一种利用液相色谱串联质谱检测鱼类小清蛋白的方法

摘要

本发明提出一种利用液相色谱串联质谱检测鱼类小清蛋白的方法，包括如下步骤：步骤1：特征肽段的选择；步骤2：制作标准曲线：以定量肽段标准品的浓度值为横坐标，以其定量子离子峰面积作为纵坐标绘制标准曲线，得到方程；步骤3：待测鱼肉样品经处理酶解后得到的上清液进行HPLC‑MRM‑MS/MS检测，得到鱼肉样品中定量肽段子离子峰面积，求得样品中定量肽段浓度，进而得到样品小清蛋白浓度。本发明目的在于建立一种液相色谱串联质谱方法，该方法具有准确、精密和灵敏等优点。

说明书

技术领域

本发明属于食品过敏原的检测方法，具体涉及一种液相色谱串联质谱检测鱼类主要过敏原小清蛋白的方法。

背景技术

目前国内外对鱼肉中小清蛋白的检测方法虽然有不少报道，主要有酶联免疫法(ELISA)、聚合酶链式反应法(PCR)及液相色谱串联质谱法(HPLC-MS/MS)。其中ELISA方法最为常用，它是根据抗原抗体特异性结合的原理，通过双抗体夹心法、间接法及竞争法等对过敏原进行定量检测，但是存在重复性和特异性较差的缺点：同一种但来自不同厂家ELISA试剂盒所测的结果差别较大，主要因抗体的来源及效价不同而导致；此外，食品中的基质干扰也会影响ELISA方法的准确性，当基质中含有其他能够与抗体结合的杂蛋白时，会出现假阳性，当基质中内源干扰物影响过敏原与抗体结合时则出现假阴性，尤其是在食品被加工后(蒸煮、油炸、高压)，过敏原被修饰，结构发生变化，致使其不能与抗体发生特异性结合。聚合酶链式反应法(PCR)通过检测特征DNA片段对过敏原进行定量检测，该方法与ELISA相比，特异性较强、灵敏度高、对样本纯度要求低，但是仍有一定的缺陷，如DNA在食品加工过程中易被降解分离；食品基质、加工过程中的交叉污染等会对PCR扩增过程抑制，易出现假阴性。

液相色谱串联质谱法检测过敏原利用液相系统对食品中不同的组分进行高效地分离，以减少基质的干扰，利用质谱电离技术对过敏原的特征肽段进行定性定量分析，很大程度上减少基质的干扰，防止出现假阳性和假阴性结果。目前为止，国内外利用液相色谱串联质谱方法检测鱼肉中小清蛋白的研究主要集中在对小清蛋白定性方面，定量方面的研究还未见报道。

小清蛋白是鱼类的主要过敏原，它是一种水溶性钙结合蛋白，分子量大约为12ku，等电点(pI)为3.9～5.5，存在不同的亚基，最常见的为α-小清蛋白和β-小清蛋白，其中β-小清蛋白是最主要的过敏原。

发明内容

为了解决现有技术中的问题，本发明提出一种利用液相色谱串联质谱检测鱼类小清蛋白的方法，包括如下步骤：

步骤1：特征肽段的选择，包括如下步骤：

⑴从NCBI和UniProt蛋白库搜索到小清蛋白氨基酸序列；

⑵将该氨基酸序列导入Skyline软件，模拟酶解过程，得到一系列肽段；

⑶选择物种同源性高，8-25个氨基酸的肽段，并且尽量避免易被修饰蛋白；

⑷将酶解后的肽段进行质谱检测，选择响应高、重复性好的肽段作为小清蛋白的定量肽段；

⑸将肽段进行化学合成，制备纯度高于95％的标准品；

步骤2：制作标准曲线：以标准品的浓度值为横坐标，以定量肽段的定量子离子峰面积作为纵坐标绘制标准曲线，得到方程，若线性范围广，可用log函数值作标准曲线；

步骤3：待测鱼肉样品经处理酶解后，将得到的上清液进行HPLC-MRM-MS/MS检测，得到鱼肉样品中定量肽段子离子峰面积，求得样品中定量肽段浓度，进而得到样品小清蛋白浓度。

进一步的，步骤3中鱼肉样品的处理酶解包括如下两步：

步骤3.1：待测样品处理：

将鱼肉与Tris溶液按照1：4比例混合匀浆，离心后取上清，90℃加热3min，离心取上清液；

步骤3.2：待测样品的酶解：

将上清液与0.1％的RapiGest SF以1：9的比例进行混合，加入10μL 100mM碘化乙酰胺溶液，避光37℃孵育45min，按酶与蛋白的质量比为1：10的比例加入胰蛋白酶，37℃酶解10h，加入1％甲酸停止酶解，离心后取上清，最终定容至200μL，进行HPLC-MRM-MS/MS检测。

进一步的，液相色谱条件：色谱柱：BEH C18 100mm×2.1mm；i.d.2.4μm；流动相：0.1％甲酸乙腈-0.1％甲酸水；流速：0.3mL·min-1；柱温：40℃；进样体积：10μL。

进一步的，质谱条件为：离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测；电喷雾毛细管电压：4000V；气体：氮气；干燥气温度：450℃；辅助气压力：45psi；雾化器气体压力：50psi；碰撞气压力：8psi；气帘气压力：30psi。

进一步的，当以牙鲆肉中β-小清蛋白为待测蛋白时，选择ALTDAETK，SDFIEEDELK和LFLQNFSASAR为其定性肽段，其中ALTDAETK为定量肽段。

进一步的，定量肽段ALTDAETK的标准曲线为：Y＝0.9738X+31449，其中，Y为log10(y)，X为log10(x)，标准品浓度的范围为0.10～1179.36nM。

本发明相对于现有技术所具有的优点为：

1.本发明目的在于建立一种液相色谱串联质谱方法，对鱼小清蛋白进行定量检测，选择不易被修饰的特征肽段为标准参考物，优化前处理提取、净化及酶解方法，消除蛋白结构变化、蛋白修饰及基质效应等对检测的影响，该方法具有准确、精密和灵敏等优点。

2.本发明根据小清蛋白具有热稳定的性质设计前处理方法，通过水浴加热去除鱼肉中的杂蛋白，以获得纯度较高的小清蛋白，减小其他蛋白对胰蛋白酶解及离子化过程的影响，提高检测的准确性，前处理方法简单、耗时短。

3.本发明通过对163种真骨鱼小清蛋白的氨基酸序列进行对比，找到同源性较高的区域(46-83)，在此区域内选择鱼小清蛋白最佳的特征肽段，肽段具有代表性强、易被酶解、响应高、稳定性强等优点。

4.本发明优化了小清蛋白的酶解条件，主要在变性剂的选择、RapiGest SF的浓度、酶与蛋白的质量比及酶解时间等方面进行优化，使胰蛋白酶对小清蛋白的酶解效率达到最大化。

5.本发明依据ICH Q2(R1)规定对线性曲线、精密度、灵敏度及准确度等进行验证，证明该发明线性关系好、线性范围广、灵敏、精密及准确。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1牙鲆鱼肉中β-小清蛋白离子色谱图；a，b和c分别为ALTDAETK、SDFIEEDELK和LFLQNFSASAR离子色谱图；

图2为大菱鲆鱼肉中β-小清蛋白的离子色谱图；

图3为ALTDAETK标准曲线；

图4为SDFIEEDELK标准曲线；

图5为LFLQNFSASAR标准曲线；

图6为ALTDAETK的子离子扫描图，定量离子对为424.7⁺⁺→664.3⁺；

图7为SDFIEEDELK的子离子扫描图，定量离子对为612.8⁺⁺→762.3⁺；

图8为LFLQNFSASAR的子离子扫描图，定量离子对为627.4⁺⁺→752.4⁺；

图9为酶解条件优化图；包括RapiGest SF浓度(a)、酶与蛋白比例(b)及酶解时间(c)的优化。其中，酶解时间图中，同一时间的三根柱从左至右依次为肽段ALTDAETK、SDFIEEDELK、LFLQNFSASAR。

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。

本发明中所涉及到的溶液百分浓度，除特别说明外均为质量百分浓度。

一、仪器和试剂

二、具体实施例

1.特征肽段选择：本发明参考标准品为待测蛋白的特征片段，选择步骤如下：

1.1从NCBI和UniProt蛋白库搜索到小清蛋白氨基酸序列；

1.2将该氨基酸序列导入Skyline软件，模拟酶解过程，得到一系列的肽段；

1.3选择物种同源性高(在46-83氨基酸序列范围内)，8-25个氨基酸的肽段，并且尽量避免含有半胱氨酸、蛋氨酸、精氨酸等易被修饰蛋白；

1.4将酶解后的肽段进行质谱检测，选择响应高、重复性好的肽段作为小清蛋白的定量肽段；

1.5本文以牙鲆的β-小清蛋白为待测蛋白，选择ALTDAETK，SDFIEEDELK和LFLQNFSASAR为其特征肽段，其中ALTDAETK为定量肽段；

1.6将肽段进行化学合成，制备纯度高于95％的标准品。

2.准备待测样品

2.1样品前处理

2.1.1准确称取1.0g牙鲆背部肌肉于10mL离心管中；

2.1.2加入4.0mL Tris溶液(含0.5mM甘氨酸和1.0mM DTT)，置漩涡混合器上涡旋30s，用均质器8000rpm/min均质2min；

2.1.3 12000×g 4℃离心20min，上清液转移至另一10mL具塞离心管中；

2.1.4将离心管放入水浴锅中，90℃加热3min，取出冷却；

2.1.5 12000×g 4℃离心20min，上清液转移至另一4mL具塞离心管中；

2.1.6利用BCA试剂盒测定上清液中的蛋白浓度。

2.2样品酶解

2.2.1准确吸取10.0μL上清液于0.5mL具塞离心管中，加入90.0μL 0.1％RapiGestSF，置漩涡混合器上涡旋1min；

2.2.2加入10.0μL 100.0mM IAA于离心管中，涡旋混匀，放入37℃水浴锅中避光孵育45min；

2.2.3加入一定量的胰蛋白酶，使得酶与蛋白质量比为1：10，37℃孵育10h；

2.2.4加入1％的甲酸，以终止酶解反应，并去除多余的RapiGest SF试剂，12000×g 4℃离心10min；

2.2.5取上清液于新的具塞离心管中，将溶液体积用5mM NH₄CO₃溶液定容至200uL，上机检测。

3.试验条件

3.1液相色谱条件

液相色谱条件：色谱柱：BEH C18 100mm×2.1mm；i.d.2.4μm；流动相：0.1％甲酸乙腈-0.1％甲酸水，梯度洗脱程序见表1；流速：0.3mL·min^-1；柱温：40℃；进样体积：10μL。

表1梯度洗脱程序

3.2质谱条件

质谱条件为：离子源：电喷雾离子源(ESI)；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测(MRM)；电喷雾毛细管电压：4000V；气体：氮气；干燥气温度：450℃；辅助气压力：45psi；雾化器气体压力：50psi；碰撞气压力：8psi；气帘气压力：30psi。肽段的保留时间和优化质谱条件见表2。

4.定量方法与定性方法

4.1.标准曲线的绘制

准确称取5.0g均质后的大菱鲆样品于50mL具塞离心管中，按照上述样品提取、净化和酶解后，得到空白基质提取液。用空白基质提取液将标准贮备液配制成不同浓度水平的标准工作液，进行HPLC-MRM-MS/MS检测，每个浓度点检测3次，取平均值。由于线性范围较大，所以各肽段的浓度的log值为横坐标(log10(x))，定量子离子的峰面积的log值为纵坐标(log10(y))，绘制标准曲线。以此作为测定牙鲆鱼肉中β-小清蛋白的定量曲线。

计算公式为：

C＝10^{(Y-3.1449)/0.9738}×M×20，C为小清蛋白浓度值(ug/L),Y为峰面积的lg值，M为小清蛋白的分子质量。

线性回归方程、线性范围和相关系数见表3，牙鲆和大菱鲆鱼肉中β-小清蛋白的离子色谱图分别见图1和图2，标准曲线分别见图3、图4、图5。

如图1所示，样品中检测到三条定性肽段的任意一条，则证明该样品中含有小清蛋白，图2所示，在大菱鲆鱼肉中未检测到目标肽段，可作为空白基质，用于方法学参数的验证。由图3-图5所示，在本发明条件下，线性范围广，标准品浓度在0.07～1179.36nM范围内，肽段定量子离子的峰面积(y)与其浓度(x)呈线性相关，且线性关系良好，相关系数均高于0.9994。

表3特征肽段的保留时间、线性回归方程、相关系数和线性范围

^a>

^b>

4.2检测限及定量限的确定

依照ICH Q2(R1)的规定，以特征肽段的定量子离子信噪比大于等于10(S/N≥10)时的浓度为定量限(LOQs)；以子离子信噪比大于等于3(S/N≥3)时的浓度为检出限(LODs)。用空白基质稀释液逐级稀释肽段标准溶液，经HPLC-MRM-MS/MS测定，计算得到检出限和定量限，如表4。

本发明方法所测的ALTDAETK、SDFIEEDELK和LFLQNFSASAR的LODs分别为0.027、0.022和0.035μg·g^-1、LOQs分别为0.101、0.074和0.121μg·g^-1，该方法灵敏度高，能够满足食品中过敏原的分析要求。

表4特征肽段的检出限与定量限

4.3精密度的测定

向大菱鲆鱼肉样品中加入目标肽段标准品，使得浓度分别为20.0、50.0和100.0μg·g^-1，按上述步骤进行提取、纯化及酶解后，上机检测。

日内精密度测定：在同日内不同时间用同一条标准曲线及同一台仪器3次重复测定三种不同浓度的样品，计算相对标准偏差求得日内(批内)精密度。

日间精密度测定：在一周内不同日以不同的标准曲线及同一台仪器3次重复测定三种不同浓度样品，计算相对标准偏差求得日间(批间)精密度。结果如下：

表5鱼肉中特征肽段的精密度(n＝3)

^aRelative>

在本发明中三种肽段在添加浓度20～100μg·g^-1范围内时，日内相对标准偏差均在2.39％～18.35％之间，日间相对标准偏差均在2.77％～16.09％之间，均小于20％，其中定量肽段ALTDAETK的日内、日间相对标准差均小于10％。表明该方法稳定可靠，完全能满足鱼肉中β-小清蛋白的检测要求。

4.4准确度的测定

准确度的测定是将克隆表达的β-小清蛋白按照上述的方法进行提取、净化及酶解后，HPLC-MRM-MS测定3次得到浓度；再应用BCA试剂盒测定重组β-小清蛋白的浓度，将两种方法测定的结果进行对比，差异小于20％，则说明该发明准确度高。

通过BCA试剂盒测定重组β-小清蛋白的浓度为1.3mg/mL，应用本发明的方法三次测的浓度分别为1.365mg/mL、1.127mg/mL和1.128mg/mL，对应的差异性分别为5％、13.3％和13.2％，均小于20％，该发明准确，能够满足小清蛋白的定量要求。

5.酶解条件优化

为使胰蛋白酶酶解效率最高，本发明分别对变性剂的选择、RapiGest SF的浓度、酶与蛋白的质量比及酶解时间进行了优化。如图9所示，作为最佳变性剂的RapiGest SF最佳浓度为0.1％，酶与蛋白的最佳比例为1：10，胰蛋白酶在第10h酶解效率达到最高。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。