一种协同作用改性海带多糖的制备方法

摘要

本发明属于多糖衍生物技术领域，尤其涉及一种协同作用改性海带多糖的制备方法。本发明采用低热固相一步合成法，因其反应温度低,能耗小,操作步骤简单，同时由于不使用或少使用有机溶剂,可减少对环境的污染,因此符合绿色化学的要求,具有开发利用的潜力。本发明对海带多糖进行3‑氨基‑1‑羟基亚丙基二膦酸改性修饰，能够引入膦酸基团、氨基和羟基，为海带多糖构筑一个亲水性表面结构,有效提高其水溶性活性。相对于背景技术中的相关文献，本发明方法制备的3‑氨基‑1‑羟基亚丙基二膦酸海带多糖钙产物的磷酸根含量和钙含量均有大大提高，且绿色环保，操作过程简便易行，便于工业化和技术推广。

说明书

技术领域

本发明属于多糖衍生物技术领域，尤其涉及一种协同作用改性海带多糖的制备方法。

背景技术

天然多糖是由醛糖和（或）酮糖通过糖苷键连接而成的天然高聚物，其在自然界中蕴藏丰富，种类繁多。它也是生物有机体的重要组成部分，具有良好的生物质特性，对生物体的正常生理机能有着非常重要的作用，具有来源广泛、成本低廉、良好的生物活性、天然易降解等诸多优点。

地处胶东半岛的烟台地区海产品资源丰富，是中国重要的海带养殖生产基地。海带中含有丰富的多糖类物质，具有多种生物学功能和广泛的生物学活性。多糖经过分子修饰后可以设计合成出多种新型结构与功能的多糖衍生物，为多糖类食品添加剂、功能性食品、保健品及药物的研究开发奠定基础。利用糖残基上羟基、羧基、氨基等基团运用化学方法进行修饰，可提高多糖的活性。多糖的磷酸化分子修饰是一种共价修饰，是支链上的羟基被磷酸根取代的过程。多糖的磷酸化修饰是在多糖中引入磷酸酯键，由于磷酸根带有负电荷，电负性的增加会影响多糖的某些活性。同时，生物体的膜结构中有很多磷酸酯键，相似的结构也可提高多糖的活性。多糖分子经磷酸化修饰后，支链上的羟基被磷酸基团取代，增强原多糖水溶性，改变链构象。磷酸化多糖因其独特的结构，在免疫调节等生物活性及开发新型材料方面所表现出的潜力日益受到人们的重视。

现有技术对于天然多糖的磷酸酯化改性方法，主要使用的是磷酰氯、磷酸酐、磷酸或磷酸盐。

其中，使用无机磷酸、无机酸酐或无机磷酸盐进行反应时，需要在酸性或者高温条件下进行，然而这些条件容易引起多糖的降解。而用磷酰氯时，则会伴随着交联等副反应产生，使产物复杂化。多糖磷酸酯化反应的反应效率低，产品中磷酸基团的取代度低，这很大程度上束缚了多糖磷酸酯化的研究和应用进展。

目前，有关海带多糖磷酸化改性的报道非常少。传统的天然多糖磷酸化改性反应是在碱性溶液中进行，反应温度较高，反应时间较长。参考文献（王晶，海带褐藻多糖硫酸酯的结构-化学修饰与生物活性研究，博士论文，中国科学院海洋研究所，2010，P79，P81.）中，使用多聚磷酸在碱性条件下对海带褐藻多糖硫酸酯进行磷酸化反应，海带褐藻多糖磷酸化反应是在有机溶液中进行，反应时间长，需要24小时，相关产品磷酸根含量可达到9.62%。

另一方面，钙离子在复杂的生命过程中具有多样的配位结构和重要的催化作用，钙离子能够调节细胞壁的功能、控制半透膜的渗透能力，而且对神经传导、肌肉收缩、激素释放等起着调节控制的作用，因此，钙离子被称为生命金属。现有技术研究涉及到部分天然多糖钙络合物的制备，如香菇多糖钙、黄芪多糖钙、党参多糖钙等种类的络合物，其中报道的党参多糖钙中钙含量达到15.91%。

在知网中文数据库中输入“多糖钙”关键词，目前仅出现二十几篇相关文献，内容涉及到黄芪多糖钙、枸杞多糖钙、党参多糖钙等络合物，其中党参多糖钙中钙含量达到15.91%。（相关参考文献：张新国等，党参多糖钙的制备及鉴别，中药材，2011，34（1），137-139.）。

发明内容

本发明针对上述现有技术存在的不足，提供一种使用低热固相一步法，在不改变海带多糖生物大分子本体性质的前提下对其实施表面修饰，利用协同作用改性海带多糖。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种协同作用改性海带多糖的制备方法，步骤如下：

（1）在18-26℃条件下，将海带多糖、膦酸改性试剂、尿素和氯化钙混合；其中，海带多糖、膦酸改性试剂、尿素和氯化钙的质量比为1.0 ：（0.5-1.5）：（0.05-0.15）：（5.0-15.0）；

（2）将步骤（1）的混合物加热至55-75℃，反应5-7h，得反应混合物；

（3）向步骤（2）的反应混合物中加入蒸馏水，加热至40-60℃复溶；其中，反应混合物与蒸馏水的质量比为1：（150-170）；

（4）将步骤（3）所得溶液经过浓缩、乙醇沉淀、干燥，得到产物3-氨基-1-羟基亚丙基二膦酸海带多糖钙。

其中，所述的膦酸改性试剂为3-氨基-1-羟基亚丙基二膦酸二钠盐。

本发明的有益效果是：

1、目前，未见有膦酸修饰改性和钙离子络合改性二者协同作用海带多糖的研究报道，因此本发明具有非常强的创新性。本发明对海带多糖进行3-氨基-1-羟基亚丙基二膦酸改性修饰，能够引入膦酸基团、氨基和羟基，为海带多糖构筑一个亲水性表面结构, 有效提高其水溶性活性。相对于背景技术中提及的两篇文献，本发明借助膦酸改性与钙离子络合改性---二者协同作用制备得到3-氨基-1-羟基亚丙基二膦酸海带多糖钙，产物的磷酸根含量和钙含量均有大大提高，可在食品添加剂、保健食品等领域广泛使用。且方法绿色环保，操作过程简便易行，便于工业化和技术推广。

2、本发明采用低热固相一步合成法，因其反应温度低, 能耗小, 操作步骤简单，同时由于不使用或少使用(有的反应后处理时需要使用)有机溶剂,可减少对环境的污染,因此符合绿色化学的要求,具有开发和利用的潜力。

具体实施方式

以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

一、产物中磷酸根含量的测定：

以过硫酸铵为氧化剂，将有机膦转化为无机磷，以钼钒酸盐为显色剂，采用钼蓝比色法测定磷酸根含量；具体如下：

（1）钼酸钠—硫酸溶液配制：将100mL浓硫酸慢慢地加到500mL水中，冷却至室温，得到A液；另称取10g钼酸钠溶于400mL水中，得B液；然后将A液加到B液中，混匀；

（2）过硫酸铵—硫酸钠分解剂配制：称取0.8g过硫酸铵和4.2g无水硫酸钠混合均匀；

（3）称取所得产物，并加入10mL蒸馏水于100mL锥形瓶中，加入1mL、1M硫酸溶液及50mg过硫酸铵—硫酸钠分解剂，将锥形瓶放在置有石棉网的小电炉上均匀加热，煮至溶液刚好干稠并刚冒浓厚白烟为止；

（4）稍冷，加入10mL水、4～40mg亚硫酸钠粉末或10滴甲醇，再在电炉上微沸30～60秒取下，将溶液小心转移到50mL比色管中，并用少量水冲洗原锥形瓶几次，洗液并入比色管中，溶液应控制在25mL；

（5）加入4mL钼酸钠—硫酸钠－硫酸溶液及1mL硫酸肼溶液，放入已煮沸的水浴中10分钟后取出，流水冷却，用水稀释至刻度，立即用1cm比色皿，在580nm波长处，以试剂空白作对照测定其吸光度，从标准曲线上查得相应总磷酸盐的含量。

产物中磷酸盐含量（%）= CV/m ×100%

式中：C------为580nm处所测吸光度在标准曲线上查得相应的磷酸根浓度；

V------为产物稀释的体积；

m------为产物的质量。

二、产物中钙离子含量的测定：

称取产物0.2000 g 于小烧杯中，用滴管缓慢加入1∶ 1 HCl 15mL，摇动使之完全溶解，再加入蒸馏水，将溶液煮沸5 min，逐去CO₂>

产物的含钙量( %) = T( V － V₀>2>

式中: T-滴定度( 0. 9248 mg /mL)

V---产物消耗EDTA的体积；

V₀---空白消耗EDTA的体积；

f---稀释倍数；

m₂---产物质量。

实施例1

一种协同作用改性海带多糖的制备方法，步骤如下：

（1）在18-22℃条件下，将海带多糖、3-氨基-1-羟基亚丙基二膦酸二钠盐、尿素和氯化钙混合；其中，海带多糖、3-氨基-1-羟基亚丙基二膦酸二钠盐、尿素和氯化钙的质量比为1.0 ：0.9：0.11：12；

（2）将步骤（1）的混合物加热至60℃，反应5h，得反应混合物；

（3）向步骤（2）的反应混合物中加入蒸馏水，加热至50℃溶解；其中，反应混合物与蒸馏水的质量比为1：160；

（4）将步骤（3）所得溶液经过浓缩、乙醇沉淀、干燥，得到产物3-氨基-1-羟基亚丙基二膦酸海带多糖钙，产物中磷酸根含量为11.27%， 钙含量为19.35%。

实施例2

一种协同作用改性海带多糖的制备方法，步骤如下：

（1）在23-26℃条件下，将海带多糖、3-氨基-1-羟基亚丙基二膦酸二钠盐、尿素和氯化钙混合；其中，海带多糖、3-氨基-1-羟基亚丙基二膦酸二钠盐、尿素和氯化钙的质量比为1.0 ：0.8：0.1：10；

（2）将步骤（1）的混合物加热至70℃，反应5h，得反应混合物；

（3）向步骤（2）的反应混合物中加入蒸馏水，加热至60℃复溶；其中，反应混合物与蒸馏水的质量比为1：160；

（4）将步骤（3）所得溶液经过浓缩、乙醇沉淀、干燥，得到产物3-氨基-1-羟基亚丙基二膦酸海带多糖钙，产物中磷酸根含量为10.24%， 钙含量为17.31%。

实施例3

一种协同作用改性海带多糖的制备方法，步骤如下：

（1）在18-21℃条件下，将海带多糖、3-氨基-1-羟基亚丙基二膦酸二钠盐、尿素和氯化钙混合；其中，海带多糖、3-氨基-1-羟基亚丙基二膦酸二钠盐、尿素和氯化钙的质量比为1.0 ：0.7：0.12：12；

（2）将步骤（1）的混合物加热至55℃，反应7h，得反应混合物；

（3）向步骤（2）的反应混合物中加入蒸馏水，加热至50℃复溶；其中，反应混合物与蒸馏水的重量比为1：170；

（4）将步骤（3）所得溶液经过浓缩、乙醇沉淀、干燥，得到产物3-氨基-1-羟基亚丙基二膦酸海带多糖钙，产物中磷酸根含量为10.07%， 钙含量为18.25%。

实施例4

一种协同作用改性海带多糖的制备方法，步骤如下：

（1）在20-24℃条件下，将海带多糖、3-氨基-1-羟基亚丙基二膦酸二钠盐、尿素和氯化钙混合；其中，海带多糖、3-氨基-1-羟基亚丙基二膦酸二钠盐、尿素和氯化钙的质量比为1.0 ：0.8：0.10：9；

（2）将步骤（1）的混合物加热至60℃，反应7h，得反应混合物；

（3）向步骤（2）的反应混合物中加入蒸馏水，加热至60℃复溶；其中，反应混合物与蒸馏水的重量比为1：150；

（4）将步骤（3）所得溶液经过浓缩、乙醇沉淀、干燥，得到产物3-氨基-1-羟基亚丙基二膦酸海带多糖钙，产物中磷酸根含量为10.94%， 钙含量为17.08%。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。