抗preS1高特异性单克隆抗体的制备及其在血清LHBs检测中的应用

摘要

乙型肝炎病毒的致病性来源于包封有病毒DNA的直径约42nm的球形病毒颗粒。　　 乙肝病毒基因组有四个开放阅读框，由于翻译起点不同，前S 区/S 区基因编码病毒表面三种抗原分子，分别是前S1蛋白(preS1)，前S2蛋白(preS2)和S蛋白。乙肝表面抗原由三种被膜糖蛋白组成，分别是乙肝病毒大蛋白(LHBs)，中蛋白(MHBs)和主蛋白(SHBs)。　　 从最上游启动密码子开始翻译产生的乙肝病毒大蛋白(LHBs)被认为在病毒与宿主细胞受体的结合以及病毒颗粒的聚集和从细胞中释放等过程中发挥重要作用。与其它表面膜蛋白不同的是，LHBs在其N 末端拥有preS1区域。因此，研究该区域的生物学特性和免疫原性非常重要。preS1分子位于LHBs的表面，受宿主免疫应答调节，具有很强的免疫原性，所以preS1区域也反映了HBV的基本生物学特性。研究发现，在乙肝表面抗原阴性患者的血清及肝脏中出现preS1蛋白已经被认为是HBV 感染的标志物，代表着病毒的复制。因为LHBs大多位于感染性病毒颗粒的表面，所以对LHBs的检测显得尤为重要，而检测的关键问题在于如何获得针对preS1区域的特异性抗体，那么预测preS 区域的B细胞免疫表位很有必要。在我们的研究中，我们利用生物信息学软件在线预测出了preS 区域的免疫表位并将表位肽段合成且与BSA 交联。将交联好的表位肽段按照一种新型免疫程序免疫Balb/c小鼠制备单克隆抗体。与此同时，我们制备了可用于preS1结构和功能分析以及筛选单克隆抗体的重组preS1蛋白。在获得的单克隆抗体的基础上，我们建立了检测血清中HBV LHBs的ELISA分析方法，并对413例临床血清样本进行了检测，以验证所获抗体的特异性及高效性。上述方法有助于更高效的检测乙肝病毒感染。　　 主要研究内容和结果：　　 1．preS1高效原核表达基因载体的构建及免疫检测标准品的制备我们从GENBANK 获得了由357个碱基组成的编码preS1(1-119aa)蛋白的基因序列(B基因型,adr 血清亚型)。将此序列递交于GraphicAlcodon usage analyzer(http://guca.schoedl.del)分析发现该基因序列中有部分编码氨基酸的密码子在E.coli BL21中使用的频率较低，因此可能导致构建的重组质粒无法在大肠杆菌中顺利表达。根据大肠杆菌偏嗜的密码子，通过同义置换的方式对preS1基因序列进行偏嗜性改造，改造后的基因序列编码的氨基酸序列同改造前一致。　　 接下来我们构建了preS1原核表达载体。将大肠杆菌偏好的编码preS1氨基酸序列同天然preS1分子(1～119aa)相同的DNA 片段合成并克隆入质粒pET32a，再将重组质粒转化大肠杆菌E.coli。经1.0mmol/L IPTG 37 ℃诱导表达5h，pET32a-preS1在BL21中表达出了融合蛋白，分子量约为30.5kD，表达量占菌体总蛋白的30％以上。经鉴定表达蛋白破菌后主要在上清中，为可溶性表达。采用离子交换、His 亲和层析柱、EK 酶切及过分子筛等技术建立了preS1重组蛋白的纯化方法，获得了高纯度的preS1蛋白。经HPLC 检测所获纯化蛋白纯度可达98％，证明其可用于筛选抗preS1单克隆抗体及分析preS1分子的结构和功能。　　 2．抗preS1单克隆抗体的制备与鉴定利用B细胞表位在线预测软件，综合分析蛋白结构β-转角，蛋白抗原表面可及性，蛋白柔韧性，蛋白抗原性，疏水性及线性抗原表位，我们选择了具有较强抗原特异性的区段(36-58aa)作为免疫原免疫小鼠。将该肽段合成并与BSA 交联后免疫Balb/ c小鼠，免疫脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)在50％聚乙二醇条件下融合，获得了7株分泌抗preS1单克隆抗体的杂交瘤细胞株。　　 通过对所获抗体进行亚类分析，我们得到了1-E6(IgG1)和2-G5(IgG2a)两株抗体，通过ELISA分析、Western blotting、抗体亲和力测定以及免疫细胞化学方法鉴定，证实了其对preS1蛋白的免疫特异性，可以被用来检测血清中的乙肝大蛋白。　　 3．抗preS1单克隆抗体在检测血清LHBs中的应用在研究中，我们把特异性的抗preS1单克隆抗体作为捕获抗体包被在ELISA 微孔板孔中，同时用辣根过氧化物酶标记的抗HBsAg 兔多克隆抗体作为二抗即检测抗体，建立了检测LHBs的双抗体夹心ELISA 方法。我们搜集了2009年9月到2010年8月期间第三军医大学西南医院感染科门诊或住院的413例乙肝感染者血清标本以及100例体检正常者血清标本作为检测对象。为了比较不同抗体对血清LHBs 检出阳性率的高低，我们同时用市面上商业化的抗preS1单克隆抗体作为捕获抗体进行平行检测。另外我们用同样的方法对100例体检正常的血清标本进行检测，以证实前述检测结果并非假阳性。　　 研究证实，单克隆抗体1-E6 比商业化抗体以及2-G5 更能特异结合preS1,作为捕获抗体时对LHBs的检出率也高于商业化抗体以及2-G5作为捕获抗体时对LHBs的检出率。　　 因此，所获得的高特异性抗体1-E6 将会为今后LHBs的检测以及preS1免疫检测试剂盒的研发奠定重要的基础。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩写一览表

声明

前 言

第一部分 重组preS1 蛋白的高效原核表达与纯化

第二部分 抗preS1 高特异性单克隆抗体的制备与鉴定

第三部分 抗preS1 单克隆抗体在血清LHBs 检测中的应用

全文总结

致 谢

参考文献

文献综述 HBV 感染血清LHBs 检测的意义与方法进展

攻读硕士学位期间发表的文章与申请的专利