使用皮肤间充质干细胞治疗系统性硬化症

摘要

本发明涉及使用皮肤间充质干细胞来治疗系统性硬化症。皮肤间质干细胞有独特的免疫调节和修复作用，所以能应用于制备治疗自身免疫性疾病药物中，而抑制肽能够抑制相应细胞的表达进而减缓和治疗系统性硬化症，该抑制肽与皮肤间质干细胞是协同作用，具有较好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于免疫学领域，具体涉及使用皮肤间充质干细胞治疗系统性硬化症。

背景技术

系统性硬化症(SSc)也称为硬皮病，是一种以局限性或弥漫性皮肤增厚和纤维化为特征的全身性自身免疫病。病变特点为皮肤纤维增生及血管洋葱皮样改变，最终导致皮肤硬化、血管缺血。本病临床上以局限性或弥漫性皮肤增厚和纤维化为特征，除皮肤受累外，它也可影响内脏(心、肺和消化道等器官)，作为一种自身免疫病，往往伴抗核抗体、抗着丝点抗体、抗Scl-70等自身抗体。突出的特征是皮肤发硬，以手、足皮肤硬化最常见，严重时可以出现全身皮肤僵硬。除了皮肤以外，系统性硬化症还会引起内脏疾病，最常见的是吞咽困难、食管反流、肺间质纤维化、心包积液以及肾功能不全等临床表现。

目前系统性硬化症的治疗主要本病尚无特效药物。皮肤受累范围和病变程度为诊断和评估预后的重要依据，而重要脏器累及的广泛性和严重程度决定其预后。早期治疗目的在于阻止新的皮肤和脏器受累，而晚期的目的在于改善已有的症状。该病的治疗氛围一般治疗和对症治疗。

一般治疗包括：(1)糖皮质激素和免疫抑制剂：总的说来糖皮质激素对本病疗效不显著，但对炎性肌病、间质性肺病的炎症期有一定疗效；在早期水肿期、关节痛和肌痛亦有疗效。剂量为泼尼松30～40mg/d，连用3～4周，渐减至维持量l0～15mg/d。免疫抑制剂对皮肤硬化的治疗的研究文献不多。常用环孢霉素A、环磷酰胺、硫唑嘌呤等，有报道对皮肤关节和肾脏病变有一定疗效，与糖皮质激素合并应用，常可提高疗效和减少糖皮质激素用量。(2)青霉胺：在原胶原转变成胶原的过程中，需要单胺氧化酶参与聚合和交叉联结。青霉胺能将单胺氧化酶中的铜离子络合，从而抑制新胶原成熟，并能激活胶原酶，使已形成的胶原纤维降解。常见的不良反应有发热、厌食、恶心、呕吐、口腔溃疡、味觉异常、皮疹、白细胞和血小板减少、蛋白尿和血尿等。(3)甲氨蝶呤：欧洲抗风湿联盟推荐的治疗指南针对皮肤硬化的惟一治疗推荐是甲氨蝶呤，2项高质量的随机对照试验结果表明，甲氨蝶呤口服或肌肉注射，可改善系统性硬化症相关的皮肤病变进展，因此，推荐用于系统性硬化症的皮肤病变。(4)其他：近年来，有文献报道使用松弛素、伊马替尼、CD20单抗、TGF-β抗体等多种新的治疗方法治疗皮肤硬化均取得不错疗效，但是目前尚未得到广泛推广使用，可以考虑用于难治性患者。

其他治疗：近年来，国内外采用经CD34细胞分选的外周造血干细胞移植治疗，取得了一定效果，但费用昂贵，移植不良反应风险较高，仅推荐用于难治性患者。国内孙凌云教授首先用间充质干细胞治疗系统性硬化症取得较好的前期效果，有待于更多的研究证实其疗效。

CN101485685A中公开了骨髓间质干细胞在制备治疗自身免疫性疾病药物中的应用。该应用中骨髓MSCs作为治疗自身免疫性疾病药物的活性成分，有独特的免疫调节和修复作用，用于治疗自身免疫性疾病具有“治疗方便、疗效持久”的特点，能帮助患者减少药物治疗的种类和数量以及药物带来的各种副作用，甚至可能停用免疫抑制剂等药物治疗，降低死亡率和致残率，改善患者生活质量；同时，以骨髓MSCs为活性成分的治疗自身免疫性疾病的药物较其他新型的生物制剂费用低，多数患者具有相应的经济能力。因此骨髓MSCs在制备治疗自身免疫性疾病药物中的应用具有巨大的社会和经济效益。但是该应用仍然存在着作用效率低，仍需要继续改善才能大规模推广使用。特别是该发明自公布以来，并没有被推广使用，这也充分说明该方法仍然存在着一定的缺陷。

而且，骨髓间质干细胞的取材不变，对人体伤害也大，并不利于常规的治疗。

另外，在前期的研究发现，局部和全身的炎症在系统性硬化症的发生、发展及并发症的产生中起着重要的作用。白细胞跨内皮迁移至血管壁间隙是组织损伤和炎症反应的必要步骤，白细胞与血管内皮的黏附是此过程中最重要的一环，而黏附分子则介导此全过程。发现系统性硬化症的发病与黏附分子介导的炎症反应密切相关。特别是研究发现的抑制肽能够显著的降低中性粒细胞CD11b/CD18的表达，进而抑制系统性硬化症的发生，促进了干细胞的协同治疗效果。

发明内容

本发明的目的是提供抑制肽在制备治疗系统性硬化症药物中的应用。

本发明的目的是提供具有协同作用的抑制肽与表皮间质干细胞在制备治疗系统性硬化症药物中的应用。

进一步的，所述系统性硬化症为弥漫性硬皮病。

进一步的，所述抑制肽为SEQ ID NO：1所示的抑制肽。

所述的表皮间质干细胞以如下方法制备：

取包皮或其他皮肤组织，用II型组织酶消化获得表皮，将表皮剪碎，再用胰蛋白酶进一歩消化，获得表皮细胞。

所述的人表皮细胞在上述细胞培养基中培养，优选培养条件为：36土2℃、 5±l％CO2,90-100％湿度，每隔2-3天更换细胞培养基。

其中当细胞生长至60-90％融合度时，用质量分数为0.25％的胰蛋白酶与质量分数为0.02％的EDTA溶液按照体积比1:1混合而形成的消化液消化，祛除未消化下来的人表皮细胞，收集消化下来的间充质干细胞样细胞，即为人表皮源性间充质干细胞样多能细胞。

将人表皮源性间充质干细胞样多能细胞用常规的方法制备染色体涂片，进行核型检查：核型为正常男性46条染色体，带型正常。

使用流式细胞术和免疫组化技术检测本发明的人表皮源性间充质干细胞样多能细胞株的表面标志(检测方法是公知技木，商业试剂公司可提供试剂盒，按照试剂公司提供的技术方案实施即可)，其表达间充质干细胞特异性标志：CD73、 CD90、CD105,Vimentin和Nestin，阳性的细胞呈棕色或棕黑色。

本发明提出表皮MSCs和抑制肽一起在制备治疗系统性硬化症疾病的药物中的应用。采用表皮MSCs有独特的免疫调节和修复作用，能帮助患者减少药物治疗的种类和数量以及药物带来的各种副作用，抑制肽能够协同促进系统性硬化症的治疗效果，二者制备方便，成本低廉。

具体实施方式

实施例1表皮间质干细胞体外分离、培养

1.配制细胞培养基：

在葡萄糖含量为5g/L的DMEM培养基中添加胎牛血清、hbFGF、hSCF、非必须氨基酸、L-谷氨酰胺、庆大霉素，并使上述各种添加成分的终浓度如下：胎牛血清：体积分数为25％，,40ng hbFGF/mL、20ng hSCF/mL、2mL 100X非必须氨基酸/100mL、0.1mL含质量分数为3％L-谷氨酰胺的PBS溶液/1OOmL和8000U 庆大霉素/1OOmL。由此而形成本实施例的细胞培养基。所述的100X的非必须氨基酸购自购自GIBCO公司，其货号为11140。

2.获取表皮组织和表皮细胞：

取临床废弃的包皮组织，浸泡在含1000U庆大霉素/mL的PBS溶液中，4℃保存；4小时内进行如下处理：用PBS充分洗涤，祛除血细胞，剪去皮下疏松结缔组织，用II型组织酶(2U/mL)浸泡消化过夜，获得表皮，然后将表皮剪碎，用质量分数为0.25％的胰蛋白酶进一歩消化30分钟，获得表皮细胞，用PBS洗涤，然后离心祛除消化酶，用本实施例的细胞培养基重新悬浮细胞。

3.培养表皮细胞：

将每个标本获得的表皮细胞接种于含有本实施例的细胞培养基的T25培养瓶3-4个中，于36℃、5％C02、90-100％湿度培养箱内进行培养，隔2-3天更换细胞培养基。

4.筛选和富集人表皮源性间充质干细胞样多能细胞：

当细胞生长至的融合度时，用质量分数为0.25％的胰蛋白酶加质量分数为0.02％的EDTA(按体积比1:1混合)组成的消化液进行分段消化；收集消化下来的间充质干细胞样细胞，祛除未消化下来的人表皮细胞；将收集到的间充质干细胞样细胞置于离心管内，5min离心祛除消化液；然后用本实施例的细胞培养基重新悬浮细胞，该细胞即为本发明的人表皮源性间充质干细胞样多能细胞，将该细胞进行计数。

5.体外培养人表皮源性间充质干细胞样多能细胞株：

将计数好的人表皮源性间充质干细胞样多能细胞以约1X IO5个/mL的密度接种于含有本实施例的细胞培养基的T25培养瓶中，于36±1℃、5±1％C0₂、湿度培养箱内进行培养，隔天，以1:3比例传代一次，直至30 代以上，而获得人表皮源性间充质干细胞样多能细胞株。

对本实施例的人表皮源性间充质干细胞样多能细胞株进行检测发现，该细胞株具有间充质干细胞样的表形，核型正常，表达间充质干细胞和神经前体细胞的特异性标志：CD73、CD90、CD105、Vimentin和Nestin。

另外，以每只鼠约1X 10⁷个将细胞经腹腔注射和皮下注射入SCID小鼠体内>

6、外观及镜下观察

在输注实验的当天对培养瓶中的上清液进行颜色观察，，无细菌、霉菌生长。

7、活细胞比例

输注当天对收集的细胞悬液抽样检查活细胞比例占95％以上。

8、染色体核型

皮肤MSCs输注前3天抽样行染色体核型检查：正常染色体核型。

实施例2皮肤MSCs+抑制肽的给药方法

1.所用设备，材料，试剂

超净工作台离心机一次性注射器注射用生理盐水人血白蛋白

2.输注前操作

当细胞总数量达到(1-2)X IO⁶个/kg体重，可考虑输注准备：

(1)输注前抽样留取细胞培养上清液作细菌、真菌培养、支原体检测及内毒素测定；

3输注操作

(1)胰酶消化所有细胞(操作同前)，离心(常温lOOOrpm,5min),弃上清, 反复充分洗涤；加入含5％人血白蛋白的生理盐水1OOml，输注的细胞悬液中仅残留不足O.5％的细胞培养液。抽取O.1ml细胞悬液计数。标明患者姓名，准备输注。

(2)细胞输注前半小时给患者静脉甲强龙40mg。

(3)开放手背静脉，用输血器输入少量生理盐水，通畅后连接装有细胞的分离袋，调整输注速度，输注过程中观察患者反应，及时对症处理。整个过程耗时约15分钟。

4.病例入选标准：1)确诊为系统性硬化症，2)签署知情同意书同意干细胞治疗。排除标准：1)患者存在严重的感染，2)疾病終末期，已出现重要脏器功能严重受损。

移植方案：皮肤MSCs静脉输入，细胞数为1X 10⁶个/kg体重。抑制肽100ng/kg>

选取于2016年-2017年12月系统性硬化症患者90例，其中男56例，女34 例，平均年龄(45.8士2.4)岁，平均病程(3.2士1.1)年。所有患者均符合美国风湿病协会关于SSc的诊断标准。根据该病的分型标准，硬化期、水肿期和水肿一硬化期分别有28,50和12例；肢端型86例，弥漫型4例。

5.观察项目及疗效判定标准

对每位患者在治疗前、后的皮肤紧硬改变进行自我评价和医生评分。自我评价采用10cm视模拟标尺法，如受累部位皮肤发紧和发皱感基本消失或减轻75％以上为显效；减轻30％一75％为有效；减轻30％以下视为无效。据显效和有效例数计算总有效率。同时由指定的医生根据硬皮病皮肤紧硬记分标准进行记分，比较治疗前后受累部位皮肤的总得分。在EDTA治疗前后检查患者的肝、肾功能，血、尿常规及血清电解质，同时记录药物不良反应。SSc皮肤紧硬记分标准见表 1。

表1皮肤紧硬记分标准

判定标准：用拇指可夹住捏起的皮肤为正常，否则为异常；中得分＝上下肢得分(对异常皮肤从指(趾)末端向近端检查，按到达的界限计分)加面颈部的得分。

1个月后，评估相应的系统疗效。结果如表2所示：

表2干细胞治疗SSc的疗效

其中有效：包含显效和有效例数；b中出现皮肤瘙痒。红斑皮疹，治疗停止。

从上述结果可以看出，采用该细胞加上抑制肽在治疗肢端型表皮硬化症上具有较好的疗效，而针对弥漫型治疗效果不佳。另外，在病程治疗中，无论是硬化期、水肿期还是水肿-硬化期均具有较好的治疗效果。

为了检测抑制肽的治疗效果。方法同在前，选择肢端型病患者10例，单独注射抑制肽，条件同上。结果如下表3：

为了检测干细胞单独的治疗效果。方法同在前，选择肢端型病患者10例，单独注射干细胞，条件同上。结果如下表4：

从表3和表4可以看出，单独使用抑制肽或者单独使用干细胞在疗效上均不能显著的达到二者一起的效果。

另外，通过流式细胞仪测定有效治疗的患者血液在治疗前后中性粒细胞的CD11b/CD18的表达，结果如下表5所示(x^-±s,其中p<0.05)：

组别CD11b/CD18正常人(20)240±51只注射抑制肽的患者(10)282±48只注射抑制肽的患者，在未注射之前(10)954±84只注射干细胞的患者(10)468±39只注射干细胞的患者，在未注射之前(10)896±70二者均注射的患者，治疗有效(64)921±66二者均注射的患者(治疗有效)，在未注射之前((64)256±25

从上述结果可以看出，本发明提供的抑制肽能够较好的抑制CD11b/CD18 的表达，进而抑制硬化症的发生，同时促进干细胞治疗效果。

序列表

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<120> 使用皮肤间充质干细胞治疗系统性硬化症

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 1

Cys Trp Trp Ala Ala Arg Leu Val Ala Ile Cys Phe Glu Trp Gln Arg

1 5 1015

Trp Ser His Arg Phe Gln Arg Ser Trp Arg Leu

2025