hTERT启动子调节HSV-TK和IL-12融合基因肿瘤细胞特异性表达载体的构建及其表达鉴定

摘要

目的：为在肿瘤基因治疗领域展开更深入的研究，探索新的肿瘤基因治疗策略，我们构建了由人端粒酶逆转录酶启动子（hTET启动子）调控的单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）和人白细胞介素12（hIL-12）融合基因表达载体，并鉴定其在细胞中的表达，为其进一步研究奠定了实验基础。
　　 方法：分别以人Hela细胞基因组、pNZTK2、pCMV6-XLAp4p40和人脾文库为模板，利用PCR法分别扩增hTERT启动子序列、HSV-TK序列、人IL-12p40和IL-12p35序列.将人IL-12p40和IL-12p35基因利用重组PCR法融合成人IL-12p70基因。之后，再次利用重叠扩增法对IL-12p70的单一位点进行突变。并将合成的hTERT启动子基因、HSV-TK基因、人IL-12p70点突变基因分别克隆至pShuttle载体上，合成pShuttle-hTERTp-HSV-TK-linker-IL-12融合基因表达载体。酶切和测序检验结果表明载体正确无误。使用VigoFect试剂盒将合成载体转染293T细胞，利用western-blot法和细胞间接免疫荧光法检测其在细胞中的表达。
　　 结果：各基因片段成功扩增，大小分别为1084bp、1173bp和1557bp，与预期大小相符合，并成功联结至pshuttle载体上。对所构建新载体分别行酶切鉴定，结果显示各融合基因片段酶切大小与预期大小相符。同时，DNA序列测定结果显示，IL-12p70点突变构建成功，其他碱基与目标序列完全一致，无突变发生。将构建成功pShuttle-hTERTp-HSV-TK-linker-IL-12载体转染293T细胞后，使用western-blot法和间接免疫荧光法分别进行表达鉴定，只有转染pShuttle-hTERTp-HSV-TK-linker-IL-12融合基因表达载体的细胞裂解物中能够检测到融合基因的表达且能明显观察到FITC的绿色荧光，而转染空载体的细胞中则未检测到，证明构建载体在细胞水平有所表达。
　　 结论：成功构建了肿瘤特异性启动子调控的融合基因表达载体pShuttle-hTERTp-HSV-TK-linker-IL-12，并成功地在细胞中表达。为进一步应用肿瘤特异性启动子调控的融合基因载体治疗肿瘤奠定了坚实基础。

目录

文摘

英文文摘

前言

材料与方法

1.材料

1.1 引物合成及序列测定

1.2 菌株和细胞株

1.3 质粒及基因组

1.4 分子生物学工具酶

1.5 常用试剂盒

1.6 细胞培养试剂

1.7 抗体

1.8 主要实验仪器

2 方法

2.1 重组表达载体的构建

2.2 重组表达载体的表达鉴定

结 果

第一部分 重组表达载体的构建

1.1 hTERT启动子的特异性扩增

1.2 HSV-TK-linker基因的特异性扩增

1.3 人IL-12 p40基因的扩增

1.4 人IL-12 p35基因的扩增

1.5 人IL-12 p70基因的重组扩增

1.6 人IL-12 p70基因点突变体上下游的扩增

1.7 人IL-12 p70点突变全长基因的重组扩增

1.8 pShuttle-hTERTp-HSV-TK-linker-IL-12重组质粒的鉴定

第二部分 重组表达载体的表达鉴定

2.1 重组表达载体转染细胞的western-blot检测

2.2 重组表达载体转染细胞的细胞间接免疫荧光检测

结论总结

讨 论

参考文献

文献综述

参考文献

附 录

在读期间发表论文

致谢