一种septin基因shRNA在制备septin基因活性抑制剂中的应用

摘要

本发明公开了一种septin基因shRNA在制备septin基因活性抑制剂中的应用，本发明方法能够有效地抑制胶质细胞瘤的生长，并且对人体正常的细胞如表皮成纤维细胞没有明显的伤害。

说明书

(一)技术领域

本发明涉及基因septin的两种亚型Septin2(SEPT2)，Septin9(SEPT9)的shRNA，及在抑制胶质细胞瘤活性中的应用。

(二)背景技术

胶质母细胞瘤(GBM)是中枢神经系统(CNS)最常见的原发性恶性肿瘤，其五年生存率低于10％。全球每年新发病例约21万例，占脑肿瘤的81％。根据胶质瘤的起源，可以分为四种类型的胶质瘤，包括星形细胞瘤(世界卫生组织分类星形细胞瘤I，II级(星形细胞瘤)，III级(间变性星形细胞瘤)和IV级(胶质母细胞瘤，GBM))，少突神经胶质瘤，室管膜瘤和混合神经胶质瘤。由于GBM细胞能够向正常大脑的生长和侵袭，使得切除手术和治疗变得困难。GBM早在90年前就被Percival Bailey和Harvey Cushing发现和命名了，但是仍然难以治疗，因为预后差，一般患者中位生存期约为1年。目前在手术安全切除，放射治疗和化疗方面取得了进展，但存活的GBM细胞通常仍能继续生长并产生耐药性。因此，我们需要对GBM的分子病理生理学的更全面的理解，以便制定更有效和有针对性的治疗策略。

虽然GBM的分子机制仍然难以捉摸，但过去10年来在世界范围内积累了大量的GBM基因转录组数据。由于其复杂性，对于GBM系统的充分描述需要从RNA到蛋白质水平的各种分子生物学数据的组合。由于其多样性和逐渐产生的耐药性，用单个靶标治疗多因素肿瘤例如GBM通常是不现实的，开发GBM的多靶点疗法可能是一个有效地方法。鉴于这些考虑，我们应用了一种无偏多元组合方法来整合微阵列多重分析和蛋白质组识别分析的结果。这种组合方法寻找到了两种新型的GBM相关分子，Septin9和Septin2。

Septins是从酵母到人的高度保守的GTP结合和膜相互作用蛋白家族，它们参与各种细胞过程如细胞骨架组织，胞质分裂和膜动力学。到目前为止，已经在人中鉴定出了13个功能性septin基因(SEPT-1至SEPT-12和SEPT14)，根据它们的序列同源性(SEPT-2，SEPT-3，SEPT-6，SEPT-7亚组)。Septin家族成员能够以强亲和力相互形成非极性三，六或八聚体复合物，这意味着它们的功能相互作用。此外，Septins也被认为参与多种细胞功能，如染色体分离，DNA修复，细胞极化，迁移和细胞凋亡。

目前，许多研究已经报道Septin表达或活性的失调与人类肿瘤发生有关，在乳腺癌中检测到五种Septin(SEPT-2，-7，-8，-9和-11)的高水平表达。其中，SEPT-9被鉴定为乳腺癌，卵巢癌，头颈癌，前列腺癌和结直肠癌中的致癌基因，下调SEPT-2可以通过PPARγ活化抑制肝癌细胞生长。在本研究中，我们在多组学分析中将SEPT-9和SEPT-2鉴定为GBM相关基因，发现其在GMB细胞中的表达抑制可抑制GBM的体外和体内发病和进展。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种septin基因shRNA在制备septin基因活性抑制剂中的应用，在干扰其表达的情况下能够抑制胶质细胞瘤的生长，为临床上治疗胶质瘤，提供了一个新的解决方法。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种septin基因shRNA在制备septin基因活性抑制剂中的应用，所述的shRNA核苷酸序列为下列之一所示：

SEPT9-shRNA-1(简写SEPT9-sh1)：

GATCCGAGATCAAGTCCATCACGCACGATATTTCAAGAGAATATCGTGCGTGATGGACTTGATCTCTTTTTGAATTCAAAAAGAGATCAAGTCCATCACGCACGATATTCTCTTGAAATATCGTGCGTGATGGACTTGATCTCG；

SEPT2-shRNA-1(简写SEPT2-sh1)：

GATCCGCTATGGTGACGCTATCAACTGCAGAGATTCAAGAGATCTCTGCAGTTGATAGCGTCACCATAGCTTTTTGAATTCAAAAAGCTATGGTGACGCTATCAACTGCAGAGATCTCTTGAATCTCTGCAGTTGATAGCGTCACCATAGCG。

本发明还提供一种所述shRNA在制备胶质母细胞瘤活性抑制剂中的应用。

所述胶质母细胞瘤为胶质瘤细胞U-87MG或胶质瘤细胞A172。

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明方法能够有效地抑制胶质细胞瘤的生长，并且对人体正常的细胞如表皮成纤维细胞(HDF)没有明显的伤害。

(四)附图说明

图1为GBM相关基因发现和验证的综合多组学研究纲要。

图2为SEPT2和SEPT9在正常组织和神经胶质瘤组织及GBM细胞系中的表达模式。A为SEPT2和SEPT9在3个等级胶质瘤(Astrocytoms(GradeⅡ)、(Astrocytoms(GradeⅢ)、(Astrocytoms(GradeⅣ))和正常脑组织(Normal brain)中表达的免疫组化检测。B为SEPT2和SEPT9在A172和U87-MG细胞中表达及与GFAP共定位细胞免疫荧光检测；C为SEPT2和SEPT9在不同组织和细胞(A172，U87-MG，HDF，brain(正常人脑组织))中表达量的western blot检测。

图3为SEPT2-sh1，SEPT9-sh1干扰质粒干扰SEPT2和SEPT9后，SEPT2和SEPT9在mRNA和蛋白质水平表达量的影响。A在SEPT2-sh1，SEPT9-sh1干扰质粒分别干扰SEPT2，SEPT9或同时干扰SEPT2和SEPT9后，SEPT2和SEPT9mRNA表达量的变化。B，C为SEPT2-sh1，SEPT9-sh1干扰质粒分别干扰SEPT2，SEPT9或同时干扰SEPT2和SEPT9后，SEPT2和SEPT9蛋白水平表达量的变化，D为SEPT9(sh1，sh2)和SEPT2(sh1，sh2)干扰后SEPT9和SEPT2的表达。

图4为SEPT2和SEPT9mRNA的干扰后对A172细胞生长抑制的影响。(A)为共表达GFP的SEPT2，SEPT9和SEPT2,9共转染shRNA(SEPT2-sh1和SEPT9-sh1)的A172细胞荧光图。(B)SEPT2-sh1和SEPT9-sh1干扰质粒分别干扰SEPT2，SEPT9或同时干扰SEPT2和SEPT9，A172细胞生长曲线。(C)SEPT2-sh1和SEPT9-sh1之间的协同作用的Fa-CI图。

图5为SEPT2-sh1和SEPT9-sh1干扰质粒分别干扰SEPT2、SEPT9或同时干扰SEPT2和SEPT9对A172细胞周期进程和细胞凋亡的影响。A通过FACS分析检测细胞周期进展。B用膜联蛋白V-7-AAD染色评估细胞凋亡。C用ModFit LT软件计算细胞周期分布。D用单shRNA和双shRNA处理A172细胞中凋亡细胞的比例。

图6为SEPT2-sh1和SEPT9-sh1干扰质粒干扰SEPT2和SEPT9对A172细胞迁移和侵袭能力的影响。A干扰SEPT2和SEPT9或同时干扰SEPT2和SEPT9对A172细胞迁移能力的影响。B干扰SEPT2和SEPT9或同时干扰SEPT2和SEPT9对A172细胞侵袭的影响。C对A172细胞的迁移距离进行定量。D入侵细胞的平均细胞计数。

图7为SEPT2-sh1和SEPT9-sh1干扰涉及MEK-ERK和p53-p21途径的GBM细胞生长实验。A干扰SEPT2和SEPT9或同时干扰SEPT2和SEPT9的A172细胞中pMEK1/2，Erk1/2和pErk1/2western blot检测。B干扰SEPT2和SEPT9或同时干扰SEPT2和SEPT9的A172细胞中p53和p21western blot检测。C过表达SEPT2或SEPT9的RNAi生长抑制细胞免疫荧光。D过表达SEPT2或SEPT9的RNAi生长抑制细胞生长曲线。

图8为SEPT2和SEPT9敲低对裸鼠中GBM细胞衍生的皮下异种移植肿瘤的影响。A通过IVIS系统在不同组中分析体内生物发光成像数据。B肿瘤体积变化生长曲线；C单shRNA和双shRNA治疗组注射20天后肿瘤重量显著性分析。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：通过多组学分析寻找和鉴定GBM相关基因

(1)实验方法：综合多组学分析

GBM转录组学研究是基于以下四项标准选择的：1)样品来自具有正常对照的原代组织；2)使用了三个以上的病例和对照；3)实验在同一平台上运行；4)研究由独立小组进行(见表1)。同时进行三种不同GBM细胞系的蛋白质组学分析以代表蛋白质水平的基因表达。如多组学分析工作流程图(图1)所示，输入蛋白组学和转录组学共生成的数据，输出的是高质量的候选功能基因，根据不同的统计学标准排列。综合了来自基因表达综合(GEO)储存库的GBM表达数据研究以进行多重分析。对于所测试的47,000个中的每一个转录本，使用Fisher's方法计算所有研究中的meta fold-change和meta p-value。如果meta fold-change大于1.5且meta effect p-value小于4.5×10^-5，则认为该基因为GBM相关基因。确定了Notch1，SEPT-9，SEPT-2，NES，WEE1，RPN2，PDGFRB，SOX4作为GBM相关基因。然后通过三种不同的GBM细胞系的蛋白质组学分析，筛选出候选蛋白，并进一步缩小SEPT9，SEPT2作为最终候选基因(图1)。

(2)实验结果：因为Septin基因已被发现涉及细胞增殖，迁移和肿瘤发生，但其在GBM中的作用尚未确定，最终选择SEPT9和SEPT2作进一步验证。

表1

实施例2：SEPT9和SEPT2在GBM组织和细胞系中的表达

一、实验方法：

1、免疫组化

(1)将正常脑组织切片(I级正常的人脑组织，购自Rockville，MD，USA)，3个等级胶质瘤切片(II级(星形细胞瘤)、III级(间变性星形细胞瘤)和IV级(胶质母细胞瘤，GBM，购自Rockville,MD,USA)在二甲苯中洗涤以除去石蜡，通过连续稀释的醇重新水化。

(2)用PBS冲洗组织切片两次，每次5分钟。

(3)在室温下，在3％双氧水中孵育10分钟，阻断内源性过氧化物酶活性。

(4)用PBS冲洗组织切片5分钟。

(5)抗原检索。用微波炉将抗原修复缓冲液(购自生工生物)加热至沸腾状态，将组织切片放入95-100℃的缓冲液中10min，2次，冷却组织切片，用1×PBS洗2次(每次3-5分钟)。

(6)用PBS冲洗组织切片5分钟。

(7)使用封闭抗体(3％正常山羊血清在1×PBS中)，在室温下孵育20分钟，并甩掉残留的液体。

(8)加入一抗，4℃过夜(抗体在1×PBS中用3％山羊血清稀释)。

(9)用PBS冲洗组织切片5分钟，每次5分钟。

(10)在室温下用生物素缀合的第二抗体孵育30分钟。

(11)用PBS冲洗组织切片两次，每次5分钟。

(12)使用SABC试剂(购自Abcam)在室温孵育组织切片30分钟。

(准备ABC试剂：将试剂A液2滴(100ul)加到5ml PBS混合液中，立即加2滴试剂B混合液，放置30分钟后避光)(Vector ABC试剂盒，Cat.NO PK-6100系列)

(13)用PBS冲洗组织切片4次，每次5分钟。

(14)使用DAB的染色(用常规显微镜控制染色程度)。

(15)在蒸馏水中清洗组织切片。

(16)在苏木精(载体苏木素目录号H-3401)中染色。(苏木素复染7-8min，用自来水冲洗)。

(17)阵列载玻片的脱水。

2、细胞免疫荧光染色

(1)分别在6孔板中培养的健康状态的A172细胞(购自American Type CultureCollection(ATCC)、HDF细胞(购自American Type Culture Collection(ATCC))，U87-MG细胞(购自American Type Culture Collection(ATCC))，均采用普通培养基(10％FBS，90％DMEM，购自于gibico)培养，将吸管靠于培养板孔边缘小心吸去培养液，PBS洗2-3次(动作要轻，沿壁加入PBS)。

(2)吸去PBS后，加4％多聚甲醛，37℃固定30min。

(3)PBS漂洗3次。

(4)加入含1％Triton-100的蒸馏水，37℃处理30min。

(5)PBS漂洗2次，加入封闭液(1ml羊血清，6ml的1％Triton，13ml的PBS)，37℃封闭30min。

(6)去除封闭液后，用PBS多洗几遍，加入1：1000稀释的SEPT2一抗，SEPT9一抗，4℃过夜。

(7)PBS洗三遍，加入稀释2抗。

(8)去除2抗，随后用去离子水洗干净。

(9)根据相应的激发波长设定好，在荧光显微镜下观察细胞。

3、Western blot

(1)在6孔板中培养的健康状态的A172细胞、HDF细胞、U87-MG细胞，用预冷的PBS洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。

(2)按1ml RIPA裂解液加10μl蛋白酶抑制剂及10μl磷酸酶抑制剂配制裂解混合液，摇匀置于冰上。

(3)每孔细胞加400μl步骤(2)制备的裂解混合液，在冰上裂解30分钟，为使细胞充分裂，培养瓶要经常来回摇动。

(4)裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧，然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中。(整个操作尽量在冰上进行。)

(5)于-4度下12000rpm离心5分钟。

(6)将离心后的上清(即为蛋白样品)分装转移到1.5ml的离心管中。使用BCA试剂盒(购于Abcam)测蛋白浓度。

(7)在收集的蛋白样品中加入5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。100℃或沸水浴加热3-5分钟。

(8)冷却到室温后，取20ul步骤(6)蛋白样品和Human Brain(购自Abcam)上样到SDS-PAGE胶加样孔内，样品两侧泳道加入等体积1x loading buffer，Marker也用1xloading buffer调整至20ul(与样品等体积)。设置电泳装置，使用100V，15分钟，后再使用200V，30分钟，当溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳。

(9)组装转膜夹子：先将转膜夹子(一面为黑色)，衬垫，剪好的PVDF膜(预先用甲醇浸泡)和双侧滤纸在转移缓冲液中浸泡15分钟。然后在转移液中打开转膜夹子，先夹子黑面上依次放上衬垫、双侧滤纸、电泳完的凝胶、PVDF膜，双侧滤纸、衬垫，合上夹子。

(10)转膜：将组装好的转膜夹子装入转移槽，夹子黑面对应转移槽黑色一侧。在转移槽中倒满转移液，两遍放入冰袋，将转移槽置于加满冰的泡沫盒中。接通电源，300毫安转移2小时。

(11)转膜完毕后，把PVDF膜放置到预先准备好的TBST液中，摇床上漂洗10分钟，更换TBST液后继续洗涤10分钟，共洗涤3次。

(12)吸尽洗涤液，加入Western封闭液(5％的脱脂奶粉的TBST液)，在摇床上缓慢摇动，室温封闭60分钟。

(13)用BSA液将一抗SEPT9，一抗SEPT2按照1:3000稀释。吸去PVDF膜上的封闭液，加入配好的一抗缓冲液，摇床4℃缓慢摇动孵育过夜。

(14)回收一抗。加入TBST液，在摇床上缓慢摇动洗涤10分钟。吸尽洗涤液后，再更换洗涤液洗涤10分钟。共洗涤3次。

(15)用BSA液将辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔或鼠来源的二抗按照1:5000稀释。吸去PVDF膜上的洗涤液，立即加入稀释好的二抗，室温摇床上缓慢摇动孵育1H。

(16)回收二抗。加入TBST液在摇床上缓慢摇动洗涤10分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液洗涤10分钟。共洗涤3次。

(17)显影成像：

将PVDF膜放入适合大小的盒子中，加入ECL发光液，完全覆盖PVDF膜，充分反应。用凝胶成像仪曝光保存蛋白条带图像。

二、实验结果

分析SEPT9和SEPT2在正常脑组织(n＝12)中的表达；低级别胶质瘤组织样品，2级星形细胞瘤(n＝8)；3级胶质瘤样本(间变性星形细胞瘤：n＝12)和4级GBM(n＝12)。免疫组织化学分析显示第4级GBM组织中SEPT9和SEPT2的表达明显增加(图2中A)。与正常脑和HDF细胞(图2中C)相比，免疫细胞化学和western印迹分析显示在GBM细胞系中SEPT9和SEPT2的表达水平明显增加(图2中B，C)。因此得出，在高等级GBM组织以及几个GBM衍生的细胞系如A172和U87-MG中，SEPT9和SEPT2表达上调。

实施例3：在A172细胞中使用shRNA抑制SEPT9和SEPT2表达

1、实验方法(荧光定量PCR)：

提取GBM细胞(即A172细胞)总RNA，采用Trizol试剂(Thermo Fisher Scientific)用于实时定量PCR(qRT-PCR)分析。扩增反应由cfx96实时PCR检测系统完成(Bio-Rad公司，Hercules，CA，美国)根据操作规范使用SYBR Green荧光定量PCR试剂盒。对于SEPT9和SEPT2引物(表2)，使用2ΔΔCT法计算相关基因的表达。所有的qRT-PCR实验重复三次，所有的数据使用GAPDH作为对照。

表2SEPT2、SEPT9的qPCR引物序列

2、Western blot

1)scramble，SEPT2，SEPT9，SEPT2+SEPT9质粒(GFP共表达)的构建：用的是最常用的干扰质粒构建方法，通过内切酶(Biolabs)，酶切shRNA序列和P GreenPuro载体(生工)，用T4连接酶(碧云天)连接构成质粒。

病毒液获得方法：(1)取4个1.5ml离心管，加入30ul DMEM，30ul Fectin(ThermoFisher)。(2)另取4个1.5ml离心管，加入60ul DMEM，0.75ug pspax2包装质粒，0.25ug pmd2.G包装质粒，分别加入1ug scramble，SEPT2，SEPT9SEPT2+SEPT9干扰质粒，然后与步骤(1)离心管的溶液混合，30分钟后，分别加入在含10％胎牛血清的DMEM培养基中培养的293T细胞液中，24小时后，取培养液室温离心，取上清。

2)用带有SEPT-sh病毒的病毒液感染A172，用带有绿色荧光蛋白(GFP)的空质粒病毒作对照，待细胞在开始出现凋亡之后，用预冷的PBS洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。其它操作同实施例2。

SEPT9和SEPT2的shRNA序列：

SEPT9-shRNA-1(简写SEPT9-sh1，SEQ ID NO.1)：

GATCCGAGATCAAGTCCATCACGCACGATATTTCAAGAGAATATCGTGCGTGATGGACTTGATCTCTTTTTGAATTCAAAAAGAGATCAAGTCCATCACGCACGATATTCTCTTGAAATATCGTGCGTGATGGACTTGATCTCG；

SEPT9-shRNA-2(简写SEPT9-sh2，SEQ ID NO.2)：

GATCCGTGGTCAACATCGTCCCTGTCATTCAAGAGATGACAGGGACGATGTTGACCACTTTTTGAATTCAAAAAGTGGTCAACATCGTCCCTGTCATCTCTTGAATGACAGGGACGATGTTGACCACG

SEPT2-shRNA-1(简写SEPT2-sh1，SEQ ID NO.3)：

GATCCGCTATGGTGACGCTATCAACTGCAGAGATTCAAGAGATCTCTGCAGTTGATAGCGTCACCATAGCTTTTTGAATTCAAAAAGCTATGGTGACGCTATCAACTGCAGAGATCTCTTGAATCTCTGCAGTTGATAGCGTCACCATAGCG。

SEPT2-shRNA-2(简写SEPT2-sh2，SEQ ID NO.4)：

GATTCGGCAGGAAAGTGGAGAATGAGGACATGATCAAGAGTCATGTCCTCATTCTCCACTTTCCTGCCTTTTTGAATTCAAAAAGGCAGGAAAGTGGAGAATGAGGACATGACTCTTGATCATGTCCTCATTCTCCACTTTCCTGCCG。

3、实验结果：为了研究SEPT9和SEPT2在GBM细胞中的作用，分别为SEPT9(sh1，sh2)和SEPT2(sh1，sh2)干扰选择了两个shRNA序列。如图3中D所示，SEPT9-sh1和SEPT2-sh1分别特异性下调SEPT9和SEPT2的表达且P value均小于0.05，基因干扰比SEPT9-sh2和SEPT2-sh2效果显著，所以我们选择了SEPT9-sh1和SEPT2-sh1来进行后续的实验。我们运用慢病毒表达载体，含有SEPT9-sh1，SEPT2-sh1和scramble(非沉默序列)用于基因干扰实验。通过qRT PCR(图3中A)和蛋白质印迹(图3中B和图3中C)验证SEPT9和SEPT2的抑制。而SEPT9-sh1和SEPT2-sh1单独对其各自的基因达到大约70％的抑制，SEPT9-sh1和SEPT2-sh1的组合对SEPT9和SEPT2达到90％的抑制，表明它们在抑制基因表达方面具有协同效应。

实施例4:SEPT9和SEPT2的抑制协同降低GBM细胞活力

实验方法：(1)取4个1.5ml离心管，加入30ul DMEM，30ul Fectin(ThermoFisher)。(2)另取4个1.5ml离心管，加入60ul DMEM，0.75ug pspax2包装质粒，0.25ug pmd2.g包装质粒，分别加入实施例3方法获得的1ug scramble，SEPT2，SEPT9，SEPT2+SEPT9干扰质粒，然后与步骤(1)离心管的溶液混合，30分钟后，分别加入含10％胎牛血清的DMEM培养基的293T细胞中，24小时后，取培养液室温离心，取上清。(3)将含10％胎牛血清的DMEM培养基在96孔板中配置100μl的胶质瘤细胞A172(5000个/孔)，分为scramble组，SEPT2-sh1组，SEPT9-sh1组，SEPT2-sh1+SEPT 9-sh1(即SEPT2，9-sh)组，每孔加入120μl步骤(2)的相应上清，待细胞在荧光显微镜下发出绿色荧光之后进行实验，将培养板在培养箱中37℃、CO₂浓度5％条件下孵育一段适当的时间(0-7天)，每天在固定时间对scramble、SEPT2-sh、SEPT9-sh、SEPT2,9-sh孔中的细胞进行计数并绘制生长曲线。

实验结果：用Scramble，SEPT2-sh、SEPT9-sh、SEPT2，9-sh表达载体转染细胞，在GBM细胞系A172中检测了SEPT9和SEPT2对GBM细胞活力的影响(图4中A)。发现SEPT9和SEPT2的干扰均以时间依赖性方式显著抑制A172细胞生长(图4中B)。在各组RNAi抑制中，SEPT9-sh1和SEPT2-sh1组合(即SEPT2,9-sh)对A172细胞的生长表现出具有最强的抑制作用，揭示了其协同抑制作用(CI为0.27-0.69，CI<1表示协同作用)，具有Fa值为0.10-0.98(图4中C)。

实施例5:SEPT9和SEPT2干扰对GBM细胞凋亡和细胞周期的影响

实验方法：

1、(1)取4个1.5ml离心管，加入30ul DMEM，30ul Fectin(ThermoFisher)。(2)另取4个1.5ml离心管，加入60ul DMEM，0.75ug pspax2包装质粒，0.25ug pmd2.g包装质粒，分别加入实施例3方法获得的1ug scramble，SEPT2，SEPT9，SEPT2+SEPT9干扰质粒，然后与步骤(1)离心管的溶液混合，30分钟后，分别加入含10％胎牛血清的DMEM培养基的293T细胞中，24小时后，取培养液室温离心，取上清。(3)将含10％胎牛血清的DMEM培养基在96孔板中配置100μl的胶质瘤细胞A172(5000个/孔)，分为scramble组，SEPT2-sh1组，SEPT9-sh1组，SEPT2-sh1+SEPT9-sh1(SEPT2，9-sh)组，每孔加入120μl步骤(2)的相应上清，待细胞在开始出现凋亡之后倒去培养基，用PBST洗两遍，加入胰酶细胞消化液，室温孵育至轻轻吹打可以使贴壁细胞吹打下来时，吸除胰酶细胞消化液。需避免胰酶的过度消化。注意：对于贴壁细胞，胰酶消化步骤很关键。胰酶消化时间如果过短，细胞需要用力吹打才能脱落，容易造成细胞膜的损伤，从而导致细胞坏死的假阳性；消化时间如果过长，同样易造成细胞膜损伤而出现细胞坏死的假阳性，甚至会影响细胞膜上磷脂酰丝氨酸与Annexin V-FITC的结合从而干扰对于细胞凋亡的检测。同时，胰酶细胞消化液中应尽量不含EDTA，因为EDTA可能会影响Annexin V与磷脂酰丝氨酸的结合。

(4)加入步骤3收集的细胞培养液，把细胞轻轻吹打下来，转移到离心管内，1000g离心5分钟，弃上清，收集细胞，用PBS轻轻重悬细胞并计数。注意：加入步骤3中的细胞培养液非常重要，一方面可以收集已经悬浮的发生凋亡或坏死的细胞，另一方面细胞培养液中的血清可以有效抑制或中和残留的胰酶。残留的胰酶会消化并降解后续加入的Annexin V-FITC，导致染色失败。

2.AnnexinV/PI双染色：

将步骤(4)收集的细胞重悬于100μl binding buffer，加入2μl Annexin-V-FITC(20ug/ml)，轻轻混匀，避光冰上放置15min。转至流式检测管，加入400μl PBS，每个样品临上机前加入1μl碘化丙啶染色液(PI，50μg/ml)，2分钟后完成流式检测。同时以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作为阴性对照。单染Annexin V-FITC及PI的各一管作为阳性对照。染色完成后用滤网过滤样品，完成流式检测。

实验结果：为了确定减少的细胞数是否归因于由SEPT9-sh和SEPT2-sh诱导的细胞凋亡，我们比较了用各种抑制性RNA(scramble，septin2-sh1，septin9-sh1，septin2+9-sh1)处理的A172细胞中的细胞死亡。相对而言，Scramble RNA产生0.6％±0.2％的凋亡细胞，SEPT9-sh1诱导A172细胞凋亡58.4％±3.8％，SEPT2-sh诱导71.4％±6.0％，SEPT9-sh1与SEPT2-sh1联合诱导凋亡率为80.7％±4.0％(图5中B右下角的点)。因此，干扰这两个基因表达对于诱导A172细胞的早期凋亡显示出协同效应(图5中D)。通过流式细胞仪检测SEPT9-sh1和SEPT2-sh1的抗增殖作用，探讨细胞周期的分布。如图5中A所示，SEPT9-sh1和SEPT2-sh1组G0/G1期的A172细胞明显减少，两组之间没有明显的差异，尽管联合组的效果最明显(图5中C)。结果表现为S期细胞增多，G2/M期细胞消失。

实施例6:SEPT9和SEPT2干扰对GBM细胞在培养物中的迁移和侵袭能力的影响。

实验方法：

一.细胞迁移实验

1、细胞样品的准备

(1)取4个1.5ml离心管，加入30ul DMEM，30ul Fectin(ThermoFisher)。(2)另取4个1.5ml离心管，加入60ul DMEM，0.75ug pspax2包装质粒，0.25ug pmd2.g包装质粒，分别加入实施例3方法获得的1ug scramble，SEPT2，SEPT9，SEPT2+SEPT9干扰质粒，然后与步骤(1)离心管的溶液混合，30分钟后，分别加入含10％胎牛血清的DMEM培养基的293T细胞中，24小时后，取培养液室温离心，取上清。(3)将含10％胎牛血清的DMEM培养基在96孔板中配置100μl的胶质瘤细胞A172(5000个/孔)，分为scramble组，SEPT2-sh1组，SEPT9-sh1组，SEPT2，9-sh1组，每孔加入120μl步骤(2)的相应上清，待细胞汇合度至80％左右时，用中号枪头进行划痕实验，PBS清洗2遍洗去漂浮的细胞。

2、拍照观察

在显微镜下每隔24小时对划痕部位拍照，并对划痕宽度进行统计分析。

二.细胞侵袭能力实验

1、细胞样品的准备

(1)取4个1.5ml离心管，加入30ul DMEM，30ul Fectin(ThermoFisher)。(2)另取4个1.5ml离心管，加入60ul DMEM，0.75ug pspax2包装质粒，0.25ug pmd2.g包装质粒，分别加入实施例3方法获得的1ug scramble，SEPT2，SEPT9，SEPT2+SEPT9干扰质粒，然后与步骤(1)离心管的溶液混合，30分钟后，分别加入含10％胎牛血清的DMEM培养基的293T细胞中，24小时后，取培养液室温离心，取上清。(3)将含10％胎牛血清的DMEM培养基在96孔板中配置100μl的胶质瘤细胞A172(5000个/孔)，分为scramble组，SEPT2-sh1组，SEPT9-sh1组，SEPT2，9-sh1组，每孔加入120μl步骤(2)的相应上清，细胞在开始出现凋亡之后，将含有10％FBS的DMEM培养基换成无血清的DMEM培养基对健康生长的A172细胞进行饥饿处理24h。将饥饿处理后的细胞消化下来重悬密度为25细胞/μl的细胞悬液，在transwell上室中(一类有通透性的杯状的装置，可以认为这是一种膜滤器(Membrane filters)，也可认为是一种有通透性的支架(permeable supports))加入200μl细胞悬液。24孔板下室一般加入500μl含20％FBS DMEM培养基。这里要特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。常规培养24h。

在Lab-Tek载玻片小室(Chamber Slides)上培养贴壁细胞。在凋亡诱导处理之后，用PBS洗2遍载玻片。

2、显微镜观察

实验结果：通过伤口愈合测定和transwell测定来研究SEPT9和SEPT2抑制对GBM细胞的迁移和侵袭的影响。伤口愈合涉及许多过程，包括细胞迁移和细胞极性的建立。如图6中A所示，10h shRNA处理后迁移距离显著减少。SEPT2,9-sh组的迁移距离最短，SEPT9-sh1和SEPT2-sh1组之间的迁移没有明显差异(图6中A，C)。然而，联合组展现侵袭能力最低，由于细胞侵袭是GBM细胞的一个重要特征，通过Transwell小室膜减少的侵袭性细胞数量表明，shRNA处理不仅降低了GBM细胞的活力，而且降低了其运动性(图6中B和6中D)。

实施例7:干扰SEPT9和SEPT2表达抑制了MEK-ERK活化并增加了p53-p21的表达。

实验方法：1.(1)取4个1.5ml离心管，加入30ul DMEM，30ul Fectin(ThermoFisher)。(2)另取4个1.5ml离心管，加入60ul DMEM，0.75ug pspax2包装质粒，0.25ug pmd2.g包装质粒，分别加入实施例3方法获得的1ug scramble，SEPT2，SEPT9，SEPT2+SEPT9干扰质粒，然后与步骤(1)离心管的溶液混合，30分钟后，分别加入含10％胎牛血清的DMEM培养基的293T细胞中，24小时后，取培养液室温离心，取上清。(3)将含10％胎牛血清的DMEM培养基在96孔板中配置100μl的胶质瘤细胞A172(5000个/孔)，分为scramble组，SEPT2-sh1组，SEPT9-sh1组，SEPT2，9-sh1组，每孔加入120μl步骤(2)的相应上清，待细胞在开始出现凋亡之后，用预冷的PBS洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。同实施例2方法进行Western blot。

实验结论：最近的一项研究报道，是由于MEK-ERK信号通路而不是PI3K/AKT信号通路的激活与乳腺癌中SEPT2和SEPT7的蛋白水平增加相关。因此，我们开始研究SEPT9/2RNAi的分子机制诱导的抗GBM效应。我们观察到SEPT9和SEPT2的抑制特异性地削弱了MEK1/2磷酸化和下游基因Erk1/2的磷酸化(图7中A)。Akt激活没有明显的增加，这与乳腺癌细胞中SEPT2和SEPT7消耗的观察相似。这个结果意味着MEK-ERK信号通路可能是Septin家族在不同癌细胞类型中功能的关键。

如前所述，SEPT9和SEPT2干扰引起GBM细胞周期阻滞在S期(图5中A和5中C)并使细胞大量凋亡(图5中B和5中D)。因此，我们接下来检测了细胞周期和凋亡调节蛋白中p53和P21的表达。p53通过诱导细胞凋亡，DNA修复和细胞周期阻滞来保护哺乳动物免于肿瘤形成，如图7中B所示。p53在单个Septin干扰组中累积，在双重Septin敲除组中更为明显。在p53积累之后，p21的蛋白质水平也被上调，这与先前观察到的p53可以介导p21的转录一致，随后与Cdc2-Cyclin B1复合物结合并使其失活，导致S期细胞周期停滞。

实施例8:SEPT9或SEPT2过表达挽救了RNAi诱导的细胞生长抑制

实验方法：

1、(1)取4个1.5ml离心管，加入30ul DMEM，30ul Fectin(ThermoFisher)。(2)另取4个1.5ml离心管，加入60ul DMEM，0.75ug pspax2包装质粒，0.25ug pmd2.g包装质粒，分别加入scramble，SEPT2-sh1，SEPT2-sh1+SEPT 9-OE，SEPT9-sh1，SEPT2-OE+SEPT 9-sh1干扰质粒，然后与步骤(1)离心管的溶液混合，30分钟后，分别加入含10％胎牛血清的DMEM培养基的293T细胞中，24小时后，取培养液室温离心，取上清。(3)将含10％胎牛血清的DMEM培养基在96孔板中配置100μl的胶质瘤细胞A172(5000个/孔)，每孔加入120μl步骤(2)的相应上清，待细胞在开始出现凋亡之后在荧光显微镜中观察细胞状态。采用实施例2的westernblot检测A172细胞中pMEK1/2和pErk1/2，Erk，p53和p21。

2、同样条件下，将步骤1分组改为scramble，SEPT2组(SEPT2-sh1)，SEPT2+SEPT9过表达组(SEPT2-sh1+SEPT9-OE)、SEPT9组(SEPT9-sh1)和SEPT2过表达+SEPT9组(SEPT2-OE+SEPT9-sh1)。采用实施例2方法进行细胞免疫荧光和实施例4方法进行细胞生长曲线检测。

实验结果：由于SEPT9和SEPT2敲除以协同的方式抑制了GBM细胞的生长，我们推测过表达一个Septin基因可以补偿GBM细胞中另一种的损失。因此，我们在A172中进行了挽救实验。正如所料，在SEPT2敲低的细胞中SEPT9的过度表达挽救了通过RNAi的细胞生长抑制，并且在SEPT9耗尽的细胞中SEPT2的过表达具有相似的效果(图7中C和7中D)。

实施例9：SEPT9和SEPT2抑制体内GBM生长

实验方法：从上海SLAC实验动物公司购买30只5周龄雌性免疫缺陷裸鼠(BALB/c-nu)。

(1)取4个1.5ml离心管，加入30ul DMEM，30ul Fectin(ThermoFisher)。(2)另取4个1.5ml离心管，加入60ul DMEM，0.75ug pspax2包装质粒，0.25ug pmd2.g包装质粒，分别加入scramble，SEPT2-sh1，SEPT9-sh1，SEPT2-sh1+SEPT 9-sh1干扰质粒，然后与步骤(1)离心管的溶液混合，30分钟后，分别加入含10％胎牛血清的DMEM培养基的293T细胞中，24小时后，取培养液室温离心，取上清。(3)将含10％胎牛血清的DMEM培养基在96孔板中配置100μl的胶质瘤细胞U87-MG(5000个/孔)，每孔加入120μl步骤(2)的相应上清，培养至细胞开始出现凋亡，分别获得U87-Scramble细胞、U87-SEPT2-sh1细胞、U87-SEPT9-sh1细胞和U87-SEPT2,9-sh1细胞，以U87细胞为对照。

(4)将步骤(3)各组细胞以2×10^6个皮下注射到裸鼠后肢右侧，在第5天观察到明显的结节。用体内成像系统(PerkinElmer，San Jose，CA，USA)追踪GFP标记的GBM细胞，每隔4天用卡尺测量肿瘤体积，观察期为3周，使用公式：体积＝长×宽²×0.5>44天后处死所有小鼠，测量肿瘤重量。

实验结果：为了研究SEPT9-sh1和SEPT2-sh1干扰质粒在体内的抗GBM效应，我们建立了GBM细胞的皮下异种移植肿瘤模型。各组细胞注射到裸鼠中5天后的照片见图8中A，在不同组中肿瘤生长的不同时间点测量肿瘤体积(图8中B)。8天后，与U87和U87-Scramble组相比，加入U87-SEPT2-sh1，U87-SEPT9-sh1和U87-SEPT2,9-sh1的细胞小鼠平均肿瘤大小没有增加。20天后，取出每只小鼠的肿瘤并称重。与U87和U87-Scramble组相比，单一和双重Septin RNAi处理显著降低实体瘤质量(图8中C)，表明下调GBM细胞中SEPT9和SEPT2的表达抑制它们在体内的肿瘤形成。

序列表

<110> 杭州师范大学

<120> 一种septin基因shRNA在制备septin基因活性抑制剂中的应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 144

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 1

gatccgagat caagtccatc acgcacgata tttcaagaga atatcgtgcg tgatggactt 60

gatctctttt tgaattcaaa aagagatcaa gtccatcacg cacgatattc tcttgaaata 120

tcgtgcgtga tggacttgat ctcg 144

<210> 2

<211> 128

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 2

gatccgtggt caacatcgtc cctgtcattc aagagatgac agggacgatg ttgaccactt 60

tttgaattca aaaagtggtc aacatcgtcc ctgtcatctc ttgaatgaca gggacgatgt 120

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<210> 3

<211> 152

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 3

gatccgctat ggtgacgcta tcaactgcag agattcaaga gatctctgca gttgatagcg 60

tcaccatagc tttttgaatt caaaaagcta tggtgacgct atcaactgca gagatctctt 120

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<210> 4

<211> 148

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 4

gattcggcag gaaagtggag aatgaggaca tgatcaagag tcatgtcctc attctccact 60

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