一种检测黄曲霉毒素B1的复合材料生物传感器的制备方法及其检测方法

摘要

本发明公开了一种检测黄曲霉毒素B1的复合材料生物传感器的制备方法及其检测方法，利用氧化石墨烯‑纳米银‑黄曲霉毒素B1单克隆抗体复合材料制备传感器，利用黄曲霉毒素B1单克隆抗体与抗原特异性结合的原理进行检测，实验所采用纳米银较纳米金成本低，较高效液相色谱等方法而言所用仪器价格低；不仅操作简便、分析时间短、检测成本低，还可以对黄曲霉毒素B1进行定性和定量检测，最低检出限可达到7.19×10‑10μg/kg，在7.19×10‑10—2.47×10‑4μg/kg内呈现良好的线性关系。且反应灵敏在实验中无需添加壳聚糖、铁氰化钾等信号放大物质来增加电流响应。

说明书

技术领域

本发明属于生物传感器制备领域，特别涉及一种检测黄曲霉毒素B1的复合材料生物传感器的制备方法及其检测方法。

背景技术

黄曲霉毒素是一种主要由黄曲霉和寄生曲霉产生的次级代谢产物，是自然界中已经发现的理化性质最稳定的一类真菌毒素，是霉菌毒素中毒性最大、对人类健康危害极为突出的一类霉菌毒素，具有很强的毒性、致癌性、致畸性和致突变性。其广泛存在于霉变的花生、大米、玉米等作物及其相关食品中。天然产生的黄曲霉毒素根据化学结构不同分为B1、B2、G1、G2 四种，其中黄曲霉毒素B1的毒性最大，是氰化钾的10倍，砒霜的68倍，国家质检总局规定黄曲霉毒素B1是大部分食品的必检项目之一。

目前最常用于检测黄曲霉毒素的方法为高效液相色谱法、薄层色谱法和荧光分光光度法，但都存在一些弊端。

高效液相色谱法，其优点为选择性好、灵敏度高、信号强，但由于黄曲霉毒素B1和G1遇水会发生荧光淬灭，检测前需对其进行适当的衍生化反应，故加大了样品前处理的繁琐性。

薄层色谱法所用设备试剂简单、成本低廉能够对样品中的黄曲霉毒素进行定量和半定量分析，但其操作繁琐，检出限高，实验人员需接触大量有毒有害物质。

荧光分光光度法的准确度和精密度良好，但由于其多用于检测黄曲霉毒素总量，且操作步骤繁琐在实验室中应用不广泛。

生物传感器主要是由生物识别和信号分析两部分组成。生物识别部分是由具有分子识别能力的生物敏感识别元件构成，包括细胞、生物素、酶、抗体及核酸等。信号分析部分通常又叫做换能器,它们的工作原理一般是根据物质电化学、光学、质量、热量、磁性等。物理化学性质将被分析物与生物识别元件之间反应的信号转变成易检测、量化的另一种信号，比如电信号、焚光信号等，再经过信号读取设备的转换过程，最终得到可以对分析物进行定性或定量检测的数据。

生物传感器识别和检测待测物的一般反应过程为：首先，待测物分子与识别元素接触；然后，识别元素把待测物分子从样品中分离出来；接着，转换器将识别反应相应的信号转换成可分析的化学或物理信号；最后，使用现代分析仪器对输出的信号进行相应的转换，将输出信号转化为可识别的信号。生物传感器的各个部分包括分析装置、仪器和系统也由此构成。

发明内容

基于上述理由，本发明的目的在于：提供一种操作简便、反应灵敏，检测成本低的用于检测黄曲霉毒素B1的复合材料生物传感器的制备方法及用此生物传感器检测黄曲霉毒素B1的方法。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

一种检测黄曲霉毒素B1的复合材料生物传感器的制备方法，步骤为：

1）制备银纳米颗粒：将硝酸银分散于去离子水中得到0.01～1.0 wt%的硝酸银水溶液，将硝酸银水溶液放置在烧瓶中，安装冷凝回流装置，油浴加热，烧瓶中溶液沸腾后加入0.01～3%的柠檬酸钠溶液继续煮沸1～1.2小时，停止加热冷却至室温，避光放置150小时以上，得银纳米颗粒溶胶。

2）制备氧化石墨烯-纳米银复合材料：避光条件下，取0.2～1.45wt%的氧化石墨烯分散液和步骤1）的银纳米颗粒溶胶于带盖称量瓶中，氧化石墨烯分散液与银纳米颗粒溶胶的质量比为2:3，加盖后搅拌5～6小时使其充分混匀，备用。

3）制备氧化石墨烯-纳米银-黄曲霉毒素B1单克隆抗体复合材料：取黄曲霉毒素B1单克隆抗体于pH为7.0的磷酸盐缓冲溶液中充分分散，制成相应比例的抗体稀释液；以1：1比例取步骤2）的氧化石墨烯-纳米银复合材料和黄曲霉毒素B1单克隆抗体稀释液充分混匀后放于冰箱保存，备用。

4）制作修饰电极：取直径为0.02～0.10μm的氧化铝粉末打磨金电极至表面光滑、无肉眼可见刮痕，用去离子水冲洗打磨后的抛光金电极，依次将所述抛光金电极放入无水乙醇、去离子水中分别超声清洗10～15分钟；将所述抛光金电极放置在0.1mol/L的硫酸溶液中，用循环伏安扫描法扫描30～40圈以活化电极，活化范围为0～1.8V，得活化金电极。

5）制作工作电极：取步骤3）的氧化石墨烯-纳米银-黄曲霉毒素B1单克隆抗体复合材料滴于活化金电极表面，置于3～6℃冰箱中保存直至电极表面呈一层固体状薄膜，得用于检测黄曲霉毒素B1的工作电极。

优选的，步骤1）中油浴加热的温度为175℃～185℃。

优选的，步骤4）中氧化铝粉末为0.05μm。

根据上述方法制备的生物传感器用于检测黄曲霉毒素B1的方法为：

a）制备0.05mol/L的磷酸二氢钠缓冲溶液，制备0.05mol/L的磷酸氢二钾缓冲溶液，将磷酸二氢钠缓冲溶液和磷酸氢二钾缓冲溶液混合调配成pH为7.0的磷酸盐缓冲溶液；

b）将浓度为0.1-2.0μg/kg的抗原原液分别加入到相应量步骤a）制备的磷酸盐缓冲溶液中制成相应浓度的抗原稀释液作为检测底液；

c）采用氧化石墨烯-纳米银-黄曲霉毒素B1单克隆抗体修饰的金电极为工作电极，铂电极为对电极，饱和氯化钾电极为参比电极，磷酸缓冲溶液和相应浓度的抗原混合均匀作为底液，使黄曲霉毒素B1单克隆抗体与黄曲霉毒素B1抗原特异性结合时，发生电子转移，经由纳米银传导，通过电化学工作站放大，以循环伏安图像呈现检测结果。

进一步地，上述检测方法中，整个检测过程均在氮气氛围中进行。

进一步地，所述抗原原液的制备方法为：将玉米粒研磨成粉，称取玉米粉置于7：3的甲醇、水混合溶液中混合均匀，将溶液放入离心机中离心5～10min，取上清液得抗原原液。

优选地，所述离心机的转速为3800～4300r/min。

由于采用了上述方案，本发明的有益效果在于：本发明利用氧化石墨烯-纳米银-黄曲霉毒素B1单克隆抗体复合材料制备传感器，利用黄曲霉毒素B1单克隆抗体与抗原特异性结合的原理进行检测，实验所采用纳米银较纳米金成本低，较高效液相色谱等方法而言所用仪器价格低；不仅操作简便、分析时间短、检测成本低，还可以对黄曲霉毒素B1进行定性和定量检测，最低检出限可达到7.19×10-10μg/kg，在 7.19×10-10—2.47×10-4μg/kg内呈现良好的线性关系。且反应灵敏在实验中无需添加壳聚糖、铁氰化钾等信号放大物质来增加电流响应。

附图说明

图1是本发明中氧化石墨烯-纳米银-黄曲霉毒素B1单克隆抗体复合传感器复合材料制备及该传感器与抗体特异性结合的示意图。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步说明，使熟悉本领域的技术人在研读本说明书后能据以实施。

实施例：参见附图1，一种检测黄曲霉毒素B1的复合材料生物传感器的制备方法。

其步骤为：

（1）制备银纳米颗粒，利用高温的柠檬酸还原硝酸银制备银的纳米颗粒：

准确称取18mg硝酸银加入到250ml三口烧瓶中，加98ml去离子水，将冷凝回流装置固定在三口烧瓶上，油浴加热，搅拌800转。油浴升温至180℃，烧瓶中溶液沸腾时，用移液管移取2ml的柠檬酸钠溶液加入到三口烧瓶中，继续煮沸1h，停止加热，自然冷却至室温。将制备好的银溶胶转移到锥形瓶中，密封避光保存，放置150h以上备用。

（2）制备氧化石墨烯-纳米银复合材料：

避光条件下，取1.01wt%的氧化石墨烯分散液200μL，和步骤（1）制备的银纳米颗粒300μl于带盖称量瓶中，在称量瓶中放置搅拌子，加盖后用磁力搅拌器搅拌5小时使其充分混匀。

（3）制备氧化石墨烯-纳米银-黄曲霉毒素B1单克隆抗体复合材料：

取1μ黄曲霉毒素B1单克隆抗体于适量pH为7.0的磷酸盐缓冲溶液中充分分散，制成相应比例抗体稀释液。以1：1比例取步骤2）的氧化石墨烯-纳米银复合材料和黄曲霉毒素B1单克隆抗体稀释液充分混匀后放于4℃冰箱保存，备用。

（4）制作修饰电极：

用直径为0.05μm的氧化铝粉末打磨金电极至表面光滑、无肉眼可见刮痕，优选地，可在麂皮上打磨金电极。用去离子水将抛光后金电极上残留的氧化铝粉末冲洗干净，然后按将抛光金电极先后放入无水乙醇、去离子水中分别超声清洗10分钟。将该抛光金电极在0.1mol/L的硫酸溶液中用循环伏安扫描法扫描30圈以活化电极，活化范围为0-1.8V，活化完毕后用去离子水冲洗干净备用。

（5）制作工作电极：

用微量进样器取10uL取步骤3）的氧化石墨烯-纳米银-黄曲霉毒素B1单克隆抗体复合材料滴于活化金电极表面，置于4℃冰箱中保存过夜直至电极表面呈一层固体状薄膜，得用于检测黄曲霉毒素B1的工作电极备用。

根据上述方法制备的生物传感器用于检测黄曲霉毒素B1的方法为：

（a）检测底液的制备：称取7.8005g磷酸二氢钠，置于烧杯中，加入适量的水溶解，再用1000mL的容量瓶定容，制备成0.05mol/L的磷酸二氢钠缓冲溶液。称取11.411g磷酸氢二钾置于烧杯中，加入适量的水溶解，用1000mL的容量瓶定容，制备成0.05mol/L的磷酸氢二钾缓冲溶液。将磷酸二氢钠缓冲溶液和磷酸氢二钾缓冲溶液以一定的比例混合成pH=7.0的磷酸盐缓冲溶液。

（b）将适量的浓度为1μg/kg的抗原原液分别加入到相应量以上述方法制取的磷酸盐缓冲溶液，制成了相应浓度的抗原稀释液作为检测的底液。

其中，上述抗原原液的制备方法为：将玉米粒研磨成粉，称取5g玉米粉置于25mL甲醇水混合溶液中混合均匀，所述甲醇水混合溶液为甲醇：去离子水=7：3，将溶液放入离心机中以4000r/min的速度离心5min后取上清液待用。

（c）采用氧化石墨烯-纳米银-黄曲霉毒素B1单克隆抗体修饰的金电极为工作电极，铂电极为对电极，饱和氯化钾电极为参比电极。以步骤（b）制备的0.05mol/L的磷酸盐缓冲溶液和相应浓度的抗原混合均匀作为底液来进行检测的。

检测前，先用磁力搅拌器将底液搅拌20s使其混合均匀；检验时，工作电极上的黄曲霉毒素B1单克隆抗体上的抗原结合簇与黄曲霉毒素B1抗原分子上的抗原决定簇相互吸引，使黄曲霉毒素B1单克隆抗体与黄曲霉毒素B1抗原特异性结合。在黄曲霉毒素B1单克隆抗体与黄曲霉毒素B1抗原特异性结合时，发生电子转移，产生微弱的电信号，经由纳米银传导，再通过电化学工作站放大，最后以循环伏安图像呈现。上述方法中，整个检测过程在氮气氛围中进行。

本发明具体实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明的方法构思和技术方案进行的各种非实质性的改进，或未经改进将本发明的构思和技术方案直接应用于其他场合的，均在本发明的保护范围之内。