用于在吻合术部位或其他生理部位产生胃肠道组织的系统和方法

摘要

本申请的方面涉及用于再生胃肠道组织(例如食管组织)的方法和合成支架。

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求于2015年11月12日提交的申请号为62/254700的美国临时申请以及于2016年1月8日提交的申请号为62/276/715的美国临时申请的优先权和权益，两个专利的全部公开内容通过引用结合到本文中。

技术领域

本申请涉及可用于替换或修复受损组织的工程化组织。

背景技术

用于替换或修复受损组织的工程化生物组织通常是通过在合成支架上接种细胞，并将细胞暴露于允许其在支架上合成和分泌细胞外基质成分的条件下制得。已经使用不同的技术来制备合成支架，包括：纳米纤维组装、铸造、打印、物理喷涂(例如使用泵和注射器)、静电纺丝、静电雾化和其他技术，这些技术沉积一种或多种天然或合成的聚合物或纤维以形成支架。该支架具有适合于移植入受试对象(例如，人类受试对象，例如，需要工程化组织的器官或区域)的合适的形状和大小。

据估计，全世界每年有超过50万人被诊断为食管恶性肿瘤。先天性食管畸形(Congenital malformations of the esophagus)如食管闭锁(esophageal atresia)的平均患病率(prevalence)为2.44/每1万名新生儿。食管损伤后产生的慢性食管狭窄(Chronicesophageal stricture)也很常见。虽然已经在最小化早期恶性疾病的食管切除范围方面取得了进展，如内镜下黏膜切除术(endoscopic mucosal resection)，但许多食管疾病的主要治疗手段还是外科食管切除术。通常，收集自体导管(autologous conduits)如胃、小肠或结肠并被改道放入胸腔中，以恢复胃肠道的连续性。许多患有食管闭锁的患儿或受到创伤或食管腐蚀性损伤影响的患者最终都会进行类似的重建。但这些治疗方法具有高发病率和死亡率。

由于食管结构复杂，通常使用自体导管(autologous conduits)。食管的多层结构是由复层鳞状上皮(stratified squamous epithelium)、黏膜下层(submucosa)和外环肌层(outer circular muscle layer)和纵肌层(longitudinal muscle layer)组成，食管的多层结构为遏制口腔的摄入和在胃肠道外逸出的污染物提供了屏障。此外，在食团(bolus)通过时，或者在吞咽或呕吐期间，该组合层提供了推进的生理机制，及应激管理。

提供能够支持组织再生的结构以及制造该结构的方法将是可取的。

发明概述

本申请公开了涉及能够产生胃肠道组织(例如，食管组织、胃组织、肠组织、结肠组织或其他中空胃肠道组织)的合成支架极其相关系统的实施方式。在一些实施方式中，支架为受试对象的胃肠道(例如食管)组织生长和再生提供引导。在一些实施方式中，再生的胃肠道组织包括肌肉组织、神经系统组织、或肌肉组织和神经系统组织。在一些实施方式中，胃肠道(例如食管)组织在支架周围再生。在一些实施方式中，支架未被融合至最终的再生组织中(例如，新的食管组织没有将支架融合至再生的食管壁中)。因此，本申请公开的方面涉及引导组织的再生，其中支架为促进宿主组织再生提供支持和/或信号，且不需要将支架融合至再生组织中(例如，在最终的再生组织中，无需支架提供结构或功能上的支持)。

在一些实施方式中，胃肠道(例如食管)支架包括生物可降解和/或生物再可吸收材料，这些材料在胃肠道(例如食管)组织再生开始后(例如，在功能性食管组织再生之后)被再吸收。

在一些实施方式中，胃肠道(例如食管)支架包括一个或多个结构，所述结构可在胃肠道(例如食管)组织再生开始后(例如，在功能性食管组织再生之后)用于帮助移除支架。

在一些实施方式中，支架包括一端部，相对于支架的所述端部的相对一端的内径，所述端部具有增大的内径。

在一些实施方式中，支架包含抗反流(anti-reflux)系统。在一些实施方式中，所述抗反流系统包括阀门。在一些实施方式中，所述抗反流系统包括中空结构(例如，管状结构)，所述中空结构延伸至具有增大的内径的支架端部的边缘外。在一些实施方式中，所述抗反流系统的中空结构(例如，管状结构)被设置成在胃内延伸。

在一些实施方式中，在支架植入前，用一种或多种细胞类型将支架细胞化(cellularized)。在一些实施方式中，所述细胞为自体细胞。在一些实施方式中，所述细胞为祖细胞(progenitor cells)或干细胞。在一些实施方式中，所述细胞从骨髓、脂肪组织、食管组织或其他合适的组织中获得。在一些实施方式中，所述细胞可以从各种同种异体来源中获得，包括但不限于诸如羊水、脐带血等的来源。在一些实施方式中，所述细胞是间充质干细胞(MSCs)。

在一些实施方式中，将支架植入于可以提供足够用于再生受试对象中组织的干细胞龛(stem cell niche)的部位(例如，提供干细胞龛的食管或其他胃肠道部位)。在一些实施方式中，不希望受理论约束，支架和/或在支架上提供的细胞有助于促进胃肠道组织的生长和/或再生，胃肠道组织来源于支架植入部位处存在的宿主干细胞。

在一些方面，本申请涉及通过合成支架的存在，可以促进或增强食管组织生长的发现，所述合成支架被工程化以替代或修复病变或受伤的组织或器官的天然结构模式和/或功能特性，而不需要将支架完全整合到最终的再生组织中。因此，在一些方面，本申请提供了用于促进或增强胃肠道(例如食管)组织生长的方法，所述方法包括：将合成支架递送至受试对象的胃肠道(例如食管)区域，其中合成支架的递送促成受试对象该区域的新的胃肠道(例如食管)组织的生长。在一些实施方式中，在植入支架之前去除(例如，通过手术去除)病变或受损的胃肠道区域。在一些实施方式中，支架是被植入的大致管状结构(例如，在去除病变或受损组织后，将支架缝合到剩余胃肠道组织的末端)。在一些实施方式中，植入的支架比被去除的组织短(例如，短5％-50％)。在一些实施方式中，当组织附着(例如缝合)在支架的两端时，植入物部位附近的剩余胃肠组织被拉伸。在一些实施方式中，新的胃肠道(例如食管)组织在植入的支架上再生而不与支架完全融合。在一些实施方式中，尽管支架可以保留在再生组织的内腔(lumen)内，但再生组织的壁不会融合至支架的壁。在一些实施方式中，可以在组织再生过程中的合适时间点将支架从由再生组织形成的内腔中移除。

在一些实施方式中，新的胃肠道(例如食管)组织的生长引起功能组织(例如功能性食管)的形成，其不需要支架继续存在并发挥功能。

在一些实施方式中，合成支架在生理条件下是可被再吸收的或可被溶解的。在一些实施方式中，在形成功能性食管后，将合成支架从受试对象的胃肠道(例如食管)区域移除。

在一些实施方式中，本文所述的方法和组成也可用于气管和/或支气管组织的再生。

这些方面和其他方面将在本申请中进行更详细地描述。

附图说明

结合附图阅读以下详细描述可以最好地理解本申请。需要强调的是，根据惯例，图中的各种特征不是按比例绘制的。相反，为了清楚起见，各种特征的尺寸被任意扩大或缩小。

图1A是本申请公开的合成支架的一个实施方式的透视图，其中部分呈现局部横截面；

图1B是本申请公开的合成支架的一个实施方式的管表面的显微照片；

图1C是本申请公开的合成支架的第二实施方式的侧面透视图；

图2是食管的生物膜层的非限制性描述；和

图3示出了与相应的天然组织比较的再生食管组织的非限制性实例；

图4A是本申请公开的合成支架的一个实施方式的外表面区域的SEM显微照片，显示了在放大倍数为5000X下生物反应7天后的细胞生长情况；

图4B是本申请公开的合成支架的一个实施方式的外表面区域的显微照片，显示了生物反应7天后的细胞生长情况；

图5是本申请公开的再生方法的一实施方式的过程图；

图6是本申请公开的方法的一实施方式的整体研究流程，所述方法包括细胞化的支架的生产和后续的植入；

图7A是根据本申请公开的一实施方式的静电纺丝支架的样品的SEM图，SEM图的放大倍数分别为1000X，2000X和5000X；

图7B是根据本申请公开的一实施方式的静电纺丝支架植入前和植入后的代表性单轴力学试验加载的图示；

图7C是根据本申请公开的一实施方式制备的植入前和植入后支架的单轴力学性能表；

图8是从脂肪组织中分离并增殖多达5代的MSC的流式细胞术的示意图；

图9是根据本申请公开的一实施方式的植入手术的概述图；

图10是根据本申请公开的过程的一实施方式的时间轴的表示；

图11A至C为在术后限定的时间间隔内，位于测试对象的食管切除部位处的再生管状组织内部的再生组织的照片；

图12A至E为在术后限定的时间间隔内，位于测试对象的食管切除部位处的再生管状组织内部的再生组织的照片；

图13A至K是食管组织的组织学分析的照片；

图14A至K是植入本申请公开的支架2.5个月后，猪食管组织的组织学分析照片；

图15A和15B是本申请公开的合成的管状支架的替代实施方式的透视图，该合成的管状支架包括增大端和抗反流系统；

图16A、B和C是15A和15B的合成的管状支架的透视图，该合成管状支架位于和植入胃食管连接部(gastroesopageal junction)；

图17A、B、C和D是图16的植入的合成的管状支架的底部透视图。

发明详述

本申请的方面部分涉及以下显著发现：将合成支架插入到受试对象的食管区域，可以促进或增强受试对象中新食管组织(例如，完整和功能性的食管)的再生，且没有将支架完全融合到再生组织中。因此，在一些实施方式中，本申请提供了一种用于促进或增强胃肠道(例如食管)组织生长的方法，所述方法包括：将合成支架递送至受试对象的胃肠道(例如，食管)区域，其中合成支架的递送会促成受试对象该区域的新胃肠道(例如，食管)组织的生长。

使用本申请所述的方法再生的组织可以是任何胃肠道组织，例如食管、胃、肠、结肠、直肠或其他中空胃肠道组织。在一些方面，本申请在某种程度上基于令人惊讶的发现，即本申请描述的方法促成包含肌肉组织、神经系统组织、或肌肉组织和神经系统组织的胃肠道组织的再生。

在一些实施方式中，合成支架在生理条件下(例如，在大致对应于组织再生所需时间的时间段内)是可被再吸收的或可被溶解的。在一些实施方式中，在合适的生理条件下，至少一部分的支架是可被再吸收的或可被溶解的。

在一些实施方式中，在形成再生功能组织(例如，食管或其一部分)之后，将合成支架从受试对象中移除。

在一些实施方式中，支架被设计成可容易取回的，通过具有a)一种或多种比缝合线更容易去除的可逆附件，例如在组织再生后，帮助支架与周围组织(例如食管)分离；和/或b)例如在支架与周围组织(例如相邻食管组织)分离之后，可用于帮助取回支架的一个或多个特征。

可逆附件的非限制性示例包括机械装置(例如钩和环、连接器例如支撑架或可分离的其他机械附件)和/或化学装置(例如生物可降解或可吸收附件和/或可以通过化学手段或酶促手段选择性去除的附件)。在一些实施方式中，可以使用可吸收钉。在一些实施方式中，可吸收钉包含例如聚乳酸-聚乙交酯的共聚物或任何其他可吸收材料的共混物。

在一些实施方式中，手术植入和/或取回支架可以在胸腔镜辅助下进行。

可帮助取回或移除支架(例如，在支架与周围胃肠道组织分离之后)的结构特征的非限制性实例包括孔洞、锯齿、凸起或其他结构特征或其任何组合，这些结构特征仅位于支架的外表面上。可以使用这些结构特征中的一种或多种来帮助抓住或握住正被用于取回支架的工具(例如抓手)。在一些实施方式中，这些结构特征中的一种或多种可以仅位于支架的一端(例如，位于靠近受试对象口腔的端部)。在一些实施方式中，这些结构特征中的一种或多种可以位于支架的两端或遍布在整个支架的长度方向。在一些实施方式中，这些结构特征中的一种或多种仅位于支架的外表面上。在一些实施方式中，这些结构特征中的一种或多种仅位于支架的内表面上。在一些实施方式中，这些结构特征中的一种或多种位于支架的外表面和内表面上。在一些实施方式中，在用于取回支架的一种或多种结构特征的位置处或附近加固支架(例如，使支架更厚和/或支架包括更坚固的材料)。

在一些实施方式中，分离的支架可以在内窥镜辅助下，经由通向食管的气道腔移除。在一些实施方式中，可以通过手术移除分离的支架。

在一些实施方式中，受试对象具有需要被替换的病变(例如，癌症)或受损的胃肠道组织。在一些实施方式中，受试对象是人(例如，人类患者)。

在一些实施方式中，本申请提供了可用于替换或修复食管或其一部分的工程化支架。在一些实施方式中，本申请所述的食管支架可用于促进组织再生(例如再生食管或其一部分)以替换受试对象(例如人)中的组织。例如，患有某些癌症(例如食管癌)的受试对象(例如人)可以受益于受癌症影响的组织或器官的替换。不希望受到任何特定理论的束缚，本申请所述的合成支架促进受试对象中新组织(例如食管组织)的生长，并因此为受试对象提供治疗益处。

在一些实施方式中，新的食管组织的生长促成受试对象中形成功能性食管。在一些实施方式中，新的食管组织不会将支架融合至再生的食管壁中。在一些实施方式中，支架被设计和制造成在食管组织再生后可被吸收和/或容易取回的。在一些实施方式中，支架被设计成至少部分可被吸收的。

在一些实施方式中，胃肠道中其他位置的新的胃肠道组织的生长引起特定位置的功能性胃肠道组织的形成。在一些实施方式中，新的胃肠道组织不会将支架融合至再生的胃肠壁中。在一些实施方式中，支架被设计和制造成在胃肠道组织再生后可被吸收和/或容易取回。在一些实施方式中，支架被设计为至少部分可被吸收的。

在一些实施方式中，合成支架的尺寸和形状近似于要被替换的病变或受损的胃肠道(例如食管)区域的尺寸和形状。

在一些实施方式中，支架将至少有两层。在某些实施方式中，支架可以具有近似管状的结构。图1A示出了支架10的非限制性实施例，支架10具有近似管状的主体12，主体12具有外表面14和内表面16。在一些实施方式中，支架10的横截面大致为圆形。在一些实施方式中，横截面大致为“D”形。然而，可以使用具有其他横截面形状的支架10。根据相应的再生组织的大小，支架10可以具有任何合适的长度和直径。在一些实施方式中，在某些实施例中，支架10的长度可以是约1-10cm(例如3-6cm，例如约4cm)，或者在其他实施例中，长度可以是10-20cm。然而，可以预期的是，根据具体应用、患者的需要和/或胃肠道中的需要治疗的位置，可以使用更短或更长的支架10。在一些实施方式中，支架10可以具有0.5-5cm的内径。然而，根据具体应用、患者的需要和/或胃肠道中的需要治疗的位置，可以使用具有更小或更大内径的支架。

在一些实施方式中，近似管状的支架的每个端部(例如，靠近受试对象口腔的端部和远离受试对象口腔的端部)的内径不相等。例如，在一些实施方式中，近似管状的支架的内径沿着支架的长度方向增加(例如，具有增大直径的一端，也被称为“增大端”)，从而形成“钟形”或“喇叭形”支架。然而，应该理解，具有增大直径的近似管状的支架的端部可以是任何形状，包括但不限于圆柱形、椭圆形、锥形、立方形、钟形和喇叭形。图15提供了内径沿支架长度方向增加的近似管状的支架的非限制性实例。支架的任一端(例如靠近或远离受试对象的口腔)可以具有增大的直径。

在一些实施方式中，管状支架的增大端的内径比支架的非增大端的内径大约0.1cm-2cm。在一些实施方式中，管状支架的增大端的内径比支架的非增大端的内径大约0.1cm、0.2cm、0.3cm、0.4cm、0.5cm、0.6cm、0.7cm、0.8cm、0.9cm、1.0cm、1.1cm、1.2cm、1.3cm、1.4cm、1.5cm、1.6cm、1.7cm、1.8cm、1.9cm或2.0cm。在一些实施方式中，管状支架的增大端的内径范围为约2cm-约5cm。在一些实施方式中，支架的增大端内径为约2cm、约2.5cm、约3.0cm、约3.5cm、约4.0cm、约4.5cm或约5cm。可以与合成支架同时制造(例如，通过静电纺丝制造为合成支架的一部分)增大端或单独制造增大端，并将其整合到预制的合成支架中。

在一些实施方式中，具有增大直径的支架的端部被构造成有利于通过吻合术(anastomosis)将再生组织(例如，再生的食管组织)附着到目标组织(例如，胃组织)上。

非常出人意料地发现，如图15A和15B所示的合成支架200的实施方式可以有利地用于提供支架，所述支架帮助邻近胃肠器官例如胃等的管状器官组织的再生生长。

在一些实施方式中，支架10,200的总长度可以比被替换的胃肠道(例如，食管)区域的长度短。在一些实施方式中，支架10的长度为被替换的组织长度的50％-95％(例如，约50％-60％、60％-70％、70％-80％、80％-90％、约80％、约85％、约90％或约95％)。不受任何理论的束缚，据信，相关胃肠道区域的某些区域可以对施加在相关器官组织上的牵引力作出积极响应，从而产生某些生物-有机介导的信号，所述信号引发或促进组织生长和分化。

在一些实施方式中，支架10,200的长度可以比被替换的胃肠道(例如，食管)区域的长度长。在一些实施方式中，支架10的长度为被替换的组织长度的100％-150％(例如，约100％-110％、110％-120％、120％-130％、130％-140％、约100％、约105％、约110％、或约115％)。预期支架的长度将是有效替换受影响区域所必需的长度。在某些情况下，预期支架10将具有比被替换的胃肠道区域更长的长度，以有效定位支架并减少或最小化受影响或相关区域中的创伤和缺血。

在一些实施方式中，支架10可以由单层合成材料组成。然而，在本申请的范围内，支架10还可以包括多于一层的合成材料。

因此，在一些实施方式中，合成支架10可以由多层(例如2层或更多层，例如2、3、4、5层或更多层)组成。在一些实施方式中，一层或多层由相同的材料制成。在一些实施方式中，不同的层由不同的材料(例如，不同的聚合物和/或不同的聚合物排布)制成。如本申请所公开的合成支架10,200可以包含两种或更多种不同组件，当存在这些组件时可以将其组装形成所述支架(例如在细胞化和/或植入之前)。在一些实施方式中，合成支架10包括彼此接触的两层或更多层，如通过用于制造支架10的合成技术使层彼此接触。在一些实施方式中，可以使用一项技术来合成支架10，该技术涉及使两层或更多层放在一起的几个步骤(例如，将静电纺丝材料层设置在先前制造的支架的一部分上，例如先前的静电雾化材料层，先前的静电纺丝材料层，纳入至支架中的不同部件(例如编织管或网状物)的表面，或其两种表面或更多种表面的组合)。

在如图1A所示的实施方式中，支架10包括至少一个限定支架主体12的外表面14的外层18。支架10,200包括至少一个额外的向内取向层20。在所示的实施方式中，至少一个额外的向内取向层20与外层18的向内取向的表面直接接触。在期望或需要的情况下，至少一个向内取向层20可设置成为相关的支架主体12提供结构支撑。在图1A所示的实施方式中，至少一个向内取向层20可以被设置为合适的网状物或编织物，所述网状物或编织物周向定位于支架主体12的纵向长度方向上的至少一部分。在其他实施方式中，可以预期，至少一个向内取向层20可以由合适的聚合物层构成。在如图1A所示的实施方式中，支架10的主体12包括至少一个层22，所述层22位于网状物20或编织物层20的内部。

在期望或需要的情况下，支架10可具有大致均匀的壁厚。然而，在一些实施方式中，壁厚可以在主体12的特定区域处变化。在一些实施方式中，支架10的主体12的一个或两个端部24,26处的壁厚与支架10的中部28(未示出)的壁厚不同(例如端部24,26处的壁厚比中部28的壁厚更厚)。在一些实施方式中，当支架连接到周围的胃肠道组织时，较厚的壁区域更坚固并且为连接到支架10的一个或两个端部24,26的缝合线提供了更好的支撑。较厚的壁区域也可以包括有利于缝合的不连续结构。这种结构的非限制性示例包括管、孔等。

在某些实施方式中，至少在外层18上限定的外表面14可以由静电纺丝聚合物材料构成。在某些实施方式中，可以预期，向外取向的壁18可以由静电纺丝聚合物材料构成。在某些实施方式中，向外取向的静电纺丝层可以与合适的编织材料层20直接接触。

在一些实施方式中，支架的一端或两端的壁厚与支架的中部的壁厚不同(例如，例如端部处的壁厚比中部28的壁厚更厚)。在一些实施方式中，较厚的壁区域更坚固并且为支架端部的缝合线提供更好的支撑。

在一些实施方式中，合成支架包含抗反流系统。如本申请所用，“抗反流系统”是指用于防止反流(例如限制单一方向的流动)的系统。例如，在再生胃肠道组织(例如食管组织)已经与目标组织(例如胃组织)吻合的情况下，在一些实施方式中，需要通过限制胃所含物流向再生的食管组织来防止反流。在一些实施方式中，抗反流系统包括阀(例如，单向阀、止回阀、挡板阀、尖瓣阀、半月形尖瓣阀)，所述阀被设置为最小化或防止胃液或酸性流体从胃流出并，例如，进入食管。

在一些实施方式中，抗反流系统是延伸至具有增大直径的端部的中空结构外。在一些实施方式中，中空结构具有与合成支架的内腔邻接的内腔(例如，允许所含物(contents)通过支架并进入吻合的组织例如胃的内腔)。中空结构可以是任何合适的形状，包括但不限于圆柱形、椭圆形、立方形、锥形、钟形和喇叭形。在一些实施方式中，抗反流系统的内径比支架的非增大端内径大约0cm(例如，相同尺寸下)、0.1cm、0.2cm、0.3cm、0.4cm、0.5cm、0.6cm、0.7cm、0.8cm、0.9cm、1.0cm、1.1cm、1.2cm、1.3cm、1.4cm、1.5cm、1.6cm、1.7cm、1.8cm、1.9cm或2.0cm。在一些实施方式中，抗反流系统的内径为比支架的非增大端的内径小约0cm(例如相同尺寸)、0.1cm、0.2cm、0.3cm、0.4cm、0.5cm、0.6cm、0.7cm、0.8cm、0.9cm、1.0cm、1.1cm、1.2cm、1.3cm、1.4cm、1.5cm、1.6cm、1.7cm、1.8cm、1.9cm或2.0cm。

包括增大端的合成支架可以以一种方式安装到目标组织(例如胃)上，使得增大端设置在目标组织的顶部上，且中空结构(例如，抗反流系统)延伸到增大端的边缘之外并进入目标组织(例如胃)的内腔，且基本上不接触目标组织的壁。在一些实施方式中，抗反流系统由可压缩的或可变形的(例如可延展的)材料形成，例如软塑料或其他聚合物。

在图15A和15B所示的实施例中，支架200具有主体部210。主体部210具有第一端212和与第一端相对的第二端214。主体部210还具有构造成管状构件216的至少一个部分和构造成喇叭形构件218的至少一个部分。喇叭形构件218连续地连接至管状构件216并且喇叭形构件218位于主体部210的第一端212附近或第二端214附近。在某些实施方式中，主体部210包括向外取向的表面220。向外取向的表面220具有至少一个由聚合物纺丝纤维构成的区域。在某些实施方式中，聚合物纺丝纤维的平均纤维直径为15nm-10μm，聚合物纺丝纤维的至少一部分互相连接以形成平均直径小于50μm的孔。

在某些实施方式中，合成支架200还包括管状构件区域222，所述管状构件区域222从由喇叭形构件218限定的内部区域向外延伸。在某些实施方式中，管状构件区域222可以相对于管状构件216同轴设置。在某些实施方式中，管状构件区域222可以在由喇叭形构件218限定的内部区域中延伸。

在期望或要求的情况下，聚合物纺丝纤维为静电纺丝。聚合物纤维可以互相连接并且可以形成主体部的外层。在某些实施方式中，主体部可以包括至少一个内层。在某些实施方式中，内层可以由聚合物网状物、聚合物编织支撑材料、固体聚合物构件和静电纺丝层中的至少一种构成，所述静电纺丝层具有与内层重叠接触的外层。静电纺丝材料的平均纤维直径为3-10μm，并且由以下聚合物材料中的至少一种组成：聚偏氟乙烯、间规聚苯乙烯、偏氟乙烯和六氟丙烯的共聚物、聚乙烯醇、聚醋酸乙烯酯、聚丙烯腈、聚丙烯腈和丙烯酸的共聚物、聚丙烯腈和甲基丙烯酸酯的共聚物、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚氯乙烯共聚物、聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸甲酯共聚物、聚对苯二甲酸乙二醇酯的共聚物、聚氨酯。

在某些实施方式中，至少一个层是包含聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚氨酯或聚对苯二甲酸乙二醇酯和聚氨酯共混物的聚合物材料。在某些实施方式中，可以存在编织物层或网状物层。在某些实施方式中，编织物层或网状物层可以由聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚氨酯、镍钛诺中的至少一种组成。

合成支架200可以是可移动的，并且可以由至少一个鞘层(sheath layer)组成，鞘层由细胞材料组成，细胞材料由存在于限定层中的间充质细胞和干细胞组成，限定层的厚度为1-100个细胞厚。鞘层的细胞材料可覆盖在存在于外表面上的静电纺纤维上，使得细胞材料包含在外表面上并跨越本文本申请限定的孔。

合成支架200还可以包括靠近第一端和第二端中的至少一端的至少一个孔、锯齿、凸起或它们的组合，在受试对象中植入部位的支架周围发生组织再生之后，或者将合成支架植入受试对象体内某个位置之后，这些结构适于帮助从受试对象中取回至少一个支架。

纤维取向

静电纺丝纤维可以是各向同性的或各向异性的。在一些实施方式中，不同层中的纤维可以具有不同的相对取向。在一些实施方式中，不同层中的纤维可以具有基本相同的取向。另外，纤维取向可以在复合支架或三明治式支架的每一层中改变。

在一些实施方式中，可以使用具有不同孔隙率的支架。在一些实施方式中，支架的一层或多层允许基本上完全的细胞渗透和均匀接种。在一些实施方式中，可以构建一层或多层支架，以防止一种或多种类型细胞的渗透，例如，通过密集地包装纤维。由于孔隙率随纤维直径的变化而变化，控制纤维直径可用于改变支架孔隙率。或者，可以将不同聚合物的共混物静电纺丝在一起，并优先溶解一种聚合物以增加支架孔隙率。可以控制纤维的性质以优化纤维直径、纤维间距或孔隙率，每种纤维的形态，如纤维的孔隙率或长径比(aspectratio)，将纤维的形状从圆形变为带状。在一些实施方式中，可以例如通过改变纤维组成和/或降解速率来控制或优化每根纤维的机械性能。

在某些实施方式中，静电纺纤维材料可以提供如图1B所示的起伏表面。在某些实施方式中，支架10中的至少一个静电纺丝层可以是聚合物纤维材料，例如聚碳酸酯型聚氨酯(polycarbonate polyurethane)，聚碳酸酯型聚氨酯可以通过将聚碳酸酯-聚氨酯溶解在经旋转干燥后的合适溶剂例如六氟异丙醇(HFIP)中来制备。

静电纺丝纤维材料的间距和孔隙率可以是这样的，使得接种在支架表面上的细胞可以在各纤维之间以悬浮的层叠关系粘附，以允许接种的细胞材料在其上形成如图4A和4B所示的片材。

合成支架的成层

本申请的这方面涉及用于生产合成支架的方法。在一些实施方式中，在心轴上(例如通过静电雾化和/或静电纺丝来沉积材料)制备管状合成支架(例如合成食管支架)。

在一些实施方式中，合成支架的一层或多层为支架提供结构支撑，赋予支架期望的机械性能。在一些实施方式中，可以在支架的两个不同层之间插入编织材料(例如，编织管、例如镍钛诺编织物、PET编织物或其他金属或非金属材料的编织物)以提供结构支撑。编织材料的压力(例如，编织物可以施加在下一层材料上的力，例如施加在外部静电纺丝层的材料上的力)可以通过控制编织物的经纬密度(pick count)来控制。在一些实施方式中，可以在有机溶剂中涂布(例如，通过浸渍或其他技术)编织物以帮助将编织物附着到支架10的一个或多个其它层。在一些实施方式中，编织物20的长度不延伸至支架主体12的端部。在一些实施方式中，支架10的一端或两端由不具有编织层的两层或更多层材料构成，而支架主体12的中部28包括附加的编织层。

在一些实施方式中，合成支架的一层或多层在支架中提供屏障，在内部空间(例如腔空间)与外部空间之间产生间隔(例如，相对不可渗透的间隔)。在一些实施方式中，屏障可以是静电雾化的聚氨酯(PU)层。

在一些实施方式中，支架10的不同层可以包括一种或多种聚合物(例如，聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、PU或其混合物)。在一些实施方式中，支架10可以包括夹在内部PU层(例如，静电雾化或静电纺丝到心轴上形成的)和外部PU层(例如，静电雾化到编织材料上形成的)之间的镍钛诺编织物。

在某些实施方式中，支架10可以使用支架支撑件或心轴形成。在一些实施方式中，在沉积一层或多层PU、PET或其组合材料之前，可以用材料(例如，PLGA或其他聚合物)涂覆支架支撑件或心轴。

在某些实施方式中，编织物层或网状物层中的材料可以由可吸收的聚合物材料组成。

支架的生产

在一些实施方式中，通过纳米纤维组装、铸造、打印(例如3D打印)、物理喷涂(例如使用泵和注射器)、挤出成型、静电纺丝或静电雾化来制造管状支架(例如合成的食管支架)。也可以使用其他适当的方法。

支架生产-纤维材料

在一些实施方式中，支架的一层或多层可由纤维材料构成。在一些实施方式中，支架包含一种或多种类型的纤维(例如纳米纤维)。在一些实施方式中，支架包含一种或多种天然纤维、一种或多种合成纤维、一种或多种聚合物或其任何组合。应该理解，不同材料(例如不同纤维)可以用于本申请所述的方法和组成(即支架)中。在一些实施方式中，该材料具有生物相容性，因此可以支持细胞生长。在一些实施方式中，该材料是永久性的、半永久性的(例如，在植入宿主中后持续数年)或可快速降解的(例如，在植入宿主中后数周或数月内被吸收)。

在一些实施方式中，该支架包含静电纺丝材料(例如，微米纤维或纳米纤维)或由其组成。在一些实施方式中，静电纺丝材料包含PET(聚对苯二甲酸乙二醇酯(有时书写成聚(对苯二甲酸乙二醇酯))或由其组成。在一些实施方式中，静电纺丝材料包含聚氨酯(PU)或由其组成。在一些实施方式中，静电纺丝材料包含PET和PU，或由PET和PU组成。

在一些实施方式中，人造支架可以由以下材料中的一种或多种组成或包含以下材料中的一种或多种：弹性聚合物(例如，一种或多种聚氨酯(PU)，例如，聚碳酸酯和/或聚酯)、丙烯酰胺聚合物、尼龙、可再吸收材料(例如，PLGA、PLA、PGA、PCL)、合成或天然材料(例如蚕丝、弹性蛋白、胶原、碳、明胶、壳聚糖、透明质酸等)或其任何组合。在一些实施方式中，支架可以由以下材料组成或包含以下材料：加聚物和/或缩聚物材料，如聚烯烃、聚缩醛、聚酰胺、聚酯、纤维素醚和酯、聚亚烷基硫化物、聚亚芳基氧化物、聚砜、改性聚砜类聚合物及其混合物。在一些实施方式中，支架可以由以下材料组成或包含以下材料：聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯(和其它丙烯酸树脂)、聚苯乙烯及其共聚物(包括ABA型嵌段共聚物)、聚偏氟乙烯、聚偏氯乙烯、交联和非交联形式的不同水解度(例如87％-99.5％)的聚乙烯醇。在某些实施方式中，该聚合物还可以包括可增加该聚合物的亲水性的其他化合物或方法。在某些实施方式中，这可涉及结合化合物，例如基于环氧乙烷和环氧丙烷的嵌段共聚物。预期地，如果期望或需要，可通过合适的等离子体处理来提高聚合物的亲水性。

在一些实施方式中，支架可以由嵌段共聚物组成或包含嵌段共聚物。在一些实施方式中，加聚物如聚偏氟乙烯、间规聚苯乙烯、偏氟乙烯和六氟丙烯的共聚物、聚乙烯醇、聚乙酸乙烯酯、无定形加聚物如聚丙烯腈及其与丙烯酸和甲基丙烯酸酯的共聚物、聚苯乙烯、聚氯乙烯及其各种共聚物、聚(甲基丙烯酸甲酯)及其各种共聚物和PET(聚对苯二甲酸乙二醇酯(有时书写成聚(对苯二甲酸乙二醇酯)))可以进行溶液纺丝(solution spun)或静电纺丝，并与本申请公开的任何其他材料组合以产生支架。在一些实施方式中，高度结晶的聚合物如聚乙烯和聚丙烯可以进行溶液纺丝或与本申请公开的任何其它材料组合以产生支架。

在一些实施方式中，在支架合成之后、但在支架细胞化和/或植入之前，改性一种或多种聚合物以降低它们的疏水性和/或增加它们的亲水性。

在某些实施方式中，静电纺丝纤维可具有不超过10μm的直径。在某些实施方式中，静电纺丝纤维可以具有3-10μm的直径。在某些实施方式中，静电纺丝纤维可具有3-5μm的直径。

在某些实施方式中，预期地，编织层中的材料可全部或部分地由诸如PLGA等的生物可吸收材料制成。还可以预期地，在某些构造中，编织材料可以是可以促进和/或支持组织生长和再生的负载材料和化合物。此类化合物和材料的非限制性实例包括以下物质中一种或多种：抗生素、生长因子等。

静电纺丝

在一些实施方式中，生产支架，该支架包括通过静电纺丝产生的一层或多层(例如，PU和/或PET)。静电纺丝材料可用于各种应用，包括作为组织工程的支架。静电纺丝聚合物的合适方法可以包括在以下文献中描述的那些方法：Doshi和Reneker.Electrospinningprocess and application of electrospun fibers.J Electrostat.1995；35:151–60.；Reneker DH,Chun I.Nanometer diameter fibers of polymer produced byelectrospinning.Nanotechnology.1996；7:216–23；Dzenis Y.Spinning continuousfibers for nanotechnology.Science.2004；304:1917–19；或Vasita andKatti.Nanofibers and their applications in tissue engineering.IntJ.Nanomedicine.2006；1(1):15-30；其中涉及静电纺丝的内容通过引用结合到本申请中。静电纺丝是一种通用技术，可用于生产任意取向或排列的纤维，纤维基本上具有从纳米等级(例如，约15nm)到微米等级(例如，约10μm)范围内的任何化学组成和直径。

在一些实施方式中，本申请使用的静电纺丝和静电雾化技术涉及使用高电压电场以对通过喷嘴递送的聚合物溶液(或熔体)(例如，作为聚合物溶液的射流)进行充电并沉积在目标表面上。目标表面可以是静电板表面、转鼓(例如心轴)表面或导电且电接地的其他形式的收集器(collector)表面，使得带电聚合物溶液朝着所述表面移动。

在一些实施方式中，所采用的电场通常为几千伏的量级，并且喷嘴与目标表面之间的距离通常为几厘米或更远。聚合物溶液的溶剂在离开喷嘴和到达目标表面之间过程中蒸发(至少部分地蒸发)。这导致聚合物纤维沉积在表面上。典型的纤维直径范围为从几纳米到几微米。目标表面相对于喷嘴的运动会影响纤维的相对取向。例如，如果目标表面是旋转心轴的表面，则纤维将沿旋转方向在表面上排列(至少部分地)整齐。在某些情况下，可以在旋转心轴的两端之间来回扫描喷嘴。

在一些实施方式中，聚合物纤维的尺寸和密度，纤维对齐的程度以及静电纺丝材料的其它物理特性可受以下因素的影响，所述因素包括但不限于：聚合物溶液的性质、喷嘴的尺寸、电场、喷嘴与目标表面之间的距离、目标表面的性质、喷嘴与目标表面之间的相对运动(例如，距离和/或速度)以及可影响溶剂蒸发和聚合物沉积的其他因素。

静电纺丝和静电雾化工艺可用于在心轴上生产互相连接的聚合物纤维支架(例如，中空合成支架)。

支撑件/心轴

在一些实施方式中，支架10(例如，具有两层或更多层的支架)可以使用可在其上形成支架10的支撑件(例如，实心的或中空的支撑件)来生产。例如，支撑件可以是静电纺丝收集器，例如心轴、或管、或任何其他形状的支撑件。应该理解，支撑件可以具有任何尺寸或形状。然而，在一些实施方式中，支撑件的尺寸和形状被设计成用来产生支架，该支架将支撑具有与在宿主中被替换或补充的胃肠道组织(或其一部分)相同或相似尺寸的人造组织。应该理解，静电纺丝的心轴应该具有导电的表面。在一些实施方式中，静电纺丝心轴由导电材料(例如，包括一种或多种金属)制成。然而，在一些实施例中，静电纺丝心轴包括覆盖非导电的中心支撑件的导电涂层(例如，包括一种或多种金属的导电涂层)。

非常意外地发现，安置合适的编织材料以将其整合到所形成的支架10中靠近芯轴表面的位置处，可以用作便于解除所形成的支架10与心轴接触的辅助物。

支架性能

应该理解的是，本申请的方面可用于增强任何支架的物理和功能特性，例如基于静电纺丝和/或电喷涂纤维的支架。在一些实施方式中，一个或多个支架部件可以是具有不同尺寸的薄片、圆柱体、厚肋拱、实心块、分支网络等或其任何组合。在一些实施方式中，一体和/或组装的支架的尺寸与被替换的组织或器官的尺寸相似或相同。在一些实施方式中，支架的单个部件或层具有较小的尺寸。例如，纳米纤维层的厚度可以从几纳米到100纳米、1-1000μm、或甚至几毫米。然而，在一些实施方式中，一个或多个支架部件的尺寸可以约1mm至50cm。然而，如本申请所述，可以制造更大、更小或中等尺寸的结构。

在一些实施方式中，支架形成为管状结构，所述管状结构为可以与细胞一起接种以形成管状组织区域(例如食管或其他管状区域)。应该理解，管状区域可以是具有均匀直径的圆柱体。然而，在一些实施方式中，管状区域可具有任何合适的管状形状(例如，包括沿着管状区域的长度方向具有不同直径的部分)。管状区域也可以包括一个分支或一系列分支。在一些实施方式中，制备在一端、两端或多个端部(例如，在分支支架的情况下)具有开口的管状支架。然而，管状支架可以在一端、两端或全部端封闭，本发明的各方面在这方面不受限制。还应该理解，因为本发明在这方面不受限制，本发明的方面可以用于产生适用于任何类型的器官(包括中空和实体器官)的支架。在一些实施方式中，本发明的方面可用于增强支架或其他结构的稳定性，所述支架或其他结构包括两个或更多个非物理连接的纤维区域或纤维层(例如静电纺丝纳米纤维)。

在一些实施方式中，支架被设计成具有多孔表面，所述多孔表面具有直径在约10nm-约100μm范围内的可促进细胞化的孔。在一些实施方式中，孔的平均直径为小于50μm、小于40μm、小于30μm、小于20μm或小于10μm(例如，约5μm、约10μm或约15μm)。在一些实施方式中，孔的平均直径为20-40μm。在一些实施方式中，选择合适的孔径以防止或减少受试对象中的免疫应答或其他不需要的宿主应答。可以使用计算和/或实验技术(例如使用水银孔隙仪法(Porosimetry))来估计孔径大小。但是，应该理解的是，所述支架的多孔表面也可以包括其他尺寸的孔。

在一些实施方式中，使用纤维合成支架的表面层，所述纤维包含一种或多种可溶解的颗粒，所述可溶解的颗粒可在合成期间或之后溶解(例如通过暴露于溶剂、水溶液，例如水或缓冲液)，留下可溶解颗粒尺寸大小的孔洞。在一些实施方式中，聚合物混合物中包含颗粒，所述聚合物混合物被泵送到静电纺丝装置的喷嘴中。结果是，颗粒与纤维一起沉积。在一些实施方式中，静电纺丝过程被设置成沉积厚的纤维(例如，具有数微米的平均直径，约10μm和更大的平均直径)。在一些实施方式中，如果纤维以密集的模式沉积，一种或多种纤维在固化之前会合并以形成更大的微结构(例如，10-100μm厚或更厚)。在一些实施方式中，这些微结构可以缠绕两层或更多层的纤维和/或来自支架的两种或更多种不同部件的部分(例如纤维)，从而增加支架的机械完整性。在一些实施方式中，当在支架合成期间(例如，连接两个或更多个层和/或部件)的一个或多个阶段形成这种微结构(例如，通过如本申请所述的静电纺丝形成)时，可以对微结构的表面(例如，进行蚀刻或使用本申请所述的可溶性颗粒制成多孔)进行处理以提供适合于细胞化的表面。

在一些实施方式中，两个或更多个结构部件(例如，环)之间、单个连续结构部件的结构部件(例如，弧形构件)之间和/或编织的支撑材料之间的柔性支架材料的量(例如，松弛部分)可以用于确定合成支架的机械性能(例如抗拉强度、延伸率、转动、压缩、活动范围、弯曲度、阻力、柔量、自由度、弹性或任何其他机械性质、或其组合)。

在某些实施方式中，支架10还可以包括源自繁殖期间接种在支架外表面上细胞的细胞鞘。细胞鞘附着于支架的外表面并与其重叠。可以预期，存在于细胞鞘中的大部分细胞将连接到外表面的最外层表面并且将跨越本申请限定的孔，以形成连续或大体上连续的表面。

在某些实施方式中，细胞鞘可具有足以为鞘层提供结构完整性的厚度。在某些实施方式中，细胞鞘将由多个与支架外表面接触的细胞组成，这足以引导再生细胞与鞘接触以产生覆盖鞘但不与其一体化的组织壁。在某些实施方式中，鞘可以由平均厚度在1-100个细胞之间的膜组成。某些实施方式中，膜的厚度可以为10-100个细胞之间、10-30个细胞之间、20-30个细胞之间、20-40个细胞之间、20-50个细胞之间、10-20个细胞之间、30-50个细胞之间、30-60个细胞之间、40-60个细胞之间、40-70个细胞之间、70-90个细胞之间。

具有相关联的细胞鞘的支架10提供了可移动的可插入装置，其可以定位在合适的胃肠道切除部位中。支架10可被运送到期望的切除部位以进行植入，所述支架具有与其相接触的相关联的细胞鞘。在某些实施方式中，支架10被构造成在切除的器官适当再生之后可从植入部位移除。在某些实施方式中，移除的支架将包括与其连接的一些或全部的细胞鞘。

本申请还公开了管状器官诸如胃肠道器官的再生方法的各种实施方式。在某些实施方式中，方法100包括切除受试对象中的管状器官的一部分的步骤，如标号110所示。待切除的器官可能为因疾病损伤、创伤或先天条件而受损或损害的胃肠道的管状器官。在某些实施方式中，合适器官的非限制性实例包括食管、直肠等中的一种。在某些实施方式中，合适的器官包括食管、小肠、结肠和直肠中的至少一种。

可以通过任何合适的外科手术来实现切除，并且产生切除后的器官部分，其在切除后保持连接至胃肠道并保留在受试对象体内。在某些实施方式中，切除操作可以产生合适的切除边缘。

在切除完成后，将合成支架植入到切除部位，如标号120所示。在某些实施方式中，植入可以包括将保留在受治疗者体内的切除后器官的相应端连接到合成支架的相应端的步骤，使得合成支架和切除后器官可以在相应构件之间实现合适的接合。这可以通过一种或多种缝合线、生物有机组织胶等来实现。

在某些实施方式中，植入的合成支架可以是管状构件，所述管状构件具有聚合物外表面和覆盖聚合物外表面的至少一部分的细胞鞘层。已经讨论了合成支架的各种实施方式并且可以在本申请公开的方法中使用和利用。在某些实施方式中，合成支架将包括第一端、与第一端相对的第二端，位于第一端和第二端之间的聚合物外表面以及覆盖聚合物外表面的至少一部分的细胞鞘层。在某些实施方式中，植入步骤可以是使细胞鞘层的至少一部分与切除后的器官部分的至少一个切除边缘直接接触的步骤。

在某些实施方式中，本申请公开的方法还包括如下步骤：将合成支架在切除部位中保持一段时间，以沿着合成支架实现引导的组织生长，如标号130所示。在某些实施方式中，引导的组织生长来源于保留在受试对象体内的切除后的器官部分中存在的组织并与其接触。在某些实施方式中，引导的组织生长将与切除后的器官的相关区域邻接。在某些实施方式中，引导的组织生长将显示出分化的组织。在某些实施方式中，在细胞鞘层外部的位置处，所述引导的组织生长与细胞鞘层的外表面平行。在某些实施方式中，引导的组织生长来源于保留在受试对象体内的切除后的器官部分中存在的组织并与其接触，并且将与切除后的器官的相关区域邻接。引导的组织生长将表现出分化的组织生长，并且可以在细胞鞘层外部的位置处与细胞鞘层的外表面平行。

在已经实现引导的组织生长之后，本申请所公开的方法100可以包括移除合成支架的步骤，如标号140所示。在某些实施方式中，移除步骤以使得引导的组织生长与保留在受试对象中的器官的切除后部分保持接触的方式发生。在某些实施方式中，移除过程可以包括通过内窥镜从引导的组织生长的内部移除合成支架。

在某些实施方式中，合成支架可全部或部分地由生物可吸收聚合物材料构建。在这种情况下，本申请公开的方法可以包括以下步骤：保持合成支架与切除边缘之间接触一段时间，以足够实现沿引导组织沿着合成支架生长，使得合成支架的至少一部分在在切除部位被融合足够的一段时间，以沿着所述合成支架实现引导的组织生长。在其中支架完全由生物吸收材料组成的某些实施方式中，支架将被构造为在引导组织生长期间维持结构的完整性。在某些实施方式中，在合成支架在选定区域由生物可吸收材料组成的情况下，可预期地，在实现在引导的组织生长完成后，可以通过合适的步骤除去支架的剩余部分。

可以通过合适的手段监测引导的组织生长。在某些实施方式中，可以在内窥镜下监测组织生长。

在本申请公开的方法的某些实施方式中，所述方法还可以包括：将细胞材料引入到合成支架的聚合物表面上，并允许细胞材料生长以形成细胞鞘层的步骤，该引入和允许细胞材料生长的步骤发生在所述切除步骤之前。

在某些实施方式中，在本申请公开的方法中使用的合成支架是外表面包含纺丝聚合物纤维的管状构件。在某些实施方式中，纺丝纤维可以通过诸如本申请中描述的那些适合的方法进行静电纺丝。在某些实施方式中，细胞鞘层跨越位于外部的静电纺丝纤维的至少一部分。细胞鞘层可以由细胞材料组成，细胞材料包括间充质细胞、干细胞和多潜能细胞(pluripotent cells)中的至少一种。细胞材料可以从受试对象自体衍生或可以异体衍生。

不受任何理论的束缚，据信，植入诸如本申请中公开的各种合成支架，特别是接种有覆盖的细胞鞘的合成支架促进了受试对象组织的生长、再生和分化，受试对象组织接触或邻近合成支架的植入位置。生长的再生组织由合成支架和相关鞘引导，以产生管状细胞主体，该细胞主体整体连接至剩余管状器官的切除端，并向外扩张以封装合成支架和相关联的细胞鞘层。据信，支架和相关的细胞鞘层可以促进或刺激切除后组织的再生生长，同时使组织排斥反应最小化。还相信，细胞鞘层的存在可以减少或最小化再生组织在生长和分化过程中对鞘层的渗透。在某些实施方式中，组织再生从各个端部向中间进行。一旦再生组织就位，合成支架可以被移除。在某些实施方式中，一经移除合成支架后，再生的组织结构将缺乏内部上皮层。移除支架后，已观察到内上皮层再生。

为了进一步理解本申请，请参考以下实施例。设置这些实施例是为了说明的目的，并且将被认为是对本申请和权利要求书中阐述的发明内容的说明。

实施例

实施例I：食管支架

如图1A所示，制备包含三层材料的合成食管支架。通过静电雾化将第一层聚氨酯(PU)沉积到金属心轴上，然后将编织材料沉积在第一PU层上，然后通过静电纺丝沉积形成第二PU层。然后将所得的支架从心轴上取下。每个支架限定为具有包括三层(静电雾化内层、静电纺丝外层和夹在静电雾化内层和静电纺丝外层之间的编织物层)的壁的管状结构。通过扫描电子显微镜(SEM)测定支架的物理尺寸。支架平均壁厚约为500μm。图1B中示出了壁的横截面的非限制性SEM图。图1C中示出了管状支架的一横截面的非限制性目视图像。该图显示横截面大致为“D”形。这可以通过使用具有“D”形横截面的心轴来获得。

静电纺丝外层是限定有孔的聚合物纤维层。外层中的平均纤维直径约为3-6μm。平均孔径约为15-20μm，中值孔径约为25-45μm。

将支架连接到能够在生物反应器腔室内的液体介质浴中旋转的支撑件上。旋转机构可以包括磁力传动器，其允许支撑件连同与其连接的支架围绕其纵向轴线在液体浴内旋转。

通过将细胞溶液沉积在支架的外表面上，以在支架接种上细胞(例如MSC或其他干细胞)。然后通过将接种的支架在生物反应器腔室内的液体培养基浴中旋转大约一周，以将接种的支架在支持细胞生长的液体培养基中孵育。所得到的支架包括与支架的外表面重叠的细胞鞘。在某些实施方式中，细胞鞘可具有足以为鞘层提供结构完整性的厚度。在某些实施方式中，细胞鞘将由多个与支架外表面接触的细胞组成，以足够引导再生细胞与鞘接触以产生覆盖鞘但不与其融合的组织壁。在某些实施方式中，鞘可以由平均厚度在1-100个细胞之间的膜组成。某些实施方式中，膜的厚度可以为10-100个细胞之间、10-30个细胞之间、20-30个细胞之间、20-40个细胞之间、20-50个细胞之间、10-20个细胞之间、30-50个细胞之间、30-60个细胞之间、40-60个细胞之间、40-70个细胞、70-90个细胞之间。

将具有接种的细胞鞘的支架10植入到切除部位，并且可以被定位在适当位置。可以预期，鞘中存在的种子细胞(seeded cells)可以在植入后继续生长。在这种情况下，鞘中存在的种子细胞将维持和支撑与植入部位处的再生组织分开并串联的结构。

然后将相应的支架植入猪的食管部位。切除大约5cm的食管部分，并用支架部分代替，所述支架部分被缝合到受试对象中剩余食管组织的端部。

用内镜监测食管组织的再生，并监测数周时间。

食管是具有颈部、胸部和腹部的长肌肉管。图2是示出人体中的食管(esophagus)的横截面的图。在成年人中，食管的长度可以是18cm-25cm。食管壁由上部的横纹肌(striated muscle)、下部的平滑肌(smooth muscle)以及中部的横纹肌和平滑肌两者的混合物组成。因此，在一些实施方式中，本申请提供的是多层合成支架可以促进对应于天然食管组织层的具有两层或更多层的食管组织的修复和再生。

图3显示了将食管支架植入猪后的1-2周，天然和再生食管组织的染色横截面。横截面显示基本上所有的食管组织层(包括不同的肌肉层和腺体层)的再生。对再生组织的进一步分析显示，支架本身未融合至再生的食管壁中。支架仍然存在于食管内，但支架起到刺激食管再生的引导作用，而不是成为再生食管的组成部分。

实施例II：食管植入

如图1A所示，制备含有三层材料的合成食管支架。将聚碳酸酯-聚氨酯以12％w/v溶解于六氟异丙醇(HFIP)(美国，特拉华州，威尔明顿，杜邦公司)中，将形成的溶液沉积得到食管支架中的聚碳酸酯-聚氨酯静电纺丝外层。所使用的静电纺丝设备可从荷兰海尔德罗普的IME技术公司商购获得。将静电纺丝纤维收集在以800rpm旋转的目标铝心轴上，并将目标铝心轴放置在离注射器尖端22mm的距离处，以沉积各向同性纤维以产生平均壁厚为500μm的支架。将支架真空干燥以除去残余溶剂。然后使用低压等离子体系统(DienerTetra 150-LF-PC-D)，用2次顺向的乙烯和氧气循环对支架进行等离子体处理。将支架进行γ射线灭菌(马萨诸塞州，诺斯伯勒，思泰瑞公司(STERIS))。γ射线施加的剂量范围是25-35KGy。

所得管状物为由静电纺丝聚氨酯组成的聚合物支架，所述聚合物支架的均一外径(OD)为22mm，长度为11cm。

通过扫描电子显微镜(Zeiss-EVO MA10)分析静电纺丝纤维的形态。在8×10^-2毫巴(mbar)的气压和300V的电势下，使用溅射镀膜机将支架样品用铂和钯溅射并镀膜2分钟(Cressington-208HR，加利福尼亚州，雷丁，TED>

在三个植入前和三个植入后的支架上进行通过单轴力学载荷的拉伸测试(图7B)，均显示出类似的体内载荷值结果。六个样品在体内载荷的一致性表明，支架在制造和体内植入后具有较低程度的可变性(图7B，C)。六个支架的平均(±SD)拉伸应变(tensilestrain)范围介于119.5±1.61mm至124.5±3.44mm之间。在断裂拉伸应变方面，植入前样品的拉伸应变为397.38％±5.52％，植入后为408.61％±17.64％。高于400％的应变值表明制造工艺的可靠性和相对的体内稳定性。植入前和植入后支架的断裂拉伸应力(Tensilestress at failure)分别为7.25±0.59MPa和4.43±0.77MPa。因此，植入前样品的杨氏模量(Young’s modulus)大于植入后样品的杨氏模量，尽管两组在体内应力的弹性都相当(图7B，C)。断裂载荷(load at failure)遵循与杨氏模量相同的趋势，其中植入前的断裂载荷值大于植入后的断裂载荷值。

在开放式脂肪活组织检查之后，从8头猪中分离出源自自体猪脂肪(Autologousporcine adipose)的间充质干细胞(aMSC)，并分析其特征。在侧腹壁取得无菌、开放式脂肪组织活检之前，对8只尤卡坦小型猪(Yucatan mini-pigs)进行全身麻醉和用洗必泰(chlorhexidine)备皮。在腹白线旁边产生5cm的切口，使用电灼术实现止血。分离出大约30-50g的脂肪组织，并转移到含有α-最低必需培养基(MEM)/glutamax培养基(马萨诸塞州，沃尔瑟姆，赛默飞世尔科技)和1％青霉素/链霉素(赛默飞世尔科技)的50mL锥形管中。

从每只麻醉的尤卡坦小型猪(50-60kg体重)通过手术切除20-60g腹部脂肪组织。将组织样品在α-最低必需培养基(MEM)/glutamax培养基(赛默飞世尔科技)和1％青霉素/链霉素(Thermo Fisher Scientific)中洗涤3次。将清洗后的组织修剪以除去淋巴结和血管，并切成小于5mm的碎片。将组织碎片在消化缓冲液(300IU/mL II型胶原酶、0.1％牛血清白蛋白(7.5％，第五组份(fraction V))、1％青霉素/链霉素、αMEM/glutamax))于37℃、5％CO₂下解离55分钟。在完全生长培养基(StemXVivo，(明尼苏达州，明尼阿波利斯，R&DSystems)和1％青霉素/链霉素)中终止解离后，将细胞以1500rpm离心15分钟。将细胞沉淀重悬于5mL生长培养基中，并通过70μm的过滤器过滤。将细胞滤液以1500rpm离心5分钟。将细胞沉淀重悬于5mL生长培养基中，并根据组织重量接种细胞(每个含有20mL生长培养基的T75烧瓶中加入3g脂肪组织分离物)。

用不含钙或镁的PBS(赛默飞世尔科技)洗涤细胞2次，并使用TrypLe(赛默飞世尔科技)解离细胞。用生长培养基终止解离，细胞以1000rpm离心5分钟。将细胞沉淀重悬于用PBS稀释的1％的牛血清白蛋白中。将1百万个细胞的等分试样在4℃和在黑暗中在抗体中温育30分钟(见补充表1)。标记的细胞用缓冲液中洗涤3次，根据需要在4℃在黑暗中施用二抗(加利福尼亚州，卡尔斯巴德，生命技术公司)30分钟。再洗涤3次后，将细胞悬浮液置于96孔板中，用流式细胞术(Guava easyCyte HT，马萨诸塞州，比尔里卡，EMD Millipore)分析。基于生存能力测量，对代表活细胞的事件(events)在正向散射和侧向散射值上进行门运算(ViaCount，EMD Millipore)。采用荧光补偿事件对未染色样品和同型对照的抗体染色的样品进行细胞类型分析。将采集的数据导出，并通过独立软件(FlowJo版本10，俄勒冈州，阿什兰，FlowJo,LLC)进行分析。

为评估菌落形成，如上所述分离出脂肪细胞，捣碎成单个细胞悬液，并稀释成10个细胞/mL的生长培养基。向96孔板(纽约州，康宁，康宁公司)的每孔中加入100μL的该细胞悬液，第二天目视检查细胞数。5-7天后，可见细胞菌落，且每3天更换一次培养基直至该菌落至少含有50个细胞。对存在菌落的孔进行计数，并表示成其与总孔数的百分比。

分离出的脂肪细胞的多能性是通过它们受化学诱导形成脂肪和成骨的能力来测定。将细胞分别接种于6孔组织培养板中，在完全生长培养基中培养，并允许细胞分别生长至用于细胞脂肪分化的60％汇合度或用于细胞成骨分化的100％汇合度。在达到汇合度时，将培养基替换成脂肪分化培养基或成骨分化培养基(CCM007,明尼苏达州，明尼阿波利斯，R&D Systems)。每2天更换一次培养基，直至培养14天。对在脂肪分化培养基中培养的细胞进行油红O(加利福尼亚州，洛代，American MasterTech)染色以鉴定脂肪，对在成骨分化培养基中培养的细胞进行茜素红(EMD Millipore)染色以鉴定钙沉积。

在接种时和接种2、5天和7天后，测定生物反应器中的条件培养基中葡萄糖和乳酸的浓度(iSTAT,新泽西州，普林斯顿，Abbott公司)。

对细胞上清液进行分析以确定猪细胞因子和生长因子的产生，可在Luminex 200平台上通过多重分析法分析，或在明尼苏达大学细胞因子参考实验室，按照制造商的指示，通过采用市售试剂盒进行ELISA分析。13丛(plex)的猪专用珠板(EMD Millipore)用于测定猪VEGF、GM-CSF、IL-1RA、IL-6和IL-8水平。从各板产生的标准曲线中插入数值，可采用适用于Luminex平台的伯乐(BioPlex)软件(伯乐公司(BioRad),加利福尼亚州，赫拉克勒斯)，或者采用适用于在BioRad 550读板器上读取的ELISA板的酶标仪管理软件来产生标准曲线。对所有样品进行重复测试。

将细胞在PBS中洗涤，并在室温下用10％福尔马林固定15分钟。在含0.1％的Triton X-100的PBS(PBS-T)中轻轻洗涤细胞3次，并将细胞于稀释在PBS-T中的10％正常山羊血清(Vector)中室温孵育1小时。将兔抗巢蛋白抗体(Biolegend,1:100)稀释在10％正常山羊血清和PBS-T中，于4℃下过夜孵育。将细胞在PBS-T中漂洗两次，并将其在荧光标记的羊抗兔抗体(Alexa Fluor 594,赛默飞世尔科技)中室温孵育1小时。漂洗细胞2次，并用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)进行复染。

在37℃下复染48小时后，将细胞在含钙和镁的磷酸盐缓冲液(赛默飞世尔科技)中洗涤2次，并用新鲜的生长培养替换。之后，每2天更换一次培养基，直至烧瓶达到70％—80％汇合度。在传代时，解离细胞(TrypLe，赛默飞世尔科技)、计数(Countess，赛默飞世尔科技)，并将其以200000细胞/每瓶的量重新接种到T175瓶中。

将每个11cm长的支架置于生物反应器中，并在补充有0.1875％碳酸氢钠(赛默飞世尔科技)、MEM(Lonza)和在0.01M盐酸中的1.19mg/mL牛胶原蛋白(Organogenesis)的生长培养基中3200万个细胞(存活率>70％，台盼蓝排染法，Countess，赛默飞世尔科技)进行接种。将细胞在37℃、5％CO₂下孵育5分钟，然后向该生物反应器中缓慢加入200mL的培养基。将生物反应器在支架植入前孵育7-8天。每2天更换培养介质，并进行如下文描述的各种分析。

将猪aMSCs接种到已表征过的支架上，随后置于生物反应器中进行孵育。然后将接种的支架植入到以下食管切除后的尤卡坦小型猪中，3周后移除支架(图6)，并采用用于阳性染色的已知的MSC标记物抗猪-CD44、CD73、CD90、CD105和CD146抗体，及用于阴性染色的CD14、CD45、CD106、CD271和SLA Class II DR进行重复染色。超过95％的培养细胞被巢蛋白和αSMA阳性染色，这表明在培养过程中保持干细胞特性。多能性是通过化学诱导猪MSC分离菌分别形成脂肪细胞和成骨细胞的能力来测定。对这些aMSCs进行常规扩增，对第1至第5代进行表征，它们表现出一致的表型和功能特征。

将第2代的猪aMSCs接种到聚合物支架上，并在生物反应器中于37℃下培养7天(+/-1天)。采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定细胞因子和生长因子的数量，以确定在支架上培养的接种aMSCs是否分泌可能有助于血管生成和免疫调节的因子。测出条件培养基中的细胞分泌物血管内皮生长因子(VEGF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素(IL)-6、IL-8和IL-1RA仅在中等以上水平(图4A)。然而，对其他的细胞因子TNF-α、IL-1α、IL-1β、INF-γ、IL-10、IL-12、IL-18、血小板衍生生长因子(PDGF)、调节活化正常T细胞表达和趋化因子(RANTES)进行了测定，但未检测出。

在7天的培养时间结束时，对接种的移植物的切片进行穿刺活检(punchbiopsies)，以评估细胞的健康状况和对支架的渗透情况。通过采用钙黄绿素(活细胞)和溴化乙锭(死细胞)的免疫荧光染色法来评估细胞健康状况。采用用以细胞鉴定的溴化乙锭来评估该支架的细胞渗透性。通过活检标本的钙黄绿素染色的主导现象(predominance)表明了附着在支架上的活细胞种群。在支架活检的横截面上，大多数细胞附着在支架表面。尽管有一些证据表明了在支架内的细胞增殖和生长。在生物反应器孵育过程中，每48小时测量一次移植物的代谢活性，以测定葡萄糖摄取量和乳酸生成量。条件培养基的测量一致表明，随着时间的推移葡萄糖水平减少和乳酸水平增加，这是持续代谢的细胞生长的两个指标。此外，将在生物反应器中7天内的细胞扩增用总DNA含量进行量化，发现总DNA含量在生物反应器细胞接种过程中增加了几倍。培养7天后支架上细胞表型的进一步鉴定显示，细胞持续表达α-平滑肌肌动蛋白(αSMA)和巢蛋白。

在对动物进行气管内插管和全身麻醉诱导后，将动物以左侧卧位放置。剪去毛发，用洗必泰或聚维酮碘进行备皮，并对动物进行无菌覆盖。在每个动物的第四肋间高度上进行标准右侧开胸手术，并进入胸腔。通过使用双腔气管导管来实现单肺通气。周向移动位于中胸段(右肺门后方)的一个4-4.5cm的食管段，将其切除以产生6cm的缺损(近端和远端的组织收缩)。然后采用聚对二氧环己酮(PDS,新泽西州，萨默维尔，美国强生爱惜康公司)可吸收缝合线将接种的支架(6cm长)植入并吻合到食管近端和远端。在植入后，在直接内窥镜指导下(Storz Video Gastroscope Silver Scope 9.3MM X 110CM,德国，图特林根)置入市售食管支撑架(WallFlex M00516740,波士顿科学公司)。在内窥镜和手术可视化情况下进行支撑架置入。用可吸收缝线将食管支撑架固定于正常食管组织，处于在近端支撑架和远端支撑架处。

术后动物是通过胃造瘘术灌食(gastrostomy feeding)来辅助支持，并经饲管保持流质饮食2周，捣碎的饮食再2周，然后允许口服固体食物，之后继续进行研究。

植入支架约21天后，内窥镜下取回该支架，采用aMSC灌注的富血小板血浆(PRP)凝胶以提高新生食管导管的愈合过程。在采用PRP之后，将一个新的全覆盖食管支撑架(WallFlex^TM,长12cm>

还通过内窥镜检查来评估再生进展。在支架拆除后，内窥镜观察植入区近3-4周；示出了2个代表性动物(图10和图11)。植入3-4周后，仅部分完成了黏膜层(mucosal layer)的再生。然而，在2层融合前，黏膜层的近端和远端形成初始脊，及完整的黏膜再生(mucosalregeneration)指示了食管愈合过程随时间推移继续进行。食管连贯性和完整性的早期重建，及从切除部分两个对边的黏膜下层(submucosa)的随后生长在所有八种动物中都是一致的；2只动物可存活至术后8个月和9个月，且这2只动物分别在2个月、3个月内没有食管支撑架而无狭窄迹象，且它们有持久的口服摄入量及显著的体重增加。

为了确定再生和天然的食管组织形态的组织学相似性。术后2.5个月从代表性的猪食管中取出组织样本，并对包括手术部位和邻近的远端(distal)和近端(proximal)组织进行组织学检查(图13A，虚线框表示组织学分析标本)。苏木精-伊红(图13B和图13D)染色和马松(Masson)三色(图13C和图13E)染色的组织切片的代表图片显示了组织完整的多层食管上皮细胞、黏膜下层及正常内肌层形态。

来自再生区域的代表性免疫组织化学分析证明了2.5个月时Ki67的免疫反应性(图14F)，暗示了黏膜细胞(mucosal cells)和黏膜下层细胞(submucosal cells)CD31(图14G)、CD3ε(图14H)、αSMA(图14I)、转凝蛋白(transgelin)/SM22α(图14J)的继续增殖，及手术部位处的组织中横纹肌肌球蛋白重链(striated myosin heavy chain，striated MHC)(图14K)的相对缺失。αSMA、SM22α的主导现象及与肌球蛋白重链的相对缺失表明：平滑肌增殖先于骨骼肌生长。

接种有自体衍生的间充质干细胞(aMSCs)的合成基质，导致切除后的食管的充分纵向再生及最小的黏膜溃疡(mucosal ulceration)或穿孔(perforation)(表1)。在移除植入物后，所有的动物自2-9周经历了100％的充分纵向再生，6只动物中只有1经历了粘膜溃疡或穿孔。在研究过程中没有动物经历过泄漏(leak)。

表I

实施例III-具有增大端的管状支架

将例如图15A和图15B所示的包括增大端的管状支架植入到猪中的胃食管连接部。图16显示了在猪体内的支架周围生长的再生组织。图16显示了再生组织延伸到支架的增大端。图17表明在支架上生长的再生组织的内径约为2.2cm。

实施例IV-其他胃肠道应用

可以取代局限于直肠的胃肠道区域来实施实施例I和II中概述的过程。结果与之前概述的结果类似。

这里已经描述了关于本申请的多个方面的若干实施例，应该理解，本领域技术人员将容易想到各种改变、修改和改进。这样的改变、修改和改进旨在成为本申请的一部分，并且旨在落入本申请的精神和范围内。因此，前面的描述和附图仅作为示例。

如本说明书和权利要求书中使用的词“一”和“一个”，应理解为“至少一个”，除非有明确的相反指示。

如本说明书和权利要求书中所使用的短语“和/或”，应理解为连接在一起的两个元素中的“一个或两个”，即，在某些情况下两种元素是结合地存在，在其他情况下是分别存在。除“和/或”从句明确指出的元素外，还可选择性地存在其他元素，无论它们是否与明确指出的这些元素相关或无关，除非明确指明相反的意思。因此，作为一个非限制性的例子，“A和/或B”，当与开放式语言(如“包含”)结合使用时，在一实施方式中可指“有A无B”(可选地包括除B以外的元素)，在另一实施方式中可指“有B无A”(可选地包括除A以外的元素)，在又一实施方式中可指“A和B”(可选地包括除A、B以外的元素)等。

如本说明书和权利要求书中所使用的“或”，应理解为具有与上面定义的“和/或”相同的含义。例如，当与一列表中的项(item)区分时，“或”或“和/或”应被解释为包含，即，包含若干元素或元素组中的至少一个，但也包括一个以上，且可选地包括其他未列出的项。只有明确指出相反意思的术语，例如“只有一个”或“确切的一个”，或者当在权利要求中使用“由……组成”时，将指确切地包括若干元素或元素组中的一个元素。一般来说，本文所使用的术语“或”在排它性术语(例如“或”、“…中的一个”、“仅…中的一个”、“只有…中的一个”或“基本由…所组成”)之前时，其仅被解释为表示排他性选择(即，一个或另一个，但不能两个都有)。当在权利要求书中使用时，应当具有专利法领域所使用的一般性含义。

如本说明书和权利要求书中所使用的，关于一个或多个元素的组的短语“至少一个”，应当理解为从元素组中的任何一个或多个元素中所选择的至少一个元素，但不一定包括元素组中具体列出的每一个元素，且不排除元素组中元素的任何组合。除元素组中明确指出的元素外，该定义还允许可选地存在与那些明确指出的元素相关或无关的其他元素。因此，作为一个非限制性的例子，“A和B的至少一个”(或等同于“A或B中的至少一个”、或等同于“A和/或B中的至少一个”)，在一实施方式中可指“至少一个，可选地包括不止一个A而无B存在(可选地包括除B以外的元素)”；在另一实施方式中可指“至少一个，可选地包括不止一个B而无A存在(可选地包括除A以外的元素)”；在又一实施方式中可指“至少一个A(可选地包括不止一个A)和至少一个B(可选地包括不止一个B)”(可选地包括除A、B以外的元素)等。

在权利要求书中及上述说明书中，所有的过渡性短语，例如“包括”、“包含”、“携带”、“具有”、“含有”、“涉及”、“容纳有”等，应当被理解成是开放式的，即，是指“包括但不限于”。如美国专利局专利审查程序手册第2111.03条所阐述的，只有过渡性短语“由…组成”和“基本由…组成”应分别被理解成封闭或半封闭的过渡短语。

权利要求书中用于修饰声称元素(claim element)的序数词(诸如“第一”、“第二”、“第三”等)的使用，本身并不暗示任何优先权、优势、或一个声称元素相对于另一个声称元素的次序、或执行一方法的时间顺序，但仅仅用作来区分具有一确切名字的一声称元素与具有相同名称的另一个声称元素(但为了使用序数术语)的称号。

虽然已经结合某些实施方式描述了本公开，但可以理解的是，本申请并不限于所公开的实施方式，相反，本申请旨在涵盖在所附权利要求的范围内的各种改进和等效变形，所附权利要求的范围应得到最广泛的解释，以便包括法律允许下的所有这些改进和等效结构。