应答调控子MXAN1093在Myxococcus xanthus DK1622子实体发育过程中作用机制的研究

摘要

粘球菌（Myxococcus xanthus）是一类具有复杂多细胞群体行为的革兰氏阴性细菌。在营养丰富条件下，细胞通过滑行运动进行摄食和营养生长;而营养贫瘠条件下，则通过协调的群体运动形成多细胞子实体并最终分化成抗逆性的粘孢子。这一复杂的社会学行为和生活周期受到精细而复杂的信号传导与调控网络的调控。
　　由感应蛋白组氨酸激酶(Histidine Kinase，HK)和应答调控蛋白(ResponseRegulator，RR)组成的双组份信号传导系统(Two-component signal transductionsystems，TCSs)是原核细胞中主要的信号感应与传导系统，通过调控下游基因的转录表达使细胞对外界刺激变化进行应答。M.xanthus DK1622基因组编码了大量的TCSs，与其他信号传导蛋白一起组成了一个复杂的信号网络，在粘球菌运动、摄食及子实体发育等行为中发挥着重要作用。
　　MXAN1093是M.xanthus DK1622中TCSs基因之一，预测编码孤儿应答调控子，即其上下游没有相应的激酶基因。前期研究发现该基因的敲除导致突变株产生特殊的发育性状，即饥饿条件早期聚集提前，能形成不典型的子实体，但是无法形成抗逆性孢子，提示MXAN1093在粘球菌DK1622的子实体发育过程中发挥重要的调控作用。
　　已知TCSs是通过磷酸化传递完成信号的传导，即环境刺激诱导HK的组氨酸位点发生自身磷酸化，该磷酸基团进而被传递给RR保守的天冬氨酸，后者因磷酸化而发生构象改变，激活效应域发挥调控功能。那么，磷酸化传递是否在MXAN1093的功能发挥中起到了关键作用？如是，则又有哪些位点参与了磷酸化传递呢？尽管是孤儿RR基因，但MXAN1093必然要与一个或多个HK组成TCS才能进行信号传递，那么究竟是哪个/些HKs将信号传递给它？它参与调控的靶基因又是哪些？
　　本论文首先通过体内体外试验验证了MXAN1093的磷酸化位点对蛋白活性的重要性。在体外，采用Mn2+-Phos-tag SDS-PAGE对异源表达的MXAN1093(rMXAN1093)的磷酸化形式进行了检测，但未能检测到其磷酸化状态。推测可能是由于蛋白质只有在行使功能时，也就是说细胞受到外界某种信号刺激而启动信号传导时，MXAN1093才被磷酸化继而调控下游基因的转录表达;或者因为天冬氨酸的磷酸基团不稳定，纯化过程中导致键的断裂和磷酸基团的丢失。因此，我们又采用定点突变的方法对磷酸化位点进行了体内验证。根据生物信息学分析结果构建了保守磷酸化位点——第128位天冬氨酸(D128)的定点突变菌株，并对它们的子实体发育性状进行了分析，结果显示:模拟无活性的定点突变菌株D128A、D128N菌株发育过程中不发生聚集、不形成子实体，发育120小时无法生成抗逆性孢子;模拟组成型活性的菌株D128E发育延迟，在48小时才形成初期的子实体，但最终无明显的粘孢子形成。这一方面再次证实粘细菌发育受到严格的时间和空间进程的调控，信号传导蛋白的过多或过少都会导致发育缺陷，另一方面也证实了D128位点对于MXAN1093蛋白的活性具有重要作用。
　　其次，通过比较转录组测序及目的基因的敲除，鉴定了MXAN1093参与调控的部分靶基因。MXAN1093预测为DNA结合的转录应答调控子，理论上它是通过与靶基因启动子序列的结合来调控下游基因的表达变化。MXAN1093的敲除必然将导致靶基因表达量的变化。所以，通过比较相同条件下野生株和突变株的转录组，获得了受MXAN1093直接或者间接调控的靶基因，包括两个操纵子（MXAN1461-1465、MXAN3885-3882）和七个单个基因。在qRT-PCR验证正确后，本论文又进一步对这些基因进行了敲除和子实体发育分析，结果证实MXAN0504、4837、1284、1292四个基因与M.xanthus DK1622菌株在高盐条件下的胁迫应答相关;在ΔMXAN093发育12-15H细胞外壁和野生菌株相比，可能由于MXAN3885-3882表达量的变化导致排列整齐度的差异，需要进一步的进行扫描电镜的检测;MXAN1462、MXAN1463、MXAN1464基因突变导致某些发育相关的蛋白的合成受到影响，进而影响子实体的发育。
　　最后，本论文利用细菌双杂交BACTH系统，尝试了MXAN1093相互作用激酶的筛选与验证。首先构建了M xanthus DK1622基因组文库，并以MXAN1093为诱饵筛选其互作蛋白，可能源于系统本身的缺陷，目前并没有筛选到互作蛋白。在对M.xanthusDK1622所有编码激酶进行了详细分析的基础上，本论文又构建了目前没有研究报道的49个激酶/激酶HPK结构域的质粒库，它们与MXAN1093“一对一”互作的验证工作仍在进行中。

目录

声明

摘要

符号说明及缩写词

第一章 文献综述

1．1．粘细菌及其经典的多细胞群体行为的概述

1．1．1．粘球菌的双运动系统

1．1．2．多细胞子实体的发生及抗逆性粘孢子的分化过程

1．1．3．群体捕食行为

1．2．双组分信号传导系统

1．2．1．双组份信号传导系统在原核生物中的研究进展

1．2．2．原核生物中双组份信号传导系统的研究方法

1．3．比较全局转录组分析

1．4．粘球菌中双组份信号传导系统的研究进展

1．5．实验室前期研究进展和本论文实验开展思路

第二章 MXAN1093蛋白的磷酸化位点验证

2．1．实验材料

2．1．1．菌株与质粒

2．1．2．培养基

2．1．3 溶液试剂与仪器

2．2．实验方法

2．2．1．MXAN1093蛋白的磷酸化位点体内验证

2．2．2．MXAN1093蛋白的磷酸化位点体外验证

2．3．实验结果及分析

2．3．1．MXAN1093蛋白的磷酸化位点体内验证结果

2．3．2．MXAN1093蛋白的磷酸化位点体外验证结果

第三章 比较转录组分析MXAN1093蛋白调控的靶基因

3．1．实验材料

3．1．1．菌株与质粒

3．1．2．培养基

3．1．3．溶液试剂与仪器

3．2．实验方法

3．2．1．MXAN1093的DNA结合结构域对DK1622发育的影响

3．2．2．不同发育时间点的DK1622和ΔMXAN1093菌株的收集

3．2．3．不同发育时期的粘球菌RNA提取方法的选择优化

3．2．4．比较转录组分析DK1622和ΔMXAN1093差异表达基因

3．2．5．比较转录组分析得到的差异表达基因的筛选

3．2．6．qRT-PCR验证差异表达基因的RNA-seq数据

3．2．7．差异表达基因／基因簇敲除菌株的构建

3．2．8．环境胁迫条件下，差异表达基因／基因簇的突变体的子实体发育分析

3．3．实验结果及分析

3．3．1．MXAN1093 DNA结合结构域敲除菌株的发育分析

3．3．2．不同发育时期的粘球菌RNA的提取

3．3．3．比较转录组分析得到的差异表达基因的筛选结果

3．3．4．qRT-PCR验证差异表达基因的RNA-seq数据

3．3．5．差异表达基因／基因簇的敲除载体构建结果

3．3．6．环境胁迫条件下，差异表达基因／基因簇的突变体的子实体发育分析结果

第四章 细菌双杂交技术筛选MXAN1093的互作激酶

4．1．实验材料

4．1．1．菌株和质粒

4．1．2．培养基

4．1．3．溶液试剂与仪器

4．2．实验方法

4．2．1．生物信息学分析软件

4．2．2．引物信息

4．2．3．含有诱饵蛋白的诱饵菌株的构建

4．2．4．基因组文库的构建及筛选

4．2．5．全长激酶质粒库和激酶HPK结构域质粒库的构建

4．2．6．细菌双杂交系统验证MXAN1093和激酶之间的相互作用

4．3．实验结果及分析

4．3．1．生物信息学分析结果

4．3．2 含有诱饵蛋白的诱饵菌株的构建

4．3．3．基因组文库的构建及筛选

4．3．4．全长激酶质粒库和激酶HPK结构域质粒的构建结果

第五章 总结与展望

附录

参考文献

致谢