菌株3株，分别为：pdd1^RNAi#64、pdd1^RNAi#148和pdd1^RNAi#170，数据结果如图3。以上菌株作为实验菌株。

实施例3、pdd1在调控金针菇菌丝生长中的应用

一、对pdd1突变菌株进行平板菌丝生长观察实验

(1)将金针菇野生型、pdd1过表达突变菌株(pdd1^OE#7、pdd1^OE#31和pdd1^OE#38)和pdd1敲低表达突变菌株(pdd1^RNAi#64、pdd1^RNAi#148和pdd1^RNAi#170)分别用打孔器做成大小一致的菌块(d＝5mm)，并分别接种到不含药物的CYM平板上，25℃培养7天之后拍照。

(2)在培养的过程中，每隔24小时测量菌丝生长长度，并做记录，计算各个菌株平均生长速率。

对不同菌株生长情况和生长速率分析结果如下：在CYM平板上，pdd1过表达突变菌株菌丝的生长与野生型相似，没有明显差别，而pdd1敲低表达突变菌株菌丝生长变弱变慢，说明pdd1低表达影响金针菇菌丝生长(图4)。

二、对pdd1突变菌株进行栽培料菌丝生长观察实验

将金针菇野生型、pdd1过表达突变菌株(pdd1^OE#7、pdd1^OE#31和pdd1^OE#38)和pdd1敲低表达突变菌株(pdd1^RNAi#64、pdd1^RNAi#148和pdd1^RNAi#170)分别用打孔器做成大小一致的菌块(d＝5mm)，并分别接种到装有325g栽培料的组培瓶中，25℃培养至有菌丝长满瓶底拍照。

由图5可见，pdd1过表达突变菌株(12天)比野生型(15天)先长满栽培料，而pdd1敲低表达突变菌株(22天)最晚长满栽培料。在栽培料上，菌丝生长速率：pdd1过表达突变菌株>野生型>pdd1敲低表达突变菌株。说明pdd1高表达促进菌丝生长，pdd1低表达抑制菌丝生长，pdd1的高表达使得菌株更适应栽培料的营养环境，pdd1可以作为分子选育优良菌株提供参考。

实施例4、pdd1在调控金针菇子实体发育中的应用

一、对pdd1突变菌株进行出菇观察实验

(1)将金针菇野生型、pdd1过表达突变菌株(pdd1^OE#7、pdd1^OE#31和pdd1^OE#38)和pdd1敲低表达突变菌株(pdd1^RNAi#64、pdd1^RNAi#148和pdd1^RNAi#170)分别用打孔器做成大小一致的菌块(d＝5mm)，并分别接种到装有325g栽培料的组培瓶中，在25℃，70％湿度，黑暗条件下培养15-20天，直到所有菌株菌丝长满栽培瓶。

(2)分别对每个栽培瓶进行搔菌，即用灭菌处理的手术刀轻轻刮去栽培瓶顶部的厚菌丝，继续在25℃，70％湿度，黑暗条件下培养至栽培瓶顶部长满新的菌丝，得到覆菌后的栽培瓶。

(3)将覆菌后的栽培瓶在15℃，95％湿度，黑暗条件下培养，进行冷刺激，培养5-7天会有原基(金针菇最初始的子实体)长出。定期观察并拍照。

对出菇结果分析如下：在刺激出菇后的第6天，pdd1过表达突变菌株有原基产生，而野生型菌株在刺激出菇处理后第7天产生原基，此时，pdd1过表达突变菌株有更多更密集的原基产生。继续进行出菇培养至收获期，发现pdd1过表达突变菌株比野生型提前4天进入成熟收获期，而且菌株更高大(图6)。与此同时，pdd1敲低表达突变菌株中仍不见原基，当继续延长出菇时间后，pdd1被小幅度敲低的菌株(pdd1^RNAi#148和pdd1^RNAi#170)中有极个别原基的产生，而pdd1被大幅度敲低菌株(pdd1^RNAi#64)中仍不见原基(图6)。以上结果说明pdd1的表达量显著影响着金针菇原基的形成以及子实体的发育，pdd1是金针菇子实体发育过程中必需的正调控因子。

二、对金针菇野生型和pdd1过表达突变菌株进行生物量测定实验

因为pdd1敲低的菌株不产生或者只产生极少数生长矮小瘦弱的子实体，不具有统计学意义，因此本发明对生物量的测定只限于野生型和pdd1过表达突变菌株。为了更有效的进行统计，本发明只对长度>6cm的子实体进行统计学分析。

分析结果表明：pdd1过表达突变菌株普遍比野生型生物量有所增加，其中菌株pdd1^OE#31生物量增加最为显著，子实体数量增加19.85±4.64％，子实体高度增加40.36±7.25％，总湿重增加62.47±8.88％(图7)，是一株良好的增产菌株，结合提前进入成熟期的特性，在生产应用中可以缩短生产周期，减少能耗和人工成本，是一株很好的低能耗高产量的生产菌株。

序列表

<110>中国科学院微生物研究所

<120>调控金针菇子实体发育的转录因子PDD1及其编码基因与应用

<160>2

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>1204

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>1

atgcctccct cccgaactct gtcgtcctct cctacggaaa tcgtctggac tcttccgaat 60

tcctcttttg ggcaacttga cactgccccc ggcagcacta ccacaaaaca cgccaagaag 120

aagcctgcta ctcacatccc ccgtccacca aatgccttca ttctttttcg ctcgtccttc 180

atcaagtctc aacacgtatc caccgatgtc gagacgaacc atagcacgct cagcaaaatc 240

attggtatga cttggcaggg catgaaggac gaggagagga aggtctggca cgacaaggcc 300

cgggtcgcgt tggaggaaca caggaaaaga tttcccgcgt acgctttcag gccgtccggt 360

ggtggtgcca aaggaggtac cccagacggc ggtggtggag gagtcaagag acggaaagta 420

cgggaggtcg aaccgaaaga taccaaacgc tgccagaaaa tcgcggagct tctggtagag 480

ggcctcaagg gcgctacgct ggacgatgcg atccgcgagt tcgacaagac gcacgtcaag 540

gagatcgtaa cgcgtttcga ggtgcctatc actgagagcg cgtacaggaa gaaggaagaa 600

aagaaggcgg cacaggatgt taaggtcatc gttgtaagtc ctcacttcat cgtctcgatg 660

gcgcgttctt aatcgttctt aggacgtcaa gaaagaaccc accgttgaag aaatggtcga 720

ccaacaattg tactatcccg acccggcaaa cgactattcg tattgccata cgccaacttc 780

accatatccc aacacgccga tttcttcata tccaacatcc cctatcgatc acaattcgcc 840

agttgatatg acctcgttcc cctgttcccc ctctgctcac agttcgtatc catgctctcc 900

ggcggcagac aacttcttca atcctgaatt cgttgggtct tgtcagcttc catacccccc 960

ggcgccctct tacgatacgc tttcaccgcc gtcttacgaa ctcgacgctc ccgttccggg 1020

cttcttgcct ccaccagaat ctgttcttga ctcattcttc agcaatgcgt ctgacacgtt 1080

cacattcgaa tttccgggtg cccccgacgg cgagttcctt acagacttca tggattttga 1140

aatgcccatg cctttaaacc cgacttggaa catgaacgga gaaggtagtg gccttgcatt 1200

ttga 1204

<210>2

<211>384

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>2

Met Pro Pro Ser Arg Thr Leu Ser Ser Ser Pro Thr Glu Ile Val Trp

1 5 1015

Thr Leu Pro Asn Ser Ser Phe Gly Gln Leu Asp Thr Ala Pro Gly Ser

202530

Thr Thr Thr Lys His Ala Lys Lys Lys Pro Ala Thr His Ile Pro Arg

354045

Pro Pro Asn Ala Phe Ile Leu Phe Arg Ser Ser Phe Ile Lys Ser Gln

505560

His Val Ser Thr Asp Val Glu Thr Asn His Ser Thr Leu Ser Lys Ile

65707580

Ile Gly Met Thr Trp Gln Gly Met Lys Asp Glu Glu Arg Lys Val Trp

859095

His Asp Lys Ala Arg Val Ala Leu Glu Glu His Arg Lys Arg Phe Pro

100 105 110

Ala Tyr Ala Phe Arg Pro Ser Gly Gly Gly Ala Lys Gly Gly Thr Pro

115 120 125

Asp Gly Gly Gly Gly Gly Val Lys Arg Arg Lys Val Arg Glu Val Glu

130 135 140

Pro Lys Asp Thr Lys Arg Cys Gln Lys Ile Ala Glu Leu Leu Val Glu

145 150 155 160

Gly Leu Lys Gly Ala Thr Leu Asp Asp Ala Ile Arg Glu Phe Asp Lys

165 170 175

Thr His Val Lys Glu Ile Val Thr Arg Phe Glu Val Pro Ile Thr Glu

180 185 190

Ser Ala Tyr Arg Lys Lys Glu Glu Lys Lys Ala Ala Gln Asp Val Lys

195 200 205

Val Ile Val Asp Val Lys Lys Glu Pro Thr Val Glu Glu Met Val Asp

210 215 220

Gln Gln Leu Tyr Tyr Pro Asp Pro Ala Asn Asp Tyr Ser Tyr Cys His

225 230 235 240

Thr Pro Thr Ser Pro Tyr Pro Asn Thr Pro Ile Ser Ser Tyr Pro Thr

245 250 255

Ser Pro Ile Asp His Asn Ser Pro Val Asp Met Thr Ser Phe Pro Cys

260 265 270

Ser Pro Ser Ala His Ser Ser Tyr Pro Cys Ser Pro Ala Ala Asp Asn

275 280 285

Phe Phe Asn Pro Glu Phe Val Gly Ser Cys Gln Leu Pro Tyr Pro Pro

290 295 300

Ala Pro Ser Tyr Asp Thr Leu Ser Pro Pro Ser Tyr Glu Leu Asp Ala

305 310 315 320

Pro Val Pro Gly Phe Leu Pro Pro Pro Glu Ser Val Leu Asp Ser Phe

325 330 335

Phe Ser Asn Ala Ser Asp Thr Phe Thr Phe Glu Phe Pro Gly Ala Pro

340 345 350

Asp Gly Glu Phe Leu Thr Asp Phe Met Asp Phe Glu Met Pro Met Pro

355 360 365

Leu Asn Pro Thr Trp Asn Met Asn Gly Glu Gly Ser Gly Leu Ala Phe

370 375 380