一种由NF-κB启动的肿瘤细胞特异效应基因表达载体及其表达产物和应用

摘要

本发明公开了一种由NF‑κB启动的肿瘤细胞特异效应基因表达载体及其表达产物和应用。该基因表达载体包含两个序列元件，调控基因表达的启动子序列与启动子序列下游效应基因编码序列；所述启动子序列由一段NF‑κB应答序列和最小启动子序列组成。当该基因表达载体导入肿瘤细胞内时，细胞内的序列特异性转录因子NF‑κB就会激活该载体，使其表达载体上的效应基因，效应基因表达产物为一种细胞表面的多肽或蛋白质，该细胞表面的多肽或蛋白质不但可以作为新抗原物质激发体内免疫系统对肿瘤细胞的攻击、发挥肿瘤免疫治疗的功效，还可以作为一种肿瘤细胞人工标记，用于肿瘤成像、诊断、细胞分离等。

说明书

技术领域

本发明属于肿瘤免疫治疗技术领域，具体涉及一种由转录因子NF-κB启动的肿瘤细胞特异效应基因表达载体及其表达产物和应用。

背景技术

人类对于癌症治疗有最迫切的期望，科学界和医学界为此坚持不懈地付出探索。癌症是目前困扰人类健康威胁人类生命的重大疾病。虽经发病机理的大量基础研究和各种治疗方法的广泛临床实践，但截至目前，科学界和医学界还没有找到一种可治愈癌症的技术。虽然传统的手术切除加放化疗技术已被普遍用癌症治疗，以及最新的肿瘤免疫疗法也已被探索用于癌症治疗，但治疗的效果还与病人对于健康和生命的期望相差甚远。例如，目前应用最广泛且最有效的肿瘤免疫疗法是PD-1/PD-L1抑制剂(如PD-1抗体)，但其目前的总体应答率却只有20-30％；而在血液恶性肿瘤治疗上有效的CAR-T、TCR-T等细胞治疗，在实体瘤治疗方面还没有实质进展。因此，探索新的癌症治疗技术，在人类可真正治愈癌症前，将始终是科学界和医学界努力的方向。

肿瘤治疗最关键和重要的是找到在癌细胞表面表达的特定抗原。目前肿瘤免疫治疗领域的各种细胞疗法(特别是CAR-T疗法)都无法避免地依赖于该类肿瘤抗原(如目前CAR-T治疗中运用的最成功的CD19)，即肿瘤免疫治疗的靶点。但目前发现的可资利用的这类抗原极其有限，且大多数在正常细胞上也低量表达，在应用时往往引起CAR-T细胞对正常细胞/器官的攻击，导致自身免疫症状，会产生严重副作用。因此，目前该领域正在着力运用二代测序技术寻找更多的新抗原。此外，即使找到这类新抗原，CAR-T治疗的个体化细胞生产也因高昂的成本和潜在的新癌化风险严重阻碍其应用，因此不得不诉诸通用型T细胞的创制。但通用型T细胞也并非完全通用，而仅仅是一种可用于罹患某种同一类型抗原型肿瘤患者的T细胞，对于不同抗原型的肿瘤，仍需制备其特异的T细胞。尽管如此，该类通用型CAR-T的研制，仍代表了肿瘤免疫疗法最新的实用化探索。因此，医学界正努力实现通用型T细胞的研制和临床应用，并已取得显著进展。例如，最近(2017年3月)美国FDA已经批准针对肿瘤抗原CD123的通用型CAR-T UCART123(Cellectis)进入临床试验。CD123抗原在急性骨髓性白血病(AML)细胞与母细胞性浆细胞样树突状细胞瘤(BPDCN)细胞上高度表达。这两种疾病都往往在骨髓中发病，且能在短期内威胁到患者的生命。通用型CAR-T UCART123可用于治疗这两种癌症的免疫治疗。必须指出，任何将病人细胞分离出来，进行体外培养、遗传操作等之后，再回输到病人体内的治疗方案，都存在体外操作带来的风险，尤其是遗传操作。因此，鉴于目前肿瘤免疫治疗尚面临的问题，需要开发新的肿瘤免疫治疗策略和技术。

NF-κB是一种可诱导型DNA结合转录因子，其在肝脏生理及肝炎肝癌病理过程中发挥的所有作用都是通过其调控的靶基因来实现的。例如，NF-κB之所以是一种重要的炎症相关转录因子，是因为它能调控炎症介质的表达。重要的炎症介质如TNF-a、IL-1、IL-6等都是NF-κB的直接靶基因。Bcl-2是公认的抗凋亡蛋白，多种肿瘤高表达Bcl-2。NF-κB抑制肿瘤细胞凋亡的作用正是NF-κB通过直接调控其靶基因Bcl-2的表达而实现的。目前，经过大量的科学研究和临床病例材料的检测分析，已经证明NF-κB几乎在所有肿瘤细胞中被广泛激活，因此NF-κB被视为一种优良的肿瘤治疗及药物筛选靶点。因此，许多制药公司和科学家都致力于研究NF-κB的抑制剂，但研究人员开发的许多药物在成功抑制NF-κB情况却出现了严重毒副作用而不能成为临床肿瘤治疗药物。究其原因，研究人员发现虽然过度激活的NF-κB对于癌细胞非常关键，但其正常的活化水平由于对健康细胞的正常生理功能也很重要。向细胞导入NF-κB抑制剂，因无法控制其数量，往往造成NF-κB活性的过度抑制，从而产生严重的副作用。

如今，基因治疗成为理想的疾病治疗策略，因为人类的绝大部分疾病均是由基因结构变异或是表达异常引起的，所以最理想的疾病治疗策略就是从基因水平上进行矫正。

发明内容

发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一种由NF-κB启动的肿瘤细胞特异效应基因表达载体，当该基因表达载体导入NF-κB活性过度活化的肿瘤细胞内时，细胞内过度活化的转录因子NF-κB就会激活该载体，使其表达载体上的效应基因。该基因表达载体基于细胞内NF-κB活性可以进行肿瘤免疫治疗，该基因表达载体可特异性在肿瘤细胞内表达效应基因，其表达产物为细胞表面的多肽或蛋白质，该细胞表面的多肽或蛋白质可作为一种新抗原蛋白，在机体内被免疫系统识别，产生免疫反应，引起免疫系统对肿瘤细胞的免疫杀伤。

本发明还公开了由NF-κB启动的肿瘤细胞特异效应基因表达载体的表达产物及其在制备用于肿瘤免疫治疗及成像试剂或药物中的应用。

技术方案：为了实现上述目的，如本发明所述一种由NF-κB启动的肿瘤细胞特异效应基因表达载体，其特征在于，包含两个序列元件，调控基因表达的启动子序列与启动子序列下游效应基因编码序列；所述启动子序列由一段NF-κB应答序列和最小启动子序列组成。

其中，所述NF-κB应答序列包括各种序列的NF-κB应答序列；所述NF-κB应答序列为一段可与NF-κB蛋白特异性结合的DNA序列，其主要序列特征为含有数量不同的各种NF-κB结合靶点。

所述启动子为一种NF-κB特异性启动子，即只有NF-κB可激活的启动子。

所述最小启动子包括各种来源的最小启动子序列，所述各种来源的最小启动子序列包括天然及人工筛选的最小启动子序列。如纯疱疹病毒胸苷激酶(herpes simplexvirus thymidine kinase，HSV-TK)启动子最小启动子；其主要作用是与基础转录因子及RNA聚合酶II结合，形成通用转录机器，构成基因表达的基本条件。

作为优选，所述调控基因表达的启动子序列尤指序列SEQ ID NO.1:5'-GGG AATTTC CGG GGA CTT TCC GGG AAT TTC CGG GGA CTT TCC GGG AAT TTC CTA GAG GGT ATATAA TGG AAG CTC GAC TTC CAG-3'。其中NF-κB应答序列(SEQ ID NO.2:5'-GGG AAT TTCCGG GGA CTT TCC GGG AAT TTC CGG GGA CTT TCC GGG AAT TTC C-3')，最小启动子序列(SEQ ID NO.3:5'-TAG AGG GTA TAT AAT GGA AGC TCG ACT TCC AG-3')。

其中，所述效应基因为编码一种细胞膜蛋白的基因，该蛋白突出在细胞膜外的部分则可以作为一种新抗原物质，刺激机体免疫系统，造成机体免疫系统对肿瘤细胞的免疫杀伤。

作为优选，所述效应基因为乙肝表面抗原编码基因HBsAg、链亲和素结合肽编码基因SBP或者钙网织蛋白编码基因CRT。

其中，基因表达载体为一线性(linear)或环状(circular)核酸分子。

更进一步地，所述核酸分子为脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)分子，包括双链DNA(如腺病毒DNA分子)、单链DNA(腺相关病毒分子)或单链RNA分子(如慢病毒RNA分子)等。

所述线性核酸分子包括普通线性DNA分子(如PCR扩增片段、酶切片段)、病毒DNA分子(如腺病毒DNA分子、腺相关病毒分子)或病毒RNA分子(如慢病毒RNA分子)等；所述环状核酸分子包括质粒DNA。

本发明所述的基因表达载体的基因表达方法，将基因表达载体导入NF-κB活性过度活化的肿瘤细胞内，细胞内过度活化的转录因子NF-κB就会激活该载体，使其表达载体上的效应基因。

其中，所述基因表达载体导入细胞的方法包括各种类型的核酸细胞导入方法。

作为优选，所述核酸细胞导入方法包括病毒载体、纳米载体、脂质体、电转移或基因枪等导入方式。

进一步地，所述基因表达载体导入细胞的方法为纳米载体及病毒载体导入。

所述基因表达载体导入细胞的方法最佳为腺相关病毒(AAV)载体。

本发明所述由NF-κB启动的肿瘤细胞特异效应基因表达载体的表达产物，所述表达产物为细胞表面的多肽或蛋白质。

其中，所述细胞表面的多肽或蛋白质可作为一种新抗原蛋白，在机体内被免疫系统识别，产生免疫反应，引起免疫系统对肿瘤细胞的免疫杀伤。

其中，所述细胞表面的多肽或蛋白质可作为一种肿瘤细胞人工标记，用于肿瘤的体内成像、诊断、细胞分离。

所述在细胞表面的多肽或蛋白质包括任何多肽或蛋白质，以及表达中经过细胞自身功能发生糖基化等修饰的多肽或蛋白质。

作为优选，所述多肽或蛋白质为乙肝表面抗原(HBsAg)、链亲和素结合肽(SBP)及钙网织蛋白(calreticulin，CRT)。

其中，链亲和素结合肽(SBP)也可用于肿瘤的体内成像及诊断，如利用链亲和素标记的MRI、CT、PET、近红外荧光等造影剂与表达在肿瘤细胞表面的SBP结合，进行肿瘤成像、诊断等。

本发明所述的基因表达载体为一种基于细胞内NF-κB活性进行肿瘤基因治疗的基因表达载体可以应用在肿瘤免疫治疗、成像中。本发明所述由NF-κB启动的肿瘤细胞特异效应基因表达载体在制备用于肿瘤免疫治疗及成像试剂或药物中的应用。

在现有技术中既然向细胞内导入NF-κB抑制剂由于其严重副作用无法形成可用于临床的药物，本发明可反其道而行之，利用NF-κB是一种转录因子且在肿瘤细胞内其活性均过度活化的特性，借助一种由NF-κB启动的肿瘤细胞特异效应基因表达载体实现肿瘤免疫治疗。

本发明的由NF-κB启动的肿瘤细胞特异效应基因表达载体基于细胞内NF-κB活性激活效应基因在NF-κB过度活化细胞内的基因表达的机理如原理示意图(图1)所示。图1反映本发明构建了一种基因表达载体,该基因表达载体含有NF-κB应答序列、最小启动子及效应基因三种元件；将该基因表达载体导入肿瘤细胞内时，肿瘤细胞内过度活化的转录因子NF-κB蛋白就会结合载体上的NF-κB应答序列，从而激活效应基因的表达；效应基因的表达产物为一种细胞膜蛋白，该蛋白突出在细胞膜外的部分则可以作为一种新抗原物质，刺激机体免疫系统，造成机体免疫系统对肿瘤细胞的免疫杀伤。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：

1、本发明设计了一种由肿瘤细胞中过度活化的转录因子NF-κB特异性启动表达的基因表达载体，该基因表达载体可特异性在肿瘤细胞内表达效应基因；该效应基因表达在细胞表面的多肽或蛋白质；细胞表面的多肽或蛋白质可作为一种新抗原蛋白，在机体内被免疫系统识别，产生免疫反应，引起免疫系统对肿瘤细胞的免疫杀伤。本发明通过设计的NF-κB特异性启动表达的基因表达载体进行的肿瘤治疗为一种新策略、新技术，革新了肿瘤敏免疫治疗的原理。

2、本发明提出的肿瘤免疫疗法突破了目前依赖肿瘤细胞表面存在的数量极其有限的自然抗原的约束，通过基因治疗技术在肿瘤细胞表面表达和创造一种人工抗原，以此引发机体强烈的免疫反应，杀灭机体内的肿瘤细胞。人工抗原不受种类和数量的限制。

3、由于本发明使用的是一种肿瘤细胞特异的基因表达载体系统，这种基因表达载体表达产物作为人工抗原只会表达在肿瘤细胞表面，而不会表达在正常细胞表面，从而避免了所激发的免疫反应对正常细胞的攻击，发挥非常特异地肿瘤细胞免疫攻击反应。因此，该基因表达载体对于肿瘤细胞进行免疫是一种肿瘤细胞高度特异的免疫疗法。

4、本发明设计的基因表达载体对于肿瘤细胞进行免疫的肿瘤免疫疗法可借助纳米载体或病毒载体，特别是安全性很好的腺相关病毒载体，将基因表达载体通过纳米载体或病毒载体的静脉给药，即可完成治疗，是一种无创基因治疗技术。从而避免了目前肿瘤治疗的手术、化疗、放疗、CAR-T制造等繁琐、危险、损伤性的治疗过程，非常有助于提高肿瘤患者的生活质量。

5、本发明设计和论证的NF-κB特异性激活基因表达载体不同于目前使用的NF-κB抑制剂，在治疗原理上不是抑制NF-κB，而是利用NF-κB，避免了使用NF-κB抑制剂进行肿瘤治疗的严重副作用，因此是一种截然不同的创新性很强的基于NF-κB的肿瘤治疗新策略。

6、本发明提出的肿瘤细胞特异的NF-κB启动基因表达载体可包装在腺相关病毒(AAV)中，利用AAV病毒作为基因治疗优良载体的特性，用于制备人体内肿瘤成像及治疗的药物中。目前AAV病毒载体可单针一次性注射进行疾病的基因治疗，因此，腺相关病毒(AAV)搭载了本发明设计和论证的NF-κB特异性激活基因表达载体后，有望成为治疗肿瘤的简单、无创(一次性静脉滴注)、高效的新型生物药物。这基本上已经确定了新疗法的药物剂型(AAV病毒)、给药方式(静脉滴注)、安全性(AAV载体)等关键成药性环节；为本发明技术的临床应用奠定了基础。

附图说明

图1为本发明由NF-κB启动的肿瘤细胞特异效应基因表达载体基于细胞内NF-κB活性激活效应基因在NF-κB过度活化细胞内的基因表达原理示意图；其中gene expressionvector为基因表达载体；NF-κB responsive sequence(NF-κB binding sequences)为NF-κB应答序列(NF-κB结合序列)；minimal promoter为最小启动子；effective gene为效应基因；transfection为转染；over activated transcription factor NF-κB为过度活化的转录因子NF-κB；NF-κB binding and gene expression activation为NF-κB结合及基因表达激活；effective gene expression为效应基因表达；effective gene products为效应基因产物；cell growth arrest/apoptosis/dead为细胞生长抑制/凋亡/死亡；NF-κB over-activated cell为NF-κB过度活化的细胞；

图2为NF-κB在不同细胞中表达的荧光定量PCR检测结果；可见NF-κB在肿瘤细胞中有表达，但在正常细胞中无表达；

图3为DMP-Display-SBP表达载体转染Hepa1-6、HepG2、MRC-5、HL7702、293T细胞后，对细胞进行FITC标记的链霉亲和素蛋白的染色，之后在白场(bright field)和绿色荧光(FITC)通道下对细胞显微拍照图；再将白场和绿色荧光通道图像的叠加，可见DMP控制的细胞表面展示(Display)的SBP仅在肿瘤细胞(Hepa1-6、HepG2、293T)中有表达，在正常细胞(MRC-5、HL7702)中无表达；

图4为DMP-Display-SBP表达载体转染HepG2、293T、HeLa、PANC-1、MDA-MB-453、HT-29、A549、SKOV-3、Hepa1-6、RAW264.7、B16F10、MRC-5、HL7702细胞后，对细胞进行IRDye800CW标记的链霉亲和素蛋白的染色，之后在近红外荧光扫描仪上扫描成像图；再对各孔荧光强度进行量化，可见DMP控制的细胞表面展示(Display)的SBP仅在肿瘤细胞(HepG2、293T、HeLa、PANC-1、MDA-MB-453、HT-29、A549、SKOV-3、Hepa1-6、RAW264.7、B16F10)中表达，在正常细胞(MRC-5、HL7702)中无表达；

图5为DMP-Display-SBP表达载体转染HepG2、293T、HeLa、PANC-1、MDA-MB-453、HT-29、A549、SKOV-3、Hepa1-6、RAW264.7、B16F10、MRC-5、HL7702细胞后，对细胞进行胰酶消化收集，再用IRDye800CW标记的链霉亲和素蛋白的染色；之后在近红外荧光扫描仪上扫描成像并在白场拍照图；可见DMP控制的细胞表面展示(Display)的SBP仅在肿瘤细胞(HepG2、293T、HeLa、PANC-1、MDA-MB-453、HT-29、A549、SKOV-3、Hepa1-6、RAW264.7、B16F10)中表达，在正常细胞(MRC-5、HL7702)中无表达；

图6为将DMP-Display-SBP包装成腺相关病毒(AAV)表达载体(AAV-SBP)后，用AAV-SBP转染293T、HepG2、Hepa1-6、MRC-5、HL7702细胞；对细胞进行IRDye800CW标记的链霉亲和素蛋白的染色，之后在近红外荧光扫描仪上扫描成像图(A图)；对细胞进行胰酶消化收集，再用IRDye800CW标记的链霉亲和素蛋白的染色，之后在近红外荧光扫描仪上扫描成像并在白场拍照图(B图)；可见包装成AAV病毒载体(AAV-SBP)，DMP控制的细胞表面展示表达的SBP可以高效地展示在肿瘤细胞(HepG2、293T、Hepa1-6)表面，在正常细胞(MRC-5、HL7702)中无表达；

图7为小鼠实验1的照片；其中AAV-HBsAg、AAV-SBP、AAV-CRT病毒载体在体外转染小鼠肝癌细胞Hepa1-6后，将病毒转染细胞与非转染细胞收获，分左右移植到小鼠皮下(左侧移植病毒转染细胞、右侧移植非转染细胞)，实验小鼠分AAV-HBsAg、AAV-SBP及AAV-CRT实验组3组，每组10只，细胞移植后饲养15日，对小鼠观察并拍照；

图8为图7中实验小鼠肿瘤大小测定结果示意图；其中AAV-HBsAg-L为图8中HBsAg实验组左侧肿瘤大小测定结果；AAV-HBsAg-R为图8中HBsAg实验组右侧肿瘤大小测定结果；AAV-SBP-L为图8中SBP实验组左侧肿瘤大小测定结果；AAV-SBP-R为图8中SBP实验组右侧肿瘤大小测定结果；AAV-CRT-L为图8中CRT实验组左侧肿瘤大小测定结果；AAV-CRT-R为图8中CRT实验组右侧肿瘤大小测定结果；*表示p值小于0.05(差异显著)，**表示p值小于0.01(差异极显著)；

图9为小鼠实验2的照片；其中实验小鼠分4组，分别为AAV-HBsAg、AAV-SBP、AAV-CRT及AAV-blank(空病毒以MCS表示)实验组；空病毒组11只；其他3组每组10只，对每组每只小鼠进行小鼠肝癌细胞Hepa1-6分左右皮下移植，细胞移植后饲养7日，之后对AAV-HBsAg、AAV-SBP、AAV-CRT及AAV-blank实验组小鼠分别进行AAV-HBsAg、AAV-SBP、AAV-CRT及AAV-blank病毒的静脉注射，病毒注射后继续饲养7日，对小鼠观察并拍照；

图10为图9中实验小鼠肿瘤大小测定结果示意图；其中AAV-MCS-L为图9中MCS实验组左侧肿瘤大小测定结果；AAV-MCS-R为图9中MCS实验组右侧侧肿瘤大小测定结果；AAV-HBsAg-L为图9中HBsAg实验组左侧肿瘤大小测定结果；AAV-HBsAg-R为图9中HBsAg实验组右侧肿瘤大小测定结果；AAV-SBP-L为图9中SBP实验组左侧肿瘤大小测定结果；AAV-SBP-R为图9中SBP实验组右侧侧肿瘤大小测定结果；AAV-CRT-L为图9中CRT实验组左侧肿瘤大小测定结果；AAV-CRT-R为图9中CRT实验组右侧肿瘤大小测定结果；AAV-MCS为rAAV-MCS-L及rAAV-MCS-R的合并；AAV-HBsAg为AAV-HBsAg-L及AAV-HBsAg-R的合并；AAV-SBP为AAV-SBP-L及AAV-SBP-R的合并；AAV-CRT为AAV-CRT-L及AAV-CRT-R的合并，图中显示了AAV-HBsAg、AAV-SBP及AAV-CRT组肿瘤大小分别与AAV-MCS组肿瘤大小的统计学显著性检验结果，**表示p值小于0.01(差异极显著)。

具体实施方式

以下结合实施例和附图对本发明作进一步说明。

实施例1

NF-κB RelA不同细胞表达

实验方法：

细胞培养：HEK-293T(人胎肾细胞)、HepG2(人肝癌细胞)、A549(人肺癌细胞)、HT-29(人结肠癌细胞)、HeLa(人宫颈癌细胞)、SKOV3(人卵巢癌细胞)、PANC-1(胰腺癌细胞)、MDA-MB-453(人乳腺癌)、Hepa1-6(小鼠肝癌细胞)、小鼠巨噬细胞(RAW264.7)、小鼠黑色素瘤细胞(B16F10)、HL7702(人正常肝细胞)及MRC5(人胚胎成纤维细胞)细胞培养，实施例中所用细胞均购自于中科院上海生命科学研究院。细胞培养使用DEME(Hepa1-6、HEK-293T、HepG2、HeLa、PANC-1、MDA-MB-453、RAW264.7、B16F10、MRC-5)或RPMI 1640培养基(A549、HT-29、SKOV-3、HL7702)、10％(v/v)胎牛血清(HyClone)、100units/mL青霉素和100μg/mL链霉素培养；培养环境为含有5％(v/v)CO₂的加湿培养箱中37℃培养。细胞复苏后，按同等密度接种到24孔微孔板(1×10⁵/孔)或12孔微孔板(2×10⁵/孔)中，培养过夜贴壁后，进行转染。

基因表达检测：收集细胞，用Trizol提取总RNA，逆转录合成互补DNA(cDNA)。cDNA制备反应及程序为：10μL反转录反应组分包含2μL5×PrimeScript RT Master Mix(Takara)、50ng总RNA，用RNase Free ddH₂O将反应总体积补至10μL；37℃反应15分钟，升温至85℃反应5秒使反转录酶失活，反应液4℃保存。通过qPCR定量分析RelA表达。用于qPCR的上下引物为5′-CCT>2O将反应总体积补至10μL。将配制好的反应体系放于荧光定量PCR仪(StepOne>

实验结果：

为了考察NF-κB RelA/p65基因在各种肿瘤细胞及正常细胞中的表达，用荧光定量PCR检测了NF-κB RelA/p65在11种肿瘤细胞及正常细胞(HL7702及MRC-5)中的表达(图2)。结果表明在所有肿瘤细胞株中NF-κB RelA/p65均有表达，而在正常细胞(HL7702及MRC5)中，检测不得到NF-κB表达。说明用本发明提出的NF-κB激活基因表达载体是一种NF-κB过度活化细胞特异的基因表达载体，如肿瘤细胞中NF-κB激活基因表达载体的表达。

实施例2

DMP-Display-SBP(效应基因细胞表面表达)

实验方法：

载体构建：构建一表达载体DMP-Display-SBP；该载体含有DMP序列及可细胞表达链亲和素结合肽(SBP)的编码序列。其中DMP含有NF-κB应答序列SEQ ID NO.2:(5'-GGG AATTTC CGG GGA CTT TCC GGG AAT TTC CGG GGA CTT TCC GGG AAT TTC C-3')以及最小启动子序列SEQ ID NO.3:(5'-TAG AGG GTA TAT AAT GGA AGC TCG ACT TCC AG-3')。SBP编码序列SEQ ID NO.4:ATG GAC GAG AAG ACC ACC GGG TGG CGG GGC GGC CAC GTT GTG GAGGGT CTC GCT GGC GAG CTG GAG CAG CTC AGG GCC CGC TTG GAG CAC CAT CCC CAG GGGCAA CGC GAG CCT ATC GAT TAA。展示表达的骨架序列克隆自载体pDisplay^TM(Invitrogen)；pDisplay^TM将要展示在细胞膜表面的蛋白或多肽融合在大鼠Igκ-链引导序列(Igκ-chain>

细胞培养：HEK-293T(人胎肾细胞)、HepG2(人肝癌细胞)、A549(人肺癌细胞)、HT-29(人结肠癌细胞)、HeLa(人宫颈癌细胞)、SKOV3(人卵巢癌细胞)、PANC-1(胰腺癌细胞)、MDA-MB-453(人乳腺癌)、Hepa1-6(小鼠肝癌细胞)、小鼠巨噬细胞(RAW264.7)、小鼠黑色素瘤细胞(B16F10)、HL7702(人正常肝细胞)及MRC5(人胚胎成纤维细胞)细胞培养。细胞培养使用DEME(Hepa1-6、HEK-293T、HepG2、HeLa、PANC-1、MDA-MB-453、RAW264.7、B16F10、MRC-5)或RPMI 1640培养基(A549、HT-29、SKOV-3、HL7702)、10％(v/v)胎牛血清(HyClone)、100units/mL青霉素和100μg/mL链霉素培养；培养环境为含有5％(v/v)CO₂的加湿培养箱中37℃培养。细胞复苏后，按同等密度接种到24孔微孔板(1×10⁵/孔)或12孔微孔板(2×10⁵/孔)中，培养过夜贴壁后，进行转染。

细胞转染：细胞培养液换为无血清培养基培养1h。分别用DMP-Display-SBP转染上述细胞。空脂质体转染的细胞作为转染对照。每孔细胞的总DNA用量及脂质体用量参考脂质体产品(Lipofectamine 2000；ThermoFisher Scientific)说明书进行。DNA-脂质体加入无血清培养基培养4h。换为含血清新鲜培养基，继续培养20h。

细胞染色：用FITC标记的链亲和素及其IRDye800CW(一种近红外荧光分子；LiCor公司)标记的链亲和素(LiCor)对细胞染色。细胞转染后再新鲜培养基中直接加入用FITC标记的链亲和素或IRDye800CW标记的链亲和素(终浓度均为1μg/mL)。细胞继续培养20h，去除培养基，PBS洗涤细胞2次。细胞用荧光显微镜或近红外荧光扫描仪(Odyssey，LiCor)扫描成像。细胞观察：用倒置荧光显微镜(Olympus IX51-DPI71)观测拍照各种处理的细胞，主要观察细胞表面是否产生绿色荧光；同时观察细胞生长情况，如生长旺盛、贴壁良好、无污染等。对各种处理的细胞进行多视野明场及绿色荧光观察通道的照相拍摄。

实验结果：

用DMP-Display-SBP表达载体转染Hepa1-6、HepG2、MRC-5、HL7702、293T细胞；对细胞进行FITC标记的链霉亲和素蛋白的染色，之后在白场(bright field)和绿色荧光(FITC)通道下对细胞显微拍照；再将白场和绿色荧光通道图像的叠加(图3)。可见DMP控制的细胞表面展示(Display)的SBP仅在肿瘤细胞(Hepa1-6、HepG2、293T)中有表达，在正常细胞(MRC-5、HL7702)中无表达(图2)。

用DMP-Display-SBP表达载体转染HepG2、293T、HeLa、PANC-1、MDA-MB-453、HT-29、A549、SKOV-3、Hepa1-6、RAW264.7、B16F10、MRC-5、HL7702细胞后，对细胞进行IRDye800CW标记的链霉亲和素蛋白的染色，之后在近红外荧光扫描仪上扫描成像；再对各孔荧光强度进行量化。可见DMP控制的细胞表面展示(Display)的SBP仅在肿瘤细胞(HepG2、293T、HeLa、PANC-1、MDA-MB-453、HT-29、A549、SKOV-3、Hepa1-6、RAW264.7、B16F10)中表达，在正常细胞(MRC-5、HL7702)中无表达(图4)。

用DMP-Display-SBP表达载体转染HepG2、293T、HeLa、PANC-1、MDA-MB-453、HT-29、A549、SKOV-3、Hepa1-6、RAW264.7、B16F10、MRC-5、HL7702细胞后，对细胞进行胰酶消化收集，再用IRDye800CW标记的链霉亲和素蛋白的染色；之后在近红外荧光扫描仪上扫描成像并在白场拍照。可见DMP控制的细胞表面展示(Display)的SBP仅在肿瘤细胞(HepG2、293T、HeLa、PANC-1、MDA-MB-453、HT-29、A549、SKOV-3、Hepa1-6、RAW264.7、B16F10)中表达，在正常细胞(MRC-5、HL7702)中无表达(图5)。

用将DMP-Display-SBP包装成腺相关病毒(AAV)表达载体(AAV-SBP)后，用AAV-SBP转染293T、HepG2、Hepa1-6、MRC-5、HL7702细胞。对细胞进行IRDye800CW标记的链霉亲和素蛋白的染色，之后在近红外荧光扫描仪上扫描成像(图6A)；对细胞进行胰酶消化收集，再用IRDye800CW标记的链霉亲和素蛋白的染色，之后在近红外荧光扫描仪上扫描成像并在白场拍照(图6B)。可见包装成AAV病毒载体(AAV-SBP)，DMP控制的细胞表面展示表达的SBP可以高效地展示在肿瘤细胞(HepG2、293T、Hepa1-6)表面，在正常细胞(MRC-5、HL7702)中无表达(图6)。

实施例3

AAV-HBsAg、AAV-SBP、AAV-CRT免疫治疗小鼠肿瘤

实验方法：

pDMP-Display载体构建：同实施例2构建pDMP-Display-SBP载体。按pDMP-Display-SBP载体的构建程序构建制备pDMP-Display-HBsAg及pDMP-Display-CRT载体。

其中HBsAg的编码序列如SEQ ID NO.5所示，CRT的编码序列如SEQ ID NO.6所示。

rAAV-DMP病毒载体构建：AAV-Helper-Free System(Stratagene)用于实验。首先，构建了三种载体pDMP-Display-SBP，pDMP-Display-HBsAg和pDMP-Display-CRT。设计了CRT和HBsAg基因的引物。以人基因组DNA和乙肝病毒基因组DNA作为模板，通过PCR扩增分别获得获得CRT和HBsAg基因序列。将pAAV-MCS载体中的CMV启动子替换为DMP启动子以构建名为pAAV-DMP的载体。

pAAV-DMP-Display-HBsAg、pAAV-DMP-Display-SBP、pAAV-DMP-Display-CRT载体构建：将pDMP-Display-SBP，pDMP-Display-HBsAg和pDMP-Display-CRT载体中的“展示-效应基因”功能片段，即Display-SBP、Display-HBsAg和Display-CRT，通过酶切割分别插入pAAV-DMP载体中，构建pAAV-DMP-Display-HBsAg、pAAV-DMP-Display-SBP、pAAV-DMP-Display-CRT载体。限制性位点：上游Bgl II，下游Pst I。

用293T细胞检测质粒pAAV-DMP-Display-SBP：将293T细胞以每孔1×10⁵个细胞的密度接种在24孔板中并培养12小时。然后使用Lipofectamine>

病毒制备：用pAAV-DMP-Display-SBP、pAAV-DMP-Display-HBsAg和pAAV-DMP-Display-CRT分别与两种辅助质粒pHelper和pAAV-RC共转染293T细胞。转染72小时后，收集细胞和培养基，反复冻融3次。向细胞冻融液中加入1/10体积的氯仿，37℃剧烈振荡1小时。加入终浓度为1mol/L的固体NaCl，4℃下12000转/分钟离心5分钟，转移上层水相，弃去氯仿和沉淀。在上层水相中加入PEG8000至终浓度达1％(w/v)，然后将溶液保持在冰浴中1小时。然后，液体以11000转/分钟离心15分钟，弃上清。沉淀用磷酸缓冲盐(PBS)溶液洗涤并悬浮。加入DNase和RNase至终浓度为1μg/mL，然后将溶液在室温下保温30分钟。最后，将等体积的氯仿加入到液体中以提取重组病毒。所获得的病毒分别简称为：AAV-SBP、AAV-HBsAg和AAV-CRT。通过实时PCR确定病毒浓度。实时PCR扩增引物见下表：

小鼠实验1(病毒转染细胞植瘤实验)：将小鼠肝癌细胞以1×10⁵细胞/孔的密度接种到24孔中，培养12小时。用AAV-HBsAg、AAV-SBP及AAV-CRT病毒载体分别转染在体外转染小鼠肝癌细胞Hepa1-6。转染剂量为5×10⁵vg/细胞；vg为virus>7细胞/处。实验小鼠分AAV-HBsAg、AAV-SBP及AAV-CRT实验组3组，每组10只。细胞移植后饲养15日，对小鼠观察并拍照。实验小鼠品系为BALB/c-Foxn1^nu。所有实验小鼠均为4周龄雌鼠。所有实验小鼠均购自常州卡文斯实验动物有限公司。

小鼠实验2(病毒血液注射抑制小鼠皮下移植瘤实验)：实验小鼠分4组，分别为AAV-HBsAg、AAV-SBP、AAV-CRT及AAV-Control实验组，每组10只。对每组每只小鼠进行小鼠肝癌细胞Hepa1-6分左右皮下移植。移植剂量为1×10⁷细胞/处。细胞移植后饲养7日，对小鼠观察并拍照。之后对AAV-HBsAg、AAV-SBP、AAV-CRT及AAV-blank实验组小鼠分别进行AAV-HBsAg、AAV-SBP、AAV-CRT及AAV-Control病毒的静脉注射。注射剂量为1×10⁹vg/只小鼠。病毒注射后继续饲养7日，对小鼠观察并拍照。实验小鼠品系为BALB/c-Foxn1^nu。所有实验小鼠均为4周龄雌鼠。所有实验小鼠均购自常州卡文斯实验动物有限公司。

实验结果：

小鼠实验1的实验结果如图7、图8所示。小鼠实验1的实验小鼠图片如图7所示，可见接种了AAV-HBsAg、AAV-SBP、AAV-CRT病毒体外转染小鼠肝癌细胞Hepa1-6的一侧，在AAV-HBsAg和AAV-SBP组中，90％的个体肿瘤生长被显著抑制，未见肿瘤生长。在AAV-HBsAg组中有4只个体，不但接种AAV-HBsAg转染肝癌细胞一侧的肿瘤消失，而且接种AAV-HBsAg未转染肝癌细胞一侧的肿瘤也消失了。在AAV-SBP组中有3只个体，不但接种AAV-SBP转染肝癌细胞一侧的肿瘤消失，而且接种AAV-SBP未转染肝癌细胞一侧的肿瘤也消失了。在AAV-CRT组中，70％的个体接种了AAV-CRT转染肝癌细胞一侧的肿瘤消失了；其中1只接种AAV-SBP未转染肝癌细胞一侧的肿瘤也消失了。可见该实验取得非常理想的治疗效果。对3组实验小鼠的肿瘤大小进行测定并进行统计学检验，结果如图8所示，表明AAV-HBsAg、AAV-SBP及AAV-CRT病毒的转染显著抑制了皮下移植瘤的生长，说明这些病毒载体的转染是细胞表面产生新生抗原HBsAg、SBP及CRT，引发机体免疫反应，强烈抑制了肿瘤生长，甚至消除肿瘤细胞。

小鼠实验2的实验结果如图9、图10所示。小鼠实验2的实验小鼠图片如图9所示，实验小鼠分4组，分别为AAV-HBsAg、AAV-SBP、AAV-CRT及AAV-blank(空病毒以MCS表示)实验组；空病毒组为11只小鼠；其他3组每组10只。对每组每只小鼠进行小鼠肝癌细胞Hepa1-6分左右皮下移植。细胞移植后饲养7日。之后对AAV-HBsAg、AAV-SBP、AAV-CRT及AAV-Control实验组小鼠分别进行AAV-HBsAg、AAV-SBP、AAV-CRT及AAV-Control病毒的静脉注射。病毒注射后继续饲养7日，对小鼠观察并拍照。对4组实验小鼠的肿瘤大小进行测定并进行统计学检验，结果如图10所示，表明AAV-HBsAg、AAV-SBP及AAV-CRT病毒的血液注射，病毒到达肿瘤组织并转染肿瘤细胞，表达产生新生抗原HBsAg、SBP及CRT，引发机体免疫反应，强烈抑制了肿瘤生长，甚至消除肿瘤细胞。同时也说明血液注射的AAV-HBsAg、AAV-SBP及AAV-CRT病毒可快速到达并转染肿瘤细胞，发挥肿瘤免疫治疗作用。

序列表

<110>东南大学

<120>一种由NF-κB启动的肿瘤细胞特异效应基因表达载体及其表达产物和应用

<160>12

<170>SIPOSequenceListing 1.0

<210>1

<211>84

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>1

gggaatttcc ggggactttc cgggaatttc cggggacttt ccgggaattt cctagagggt60

atataatgga agctcgactt ccag 84

<210>2

<211>52

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>2

gggaatttcc ggggactttc cgggaatttc cggggacttt ccgggaattt cc52

<210>3

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>3

tagagggtat ataatggaag ctcgacttcc ag32

<210>4

<211>123

<212>DNA

<213>链亲和素结合肽(SBP)

<400>4

atggacgaga agaccaccgg gtggcggggc ggccacgttg tggagggtct cgctggcgag60

ctggagcagc tcagggcccg cttggagcac catccccagg ggcaacgcga gcctatcgat 120

taa 123

<210>5

<211>1200

<212>DNA

<213>乙肝表面抗原(HBsAg)

<400>5

atgggaggtt ggtcttccaa acctcgaaaa ggcatgggga caaatctttc tgtccccaat60

cccctgggat tcttccccga tcatcagttg gaccctgcat tcaaagccaa ctcagaaaat 120

ccagattggg acttcaaccc gcacaaggac aactggccgg acgccaacaa ggtgggagtg 180

ggagcattcg ggccagggtt cacccctccc catgggggac tgttggggtg gagccctcag 240

gctcagggtc tactcacaac tgtgccagca gctcctcctc ctgcctccac caatcggcag 300

tcaggaaggc agcctactcc cttatctcca cctctaaggg acactcatcc tcaggccatg 360

cagtggaact ccaccacttt ccaccaaact ctgcaagatc ccagagtcag ggccctgtac 420

tttcctgctg gtggctccag ttcaggaaca gtgagccctg ctcagaatac tgtctctgcc 480

atatcgtcaa tcctatcgaa gactggggac cctgtaccga acatggagaa catcgcatca 540

ggactcctag gacccctgct cgtgttacag gcggggtttt ccttgttgac aaaaatcctc 600

acaataccac agagtctaga ctcgtggtgg acttctctca attttctagg gggaacaccc 660

gtgtgtctcg gccaaaattc gcagtcccaa atctccagtc actcaccaac ctgttgtcct 720

ccaatttgtc ctggttatcg ctggaggtgt ctgcggcgtt ttatcatctt cctctgcatc 780

ctgctgctat gcctcatctt cttgttggtt cttttggact atcaaggtat gttgcccgtt 840

tgtcctctaa ttccaggatc atcaacaacc agcaccggac catgcaaaac ctgcacaact 900

cctgctcaag gaacctctat gtttccctca tgttgctgta caaaacctac ggacggaaac 960

tgcacctgta ttcccatccc atcatcttgg gctttcgcaa aatacctatg ggagtgggcc1020

tcagtccgtt tctcttggct cagtttacta gtgccatttg ttcagtggtt cgtagggctt1080

tcccccactg tctggctttc agttatatgg atgatgtggt tttgggggcc aagtctgtac1140

aacatcttga gtccctttat gccgctgtta ccaattttct tttgtctttg ggtatacatt1200

<210>6

<211>1239

<212>DNA

<213>钙网织蛋白(CRT)

<400>6

atgctgctat ccgtgccgct gctgctcggc ctcctcggcc tggccgtcgc cgagcctgcc60

gtctacttca aggagcagtt tctggacgga gacgggtgga cttcccgctg gatcgaatcc 120

aaacacaagt cagattttgg caaattcgtt ctcagttccg gcaagttcta cggtgacgag 180

gagaaagata aaggtttgca gacaagccag gatgcacgct tttatgctct gtcggccagt 240

ttcgagcctt tcagcaacaa aggccagacg ctggtggtgc agttcacggt gaaacatgag 300

cagaacatcg actgtggggg cggctatgtg aagctgtttc ctaatagttt ggaccagaca 360

gacatgcacg gagactcaga atacaacatc atgtttggtc ccgacatctg tggccctggc 420

accaagaagg ttcatgtcat cttcaactac aagggcaaga acgtgctgat caacaaggac 480

atccgttgca aggatgatga gtttacacac ctgtacacac tgattgtgcg gccagacaac 540

acctatgagg tgaagattga caacagccag gtggagtccg gctccttgga agacgattgg 600

gacttcctgc cacccaagaa gataaaggat cctgatgctt caaaaccgga agactgggat 660

gagcgggcca agatcgatga tcccacagac tccaagcctg aggactggga caagcccgag 720

catatccctg accctgatgc taagaagccc gaggactggg atgaagagat ggacggagag 780

tgggaacccc cagtgattca gaaccctgag tacaagggtg agtggaagcc ccggcagatc 840

gacaacccag attacaaggg cacttggatc cacccagaaa ttgacaaccc cgagtattct 900

cccgatccca gtatctatgc ctatgataac tttggcgtgc tgggcctgga cctctggcag 960

gtcaagtctg gcaccatctt tgacaacttc ctcatcacca acgatgaggc atacgctgag1020

gagtttggca acgagacgtg gggcgtaaca aaggcagcag agaaacaaat gaaggacaaa1080

caggacgagg agcagaggct taaggaggag gaagaagaca agaaacgcaa agaggaggag1140

gaggcagagg acaaggagga tgatgaggac aaagatgagg atgaggagga tgaggaggac1200

aaggaggaag atgaggagga agatgtcccc ggccaggcc 1239

<210>7

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>7

ggaagatcta tgctgctatc cgtgccg27

<210>8

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>8

aaaactgcag ggcctggccg gggacat27

<210>9

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>9

ggaagatcta tgggaggttg gtcttccaa29

<210>10

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>10

aaaactgcag aatgtatacc caaagaca 28

<210>11

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>11

cgcacgcgtg gacggcctaa ctggccggt29

<210>12

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>12

ttgcctcgag cagcccgtat taccgccact ggtt34