高特异性的抗兔IgG天然构象单克隆抗体

摘要

本发明公开一种高特异性的抗兔IgG天然构象单克隆抗体，该单克隆抗体的蛋白序列含有重链可变区和轻链可变区，所述的重链可变区具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，所述的轻链可变区具有如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。该特性能单克隆抗体够显著的降低第二抗体的交叉反应及背景，与此同时，它能够有效的解决免疫沉淀/免疫印迹方法中对来自于免疫沉淀实验的抗体重链/轻链的交叉反应。本发明作为目前市场上仅有的2个特异性识别天然构象的兔IgG的第二抗体，在实际科研医药应用中拥有巨大的优势。

说明书

技术领域

本发明属于分子免疫学领域，具体涉及一种高特异性、高灵敏度的识别天然构象兔IgG单克隆抗体。

技术背景

在生物医学研究领域，抗体是一类使用极其频繁的试剂。因其具有针对某种(些)特定表位的敏感性和特异性而成为研究应用中的理想试剂选择。目前，多种多样的抗体已广泛应用于诸如免疫印迹法，免疫组织化学，免疫沉淀，免疫测定的数十种检测方法。

在以上检测方法中，需要一种简便的方法来定性/定量的识别特异性结合了目标的抗体(第一抗体，一抗)，并将这种结合转化为直观的数据。第二抗体(二抗)是目前主流的方式。通过特异性结合抗体的恒定区，第二抗体能够直接检测第一抗体的存在，并放大其信号以便区分。基于检测的需求，第二抗体往往带有可以被检测出的标记，如带荧光、放射性、化学发光或显色基团。

发明内容

本发明的目的是提供一种高特异性、高灵敏度的抗兔IgG单克隆抗体及其制备方法。

本发明的另一目的是提供上述高特异性、高灵敏度的抗兔IgG单克隆抗体的编码基因。

本发明的又一目的是提供含有上述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌及其应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种高特异性的抗兔IgG单克隆抗体，该单克隆抗体的蛋白序列含有重链可变区和轻链可变区，所述的重链可变区具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，所述的轻链可变区具有如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。

上述高特异性的抗兔IgG单克隆抗体的编码基因。

上述的编码基因含有如SEQ ID NO：2所示的编码所述单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列，以及如SEQ IDNO：4所示的编码所述单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列。

含有上述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

上述的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在制备高特异性的抗兔IgG单克隆抗体中的应用。

一种制备高特异性的抗兔IgG单克隆抗体的方法，将包含上述编码基因的重组表达载体转染宿主细胞或宿主菌，并进行培养得到高特异性的抗兔IgG单克隆抗体。

上述的单克隆抗体在免疫反应中的应用。所述的免疫反应选自酶联免疫吸附实验、免疫印记技术、免疫组织化学、免疫细胞化学、免疫荧光、免疫化学发光、免疫沉淀或流式细胞术。

本发明通过以下方法获得了抗兔IgG单克隆抗体M205的独特可变区核苷酸/蛋白序列：

1)用兔总IgG免疫Balb/c小鼠，获得针对兔IgG的免疫反应；

2)取步骤1)中小鼠的脾脏细胞进行融合，并对获得的杂交瘤细胞进行筛选，获得特异性识别天然构象的兔IgG的阳性母克隆；

3)对步骤2)中获得的阳性母克隆进行亚克隆，获得稳定的杂交瘤细胞株；

4)用步骤3)中获得的杂交瘤细胞株进行测序，获得抗体轻链和重链的可变区编码序列。

用步骤4)中获得的可变区编码序列进行重组抗体生产获得鼠抗兔IgG单克隆抗体。

本发明的有益效果

本发明所述的单克隆抗体能够特异性结合天然构象的兔IgG。该特性能够显著的降低第二抗体的交叉反应及背景，与此同时，它能够有效的解决免疫沉淀/免疫印迹方法中对来自于免疫沉淀实验的抗体重链/轻链的交叉反应(图1)。目前市场上广泛使用的抗兔IgG抗体多为多克隆抗体，这类第二抗体虽然能够为实验提供足够的灵敏度，但是其多克隆的本质导致背景较高，同时无法区分天然构象和变性的兔IgG，导致变性兔IgG重链/轻链的干扰实验结果。本发明作为目前市场上仅有的2个特异性识别天然构象的兔IgG的第二抗体，在实际科研医药应用中拥有巨大的优势。

附图说明

图1：特异性结合天然构象的兔IgG的抗体在免疫沉淀/免疫印迹方法中的优势

图2：纯化单克隆抗体能够特异性结合来自于不同动物的兔IgG

图3：纯化单克隆抗体能够特异性结合天然构象的兔IgG

图4：纯化单克隆抗体能够避免与变性的抗体重链、轻链的交叉反应

图5：纯化单克隆抗体能够提供更高的灵敏度和更低的背景噪音

图6：纯化单克隆抗体M205能够提供更高的灵敏度

具体实施方式

本发明涉及一种高特异性的抗兔IgG单克隆抗体，下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。除非另有说明，本发明所用的技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术员通常所理解的含义相同。除非另有说明，下文描述的实施例的方法和材料均为可以通过市场购买获得的常规产品。本发明所属领域技术人员将会理解，下文描述的方法和材料，仅是示例性的，而不应视为限定本发明的范围。

实施例1：抗兔IgG杂交瘤细胞株的获得

1)动物免疫

抗原采用兔总IgG(金斯瑞，A01008)。用含50μg兔IgG的200μl弗氏完全佐剂(Sigma-Aldrich)的1:1乳液皮下免疫雌性Balb/c和C57bl/6小鼠。随后，每二周腹腔/皮下交替注射含25μg兔IgG的弗氏不完全佐剂(Sigma-Aldrich)的1:1乳液最多达3次，从而对小鼠进行加强免疫。骨髓瘤融合前4天，表现出最高抗体滴度的一只小鼠接受了25ug兔IgG(不含佐剂)的腹腔加强免疫。

2)杂交瘤融合和筛选

提取脾脏并进行均质化以产生单细胞悬液，同时准备骨髓瘤细胞(SP2/0)单细胞悬液。使用电融合将7.4×10⁷个脾细胞与3.7×10⁷个SP2/0小鼠骨髓瘤细胞进行融合。将融合的细胞重悬于100ml含杂交瘤细胞选择剂胸腺核苷嘧啶，次黄嘌呤和氨基喋呤的DMEM/10％FBS培养基中，并用移液管以100μl的体积移至50×96孔板中。将板在37℃下在6％CO₂中孵育。7天的孵育之后，开始使用下文所述的ELISA结合来测试针对兔IgG的抗体的存在情况。

ELISA结合检测方法：间接ELISA用于评估上清液中抗体对于兔IgG的结合能力。将ELISA板(Nunc)用100μl/孔的PBS中0.5μg/ml的兔IgG或人/鼠/猴IgG在4℃下包被过夜。用PBS-T(体积百分比0.05％吐温)洗涤板，并将其用200μl/孔的含1％BSA(质量g/体积ml百分比)的PBS-T在37℃封闭0.5小时。随后弃去封闭液，向每个板加入100μl杂交瘤细胞培养上清液，然后在室温下孵育1小时。将板用PBS-T洗涤三次，并用100μl/孔的缀合辣根过氧化物酶的山羊抗小鼠IgG(Fab-特异性)(金斯瑞)37℃孵育0.5小时。将板用PBS-T洗涤五次，然后加入TMB显色液(金斯瑞)并在室温下在黑暗中孵育15分钟。通过加入50μl的1M HCl终止液(Sigma)终止反应。使用酶标仪在450nm下读板。

3)杂交瘤亚克隆

使用有限稀释法进行亚克隆。使用血球细胞计数器并在含杂交瘤细胞选择剂胸腺核苷嘧啶，次黄嘌呤和氨基喋呤的DMEM/10％FBS(体积百分比)培养基中对细胞进行系列稀释来确定细胞数量，直至细胞密度达到5-15个细胞/ml。对于每个杂交瘤，将200μl的细胞溶液用移液管移至96孔板中，密度为1-3个细胞/孔。将培养物在37℃下在5％CO2中培养1周后，对上清液进行上述ELISA结合测试，来评估针对兔IgG的抗体的存在情况。

实施例2：单克隆抗体的可变区测序及抗体重组生产

使用快速ELISA小鼠抗体亚型鉴定试剂盒(Clonotyping System-HRP，SouthernBiotech)对杂交瘤细胞培养上清中的抗体进行亚型鉴定后，使用TRIzol(Ambion)从3×10⁶-5×10⁶个杂交瘤细胞提取总RNA，并利用抗体亚型特异性引物和通用引物(PrimeScript^TM>

M205重链可变区氨基酸序列：SEQ ID NO:1

M205重链可变区DNA序列：SEQ ID NO:2

M205轻链可变区氨基酸序列：SEQ ID NO:3

M205轻链可变区DNA序列：SEQ ID NO:4

分别合成包含轻链可变区+恒定区(GenBank，NG_005612.1)与重链可变区+恒定区(GenBank，NG_005838.1)的DNA片段，将其分别插入pTT5表达载体中，形成表达质粒。

将上述质粒共转染HEK293-6E细胞，并于37℃摇瓶中培养10天后，收取上清用于抗体纯化。纯化之前，将管道和蛋白A柱用0.2M NaOH去热原。将柱用含有0.05M Tris和1.5M NaCl(pH8.0)的缓冲液重新平衡。随后将收获的细胞培养物上清液，使用2×上述缓冲液1:1稀释并过滤除菌。将过滤的上清液和蛋白A柱室温孵育2小时，并用1×上述缓冲液洗涤柱后，使用无菌0.1M柠檬酸钠(pH3.5)洗脱IgG，收集了洗脱液并用九分之一体积的无菌1M Tris-HCl(pH9)中和。在无菌条件下，将所述产品缓冲液交换为PBS(pH7.4)以除去任何的洗脱缓冲液并浓缩所述样品。浓缩之后，使用1.43的消光系数Ec(0.1％)通过OD280nm对抗体进行定量。

纯化的抗体通过BioRad电泳系统用10％预制胶(金斯瑞)通过SDS-PAGE来分析。将所述凝胶用Estain2.0(金斯瑞)染色并通过比较染色带与Protein Ladder(金斯瑞)来估计分子大小和纯度。

实施例3：单克隆抗体对兔IgG的结合

间接ELISA用于评估纯化抗体对于兔IgG的结合能力。将ELISA板(Nunc)用100μl/孔的PBS中0.5μg/ml的来自于不同动物的兔IgG在4℃下包被过夜。用PBS-T(体积百分比0.05％吐温)洗涤板，并将其用200μl/孔的含1％BSA(质量/体积百分比)的PBST在37℃封闭0.5小时。随后弃去封闭液，向首孔加入1μg/ml的纯化抗体100μl，并按照2倍梯度稀释，共计10个测试浓度梯度。然后在室温下孵育1小时。将板用PBS-T洗涤三次，并用100μl/孔的缀合辣根过氧化物酶的山羊抗小鼠IgG(Fab-特异性)(金斯瑞)37℃孵育0.5小时。将板用PBS-T洗涤五次，然后加入TMB显色液(金斯瑞)并在室温下在黑暗中孵育15分钟。通过加入50μl的1M-HCl终止液(Sigma)终止反应。使用酶标仪在450nm下读板。纯化抗体对于各种兔IgG的结合能力如图2。

实施例4：纯化单克隆抗体能够特异性结合天然构象的兔IgG

将兔IgG样品分别加入等体积的还原性和非还原性上样缓冲液，混匀后加热到100℃水浴5分钟。随后使用BioRad电泳系统和10％预制胶(金斯瑞)通过SDS-PAGE分离样品。最后将所述凝胶用BioRad转膜系统和待测纯化抗体来评估结果。如图3所示，本发明所述的单克隆抗体能够特异性识别天然构象的兔IgG而非变性的兔IgG。

实施例5：纯化单克隆抗体能够避免与变性的抗体重链、轻链的交叉反应

将小鼠脑细胞裂解液用抗谷氨酰胺合成酶的抗体(金斯瑞，A01305)免疫沉淀，随后将还原性的上样缓冲液加入到样品中，混匀后加热到100℃水浴5分钟。随后使用BioRad电泳系统和10％预制胶(金斯瑞)通过SDS-PAGE来分离样品。将所述凝胶用Biorad转膜系统转膜后，孵育抗谷氨酰胺合成酶的抗体(金斯瑞，A01305)和包括待测纯化抗体在内的3种第二抗体(二抗)来评估结果。如图4所示，相对于传统第二抗体(二抗)和市售的单克隆抗体，本发明所述的单克隆抗体能够特异性识别天然构象的兔IgG，从而避免抗体重链和轻链对于结果干扰。

实施例6：纯化单克隆抗体能够提供更低的背景噪音

将指定量的小鼠脑细胞裂解液分别加入等体积的还原性上样缓冲液，混匀后加热到100℃水浴5分钟。随后使用BioRad电泳系统和10％预制胶(金斯瑞，M01012C)通过SDS-PAGE分离样品。将所述凝胶用BioRad转膜系统转膜后，孵育抗谷氨酰胺合成酶的抗体(金斯瑞，A01305)和包括待测纯化抗体在内的2种第二抗体(二抗)来评估结果。如图5所示，相对于传统的多克隆第二抗体(二抗)，本发明所述的单克隆抗体能够不降低灵敏度的前提下显著降低背景噪音。

实施例7：纯化单克隆抗体能够提供更高的灵敏度

间接ELISA用于评估纯化抗体对于兔IgG的结合能力。将ELISA板(Nunc)用含有1μg/ml兔IgG的100μl/孔的PBS在4℃下包被过夜。用PBS-T(0.05％吐温)洗涤板，并将其用200μl/孔的含1％BSA(质量/体积百分比)的PBS-T在37℃封闭0.5小时。随后弃去封闭液，向首孔加入1:8000稀释后的1μg/ml的M205纯化抗体和市售L27A9抗体(Cell Signaling Technology,Inc.目录号3678，克隆号L27A9)各100μl(HRP标记)，并按照2倍梯度稀释，共计7个测试浓度梯度。然后在室温下孵育1小时。将板用PBS-T洗涤五次，然后加入TMB显色液(金斯瑞)并在室温下在黑暗中孵育15分钟。通过加入50μl的1M HCl终止液(Sigma)终止反应。使用酶标仪在450nm下读板。两种第二抗体对于兔IgG的结合灵敏度如图6。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京金斯瑞生物技术有限公司

<120> 高特异性的抗兔IgG天然构象单克隆抗体

<130> 2017

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 137

<212> PRT

<213> 人工序列

<221> M205重链可变区氨基酸序列

<400> 1

Met Glu Trp Thr Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly

1 5 1015

Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys

202530

Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe

354045

Ser Asn Asn Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Pro

505560

Glu Trp Ile Gly Glu Ile Leu Pro Glu Asn Gly Asp Thr Asn Asn Asn

65707580

Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn

859095

Thr Ala Phe Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ile Ala Val

100 105 110

Tyr Phe Cys Ala Arg Arg Ser Gly Tyr Tyr Thr Met Asp Tyr Trp Gly

115 120 125

Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

130 135

<210> 2

<211> 411

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> M205重链可变区DNA序列

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atggaatgga cctgggtctt tctcttcctc ctgtcagtaa ctgcaggtgt ccactcccag 60

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tgcaaggcta ctggatacac attcagtaac aattggatag agtgggtaaa gcagaggcct 180

ggacatggcc ctgagtggat tggagagatt ttacctgaaa atggtgatac taataacaat 240

gagaagttca agggcaaggc cacattcact gcagatacat cctccaacac agccttcatg 300

caactcagca gcctgacatc tgaggacatt gccgtctatt tctgtgcaag aaggtctggg 360

tactatacta tggactactg gggtcaagga acctcagtca ccgtctcctc a 411

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Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Gln Gly Pro

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Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Ser

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