无抗性筛选双抗原锚定表达载体pLQ2a及制备方法

摘要

本发明公开了无抗性植物乳杆菌锚定表达载体pLQ2a，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示；它是生物安全外源蛋白表达系统，以

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及植物乳杆菌无抗性筛选双抗原锚定表达载体pLQ2a及制备方法。

背景技术

植物乳杆菌（Lactobacillus>，L.>）作为一种肠道宿主菌株可耐受胃内低pH值、高盐的环境，最适生长温度为30-37 ℃，能耐受10℃左右的低温，但在45℃以上的环境中出现生长抑制，常见于奶油、肉类、蔬菜等制成的发酵食品并可从多数植物中分离得到，故因此得名。研究表明，植物乳杆菌符合美国食品与药品管理局（FDA）的GRAS（Generally Recognized as Safe）规定以及欧洲食品安全局（EFSA）的安全资格认证（Qualified Presumption of Safety）标准，通常定殖于人和动物的消化道中并发挥益生作用，利用该菌株制成的微生态制剂能够增强机体免疫力，可有效防止一些胃肠道疾病的发生。同时，该菌株也是良好的外源蛋白表达系统，以其作为口服药用蛋白载体很大程度上解决了蛋白易在消化道中发生水解的问题，从而使多种口服药用蛋白都能有效地发挥防治疾病的作用。

pSIP409系列质粒是植物乳杆菌特有的穿梭质粒载体，由于它具备pUC来源于大肠杆菌（Escherichia>，E.coli）和256rep来源于植物乳杆菌两个复制子，因此它可以在大肠杆菌中复制并在植物乳杆菌中进行外源蛋白的表达。但该系列质粒载体使用了红霉素抗性基因(erythromycin，EM)作为筛选标记，一旦抗性基因转移到宿主染色体内，很可能产生严重的生物安全隐患，因此该系统潜在的应用价值受到了限制。另外，Nguyen等认为红霉素在酸性条件下会发生降解，这对外源基因的诱导表达造成了不利的影响。红霉素也会使菌体产生“生理应激”，从而影响目的基因表达。所以我们要用非抗生素筛选标记代替该载体的抗生素抗性基因并使改建后载体能在受体菌植物乳杆菌NC8/Δalr（L.>NC8/Δalr）中稳定复制表达外源蛋白，从而使我们的乳酸菌制品达到对机体无害要求。

丙氨酸消旋酶（Alanine Racemase，alr）基因广泛存在于原核生物基因组中，该基因可将L-丙氨酸转化为D-丙氨酸，D-丙氨酸是细胞壁中重要的交联成分，是菌株生长的必需物质，因此该酶对原核细胞的生长至关重要。虽然绝大多数微生物都含有两种丙氨酸消旋酶基因：生物合成型（Biosynthetic Alanine Racemase，alr)和代谢型（CatabolicAlanine Racemase，dadX/B），但对于乳酸乳球菌和乳酸杆菌来说，丙氨酸消旋酶由单一alr基因所编码，alr基因缺失株在普通MRS培养基中不生长，只有在额外添加D-丙氨酸消旋酶由单一alr基因所编码，alr基因缺失株在普通MRS培养基中不生长，只有在额外添加D-丙氨酸的培养基中生长，利用alr基因作为筛选标记相关研究在国外已有成功的范例，在选择压力下，带有alr标记的质粒具有较高的稳定性，并且在绝大多数发酵培养基中不会出现D-丙氨酸，因此本研究采用alr基因作营养互补型植物乳杆菌非抗生素性筛选标记。

大肠杆菌asd 基因编码天冬氨酸 β-半醛脱氢酶，是二氨基庚二酸(DAP)合成途径中的关键酶，DAP 是革兰氏阴性菌细胞壁上肽聚糖的基本成分，asd 基因发生缺失突变后，由于不能合成细胞壁而导致溶菌死亡。因此选用大肠杆菌asd>E.coli>

发明内容

本发明的目的是为解决植物乳杆菌细胞壁厚，外源质粒电转化素宿主菌及植物乳杆菌连接产物筛选阳性重组子困难的问题，而提供一种既能在E.coli>L.>>

植物乳杆菌无抗性筛选双抗原锚定表达载体pLQ2a，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

植物乳杆菌无抗性筛选双抗原锚定表达载体pLQ2a的制备方法，它包括：

1）双锚定表达载体命名为pSIP409PgsA’-1261的制备

参照质粒pLP-1261 Inv上LP-1261基因序列设计含有同源手臂端的无缝克隆引物，并在LP-1261的上游添加SD序列（AGGAAACAGACC）和HindⅢ酶切位点，下游添加SalI和HindⅢ酶切位点，扩增含有同源手臂端298bp的LP-1261序列，引物序列如下：

1261F:TTCGAA>AGGAAACAGACC>

1261R:CACGTGCTGTAATTTGAAGCTTGTCGACCGCCGCAATCGTGCC；

将锚定表达载体pSIP409PgsA’用HindⅢ单酶切，获得线性化载体pSIP409PgsA’（HindⅢ）6202bp；将锚定序列LP-1261与pSIP409PgsA’无缝克隆连接，将连接产物化学法转化E.coli TOP10感受态细胞，利用红霉素抗性基因筛选阳性克隆，获得双锚定表达载体命名为pSIP409PgsA’-1261；

2）P23-alr-asd基因制备

参照PYA4545载体asd基因序列，NCBI公布的P23启动子和植物乳杆菌alr基因序列将asd基因，P23启动子和alr基因串联，获得P23-alr-asd基因并人工合成（大小3027bp），其碱基序列如SEQ ID NO.2所示；

3）用P23-alr-asd基因替换载体pSIP409PgsA’-1261上红霉素（EM）基因获得无抗性筛选标记锚定表达载体pLQa

用P23-alr-asd基因替换载体pSIP409PgsA’-1261上红霉素基因，参照基因序列pSIP409PgsA’-1261设计引物，扩增去除红霉素基因5405bp的409PgsA’-1261片段，引物如下：

LPS F:TTCTATGAGTCGCTTTTTTAAATTTG

LPS R:GGATCCCGCACGCATAGCGGTGC；

将扩增的409PgsA’-1261纯化后与P23-alr-asd无缝克隆连接，电转化E.coli6212/Δasd感受态细胞，铺普通LB固体培养基，利用asd基因与宿主菌实现营养互补筛选阳性克隆，测序鉴定正确的双抗原锚定表达质粒命名为pLQa；

4）pLQ2a载体构建

引入三个HindⅢ酶切位点，将alr基因内的HindⅢ酶切位点AAGCTT突变为AAACTT，点突变引物如下：

Hind F:CCAGTCTCTGGCATCAAACTTGCAATGGCAAC

Hind R:TTTGATGCCAGAGACTGGTGGCCGAATTGGAC；

同时载体上还含有两处Sal I酶切位点，将alr基因下游的Sal I酶切位点GTCGAC突变GTAGAC，引物如下：

1261ATT F:>

1261ATT R:TACAACATCAGGTAGTGACACTTCTTTGACCTG；

以质粒pLQa为模板PCR扩增产物纯化后，用Dpn I限制性内切酶处理后，电转化E.coli6212/Δasd感受态细胞，经过两次突变后的筛选阳性载体命名为pLQ2a，载体总计8432bp。

发明详述：由于植物乳杆菌属于革兰氏阳性菌，细胞壁厚，外源质粒电转化素宿主菌有一定的难度，如果将连接产物直接电转化效率更低，很难筛选到阳性重组子，甚至筛选不出来重组子，笔者在利用植物乳杆菌作为宿主菌构建无抗性筛选表达载体遇到了同样问题，所以选用比较容易筛选阳性重组子的革兰氏阴性菌大肠杆菌asd>E.coli6212/Δasd作为中间宿主菌，将asd-alr基因串联替换植物乳杆菌诱导表达载体上红霉素标记基因，连接产物先电转化入asd>E.coli>asd基因与宿主菌E.coli>alr缺失L.> NC8/Δalr，利用质粒上的alr基因与L.> NC8/Δalr营养互补筛选阳性重组质粒，解决了植物乳杆菌连接产物筛选阳性重组子困难的问题，同时实现了无抗性筛选目的。

跨膜结构域锚定模型聚-γ-谷氨酸合成酶A（Poly-γ-Glutamic AcidSynthetase A，pgsA）是枯草芽孢杆菌（Bacillus>）多聚谷氨酸合成酶系统PGA的组成蛋白，它可以作为一种细菌表面展示元件将该酶系统稳定地锚定在细胞壁表面。脂蛋白锚定模型Lp_1261（lipoprotein anchor）是植物乳杆菌ABC转运体底物结合蛋白（peptide ABC transporter substrate-binding）能将外源蛋白稳定的锚定表达在植物乳杆菌表面，本发明利用pgsA和Lp_1261两种锚定模型，在其间添加了SD序列，并通过营养互补筛选标记alr-asd将两种荧光蛋白EGFP和Mcherry同时锚定表达在植物乳杆菌表面，实现了双抗原共同锚定表达，拓宽了乳酸菌作为载体表达外源基因的应用，为进一步研究乳酸菌作为口服药用蛋白载体的应用奠定基础，构建无抗性筛选锚定表达载体pLQ2a实现了即能在E.coli 6212/Δalr中复制又能在L. plantarum NC8/Δalr中锚定表达双抗原。

本发明提供了无抗性植物乳杆菌锚定表达载体pLQ2a，它是生物安全外源蛋白表达系统，以asd缺失株E.coli>alr缺失L.> NC8/Δalr为宿主菌，将来源于乳酸乳球菌（Lactococcus>subsp. cremoris strain JM4）基因组上P23启动子作为alr基因表达的启动子，以pYA4545，pYA4545-Mcherry，pLP-1261>

附图说明

图1 质粒409eat和409eatf用PstI和SalI双酶切电泳图，（M：DL5000DNA分子量标准，从上到下分子量依次为：5000bp、3000bp、2000bp、1500bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp，其中750bp加亮；1-2：409eatf质粒酶切，载体片段长度4436bp和P23Alr tf长度1336bp ；3-4：409eat质粒酶切，载体片段4436bp和P23Alr t长度1312bp；

图2 409eatf 电转 L.plantarumNC8/Δalr 1号和3号菌的Western blotting 结果，M: 蛋白质分子量标准，从上到下分子量依次为：70kDa、50kDa、40kDa、20kDa；1：阴性对照L.>plantarumNC8/Δalr>L.>NC8/Δalr>L. plantarum>NC8/Δalr>L.>NC8/Δalr>L.>NC8/Δalr409eatf1上清；>L.>NC8/Δalr>

图3 E.coli 6212/Δasd- 409ata菌落PCR鉴定，M：DL5000DNA分子量标准，从上到下分子量依次为：5000bp、3000bp、2000bp、1500bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp，其中750bp加亮；1-8：E.coli>

图4 409ata质粒HindⅢ单酶切电泳图，M：DL5000DNA分子量标准，从上到下分子量依次为：5000bp、3000bp、2000bp、1500bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp，其中750bp加亮；1：409ata质粒酶切，大片段长度4305bp和小片段长度2035bp；

图5 409ata电转L.plantarumNC8/Δalr 质粒小量制备结果，M：DL5000DNA分子量标准，从上到下分子量依次为：5000bp、3000bp、2000bp、1500bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp，其中750bp加亮；1-4：L.>NC8/Δalr-409ata 单菌1-4号；

图6 L. plantarum NC8/Δalr-pSIP409PgsA’-EGFPAT荧光显微镜观察结果；

图7 L. plantarum NC8/Δalr-pLQ2a-E-M荧光显微镜观察结果，A：L.>NC8/Δalr-pLQ2a-E-M绿色荧光蛋白发光观察；B：L. plantarum>NC8/Δalr-pLQ2a-E-M红色荧光蛋白发光观察；C：L. plantarum>NC8/Δalr-pLQ2a-E-M绿色和红色荧光蛋白发光观察Merged图片；D：阴性对照L. plantarum>NC8/Δalr绿色荧光蛋白发光；E：阴性对照L.>plantarum>NC8/Δalr红色荧光蛋白发光；F：阴性对照L.> NC8/Δalr绿色和红色荧光蛋白发光观察Merged图片；

图8 L. plantarum NC8/Δalr-pLQ2a-E-M反复冻融方法提取菌体膜蛋白用鼠抗EGFP单抗为一抗Western Blot结果，M: 蛋白质分子量标准，从上到下分子量依次为：70kDa、55kDa、40kDa；阴1：阴性对照L.>NC8/Δalr ；阴2 ：阴性对照L.>NC8/Δalr-pSIP409PgsA’a；1-3：L. plantarum>NC8/Δalr-pLQ2a-E-M 1-3号菌；

图9 L. plantarum NC8/Δalr-pLQ2a-E-M反复冻融方法提取菌体膜蛋白用鼠抗HIS单抗为一抗Western Blot结果，M: 蛋白质分子量标准，从上到下分子量依次为：70kDa、55kDa、40kDa；阴1：阴性对照L.>NC8/Δalr ；阴2 ：阴性对照L.>NC8/Δalr-pSIP409PgsA’a；1-3：L.>NC8/Δalr-pLQ2a1-3号；

图10 质粒pLQ2a线性载体片段结果：（A）为用Sal I和XbaI单酶切出8432bp线性载体片段结果，（B）为用HindⅢ单酶切酶出8168bp和264bp的片段结果，M1:：DL10000DNA分子量标准，从上到下分子量依次为：10000bp、7000bp、4000bp、2000bp、1000bp、750bp、500bp，其中2000bp加亮；M2：DL5000DNA分子量标准，从上到下分子量依次为：5000bp、3000bp、2000bp、1500bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp，其中750bp加亮；1、2、5：质粒pLQ2a；3、4：pLQ2a用分别用Sal I和XbaI单酶切出8432bp线性载体片段；6：pLQ2a用HindⅢ单酶切出8168bp和264bp的片段；

图11 无抗性筛选双抗原锚定表达载体pLQ2图谱。

具体实施方式

实施例1 用alr-EM双标记载体409eatf内alr基因与宿主菌L.>NC8/Δalr营养互补筛选验证

（1）pSIP409PgsA’-IL-10双酶切

用SalI和PstI双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收载体上含有红霉素和复制子的4436bp基因片段，片段的碱基序列如SEQ ID NO.6所示。

（2）Alr t与alr tf基因扩增

提取L.> NC8株基因组，以其为模板，设计引物，引物alr基因内含有SalI酶切位点，不便于载体构建，所以设计时将引物延长，这样即能将alr扩增出来，又能将其突变，将酶切位点中第一个C突变为G，扩增的基因命名alr t（1149bp）。为了检测alr 基因回归植物乳杆菌后表达情况，另外设计在alr 基因序列3’端添加了Flag标签引物，便于alr基因表达检测，扩增的基因命名为alr tf（1176bp）。

引物如下：

Alr t F：ATGGTTGTAATTGGGGAGCACCGCCACACACAAGTCACAGTGGACT（alr基因内含有SalI酶切位点，将C突变为G）

Alr t R：GATCATTTGGCGTGCCTGCAGTTAATCTATATAAACTCTCG（下划线标注为载体上的同源序列，斜体标注为PstI酶切位点）

Alr tf R：GATCATTTGGCGTGCCTGCAGTTATTTGTCATCGTCATCTTTGTAGTCATCTAT

ATAAACTCTCG（下划线标注为载体上的同源臂，斜体标注为PstI酶切位点，灰色标记为Flag标签）

a. PCR反应体系如下：

b. PCR反应条件如下：

（3）乳酸乳球菌启动子P23与alr基因融合

1）启动子P23扩增

以合成的含P23启动子基因序列的pUC57-Pori23 FnBPA 为模板，扩增含有同源臂的启动子序列。

P23F：GAATGGAGACCGGGGTCGACgaaaagccctgacaaccctc（下划线为与载体上SalI酶切位点上游同源序列，斜体标注为SalI酶切位点）

P23R：GTGGCGGTGCTCCCCAATTACAACCATAACATCATTGTCATTCAT（下划线部分为与alr>

a. PCR反应体系如下：

b. PCR反应条件如下：

2）启动子P23分别与alr t、alr tf基因做SOE-PCR

使用引物P23F和Alr t R、Alr t f R分别融合出两段基因P23Alr t（1355bp）、P23Alrtf（1382）琼脂糖凝胶回收融合片段。

a. PCR反应体系如下：

b. PCR反应条件如下：

（4）P23Alr t、P23Alr tf基因与pSIP409PgsA’-IL-10（PstI和SalI双酶切）片段载体连接

P23Alr t、P23Alr tf与pSIP409PgsA’-IL-10载体（用PstI和SalI双酶切）使用无缝克隆试剂盒（Seamless Assembly Cloning Kit 购自中美泰和生物技术北京有限公司）连接，CaCl2法转化入大肠杆菌TOPO10感受态细胞，涂布红霉素LB固体培养基，质粒小量制备后酶切鉴定，切出载体片段4436bp和1312bp的P23Alr t（P23Alr tf 大小1336bp）电泳见图1，将酶切阳性质粒测序鉴定，结果比对后测序同源性100%，分别命名为409eat和409eatf。将测序正确质粒409eat和409eatf分别电转化入alr基因缺陷L. plantarum NC8/Δalr感受态细胞，利用红霉素抗性基因和营养互补基因筛选阳性重组子命名为L. plantarum NC8/Δalr-409eat和L. plantarum NC8/Δalr-409eatf。

连接体系如下：

（5）Western Blotting检测alr基因回归宿主菌表达丙氨酸消旋酶

采用Flag标签抗体检测alr基因回归宿主菌表达丙氨酸消旋酶情况。挑取表达Flag标签的L.> NC8/Δalr-409eatf单克隆种于含有 5 µg/mL 红霉素的液体 MRS 培养基中过夜培养，转接液体MRS培养基（以菌液：培养基=1:50）待菌液生长至对数生长期后，离心收集菌体，超声破碎处理样品，Western Blotting一抗使用兔抗Flag标签单克隆抗体室温孵育2h，二抗使用HRP标记羊抗兔 IgG室温孵育1h，TBST洗膜三次后显色，蛋白大小约42.4kD，表明alr基因成功表达，L.> NC8/Δalr转入质粒409eatf能完成营养互补，在不添加D-丙氨酸的MRS培养基中能够生长，达到筛选阳性重组子的目的，结果见图2。

实施例2 营养互补型asd-alr双标记质粒载体409ata构建及在E.coli>L.>>

（1）质粒409eat用BamHI和SalI双酶切，回收含有复制子和alr基因片段4625bp，碱基序列如SEQ ID NO.7所示。

（2）扩增asd基因，以PYA4545质粒为模板，引物如下，扩含有同源弊端的片段1758bp。

Pasd 正F:>CGCTATGCGTGCGGGATCCTCTTCCCTAAATTTAAATATAAAC（下划线为与载体同源序列，斜体标记BamHI）

Pasd R:>GGGTTGTCAGGGCTTTTCGTCGACAACATCAGGTAGTGACA（下划线为与载体同源序列，斜体标记Sal>

a. PCR反应体系如下：

b. PCR反应条件如下：

（3）asd基因与409eat（BamHI和SalI双酶切）连接，连接产物电转化E.coli>L.>>

连接体系如下：

实施例3 无抗筛选锚定共锚定表达EGFP和Mcherry验证

（1）无抗筛选单锚定表达EGFP质粒pSIP409PgsA’-EGFPAT构建及验证

1）以质粒pSIP409PgsA’-EGFP为基础，将载体上EM基因用asd-alr替换。参照409ata基因序列设计含有同源序列的无缝克隆引物，设计的引物具有通用性，引物上游参照载体上“256rep”复制子设计，利用此引物采用无缝克隆连接的方法可以将此系列载体上的红霉素用asd-alr基因替换，构建出无抗性筛选的表达载体，扩增出来的片段命名为256-asd-alr，片段大小3719bp，碱基序列如SEQ ID NO.8所示；在扩增时候添加了同源臂所以扩增出来的片段大小3765bp。

扩增256-asd-alr基因引物如下：

409ataF:GCAGCGAGTCAGTGAGCGAGAAGGATTATTCGGCTGGTTG（下划线为同源序列）

409ata R:CAAATTTAAAAAAGCGACTCATAGAATTAATCTATATAAACTCTCG（下划线为同源序列）

a. PCR反应体系如下：

b. PCR反应条件如下：

2）参照pSIP409PgsA’-EGFP基因序列设计引物，扩增片段5132bp的409P’-EGFP片段

409P’EGFP测F：5' TTCTATGAGTCGCTTTTTT 3'

409P’EGFP测R：5' CTCGCTCACTGACTCGCTG 3'

a. PCR反应体系如下：

b. PCR反应条件如下：

3）256-asd-alr基因与409P’-EGFP无缝克隆连接，电转化E.coli 6212/Δasd感受态细胞，涂布LB固体培养基，37℃过夜培养，挑取单克隆，质粒小量制备后，将阳性质粒命名为pSIP409PgsA’-EGFPa，阳性质粒大小8851bp，采用测序引物测序，引物序列如下：

P’ata alr测F：CGAGAGTTTATATAGATTAA

P’ata PUC 测F：GCAGCGAGTCAGTGAGCGAG

4）pSIP409PgsA’-EGFPa载体HindⅢ酶切位点突变

将HindⅢ酶切位点AAGCTT突变为AAACTT，点突变引物如下：

Hind F:CCAGTCTCTGGCATCAAACTTGCAATGGCAAC

Hind R:TTTGATGCCAGAGACTGGTGGCCGAATTGGAC

以质粒ppSIP409PgsA’-EGFPa为模板PCR扩增产物纯化后，用Dpn I限制性内切酶处理后，电转化E.coli>6212/Δasd感受态细胞，筛选阳性克隆，突变后的载体命名为pSIP409PgsA’-EGFPAT质粒大小8851bp，碱基序列如SEQ ID NO.9所示；测序正确后电转化L. plantarum>NC8/Δalr，获得L. plantarum>NC8/Δalr-pSIP409PgsA’-EGFPAT荧光显微镜观察结见图6。

（2）无抗筛选双锚定表达EGFP和Mcherry验证

1）将pSIP409PgsA’-EGFPAT用HindⅢ单酶切获得8851bp的载体，采用DNA纯化试剂盒纯化。

2）锚定序列LP-1261扩增

参照pLP-1261 Inv序列设计引物，在上游引物中添加SD序列，由于需要添加SD序列和同源序列所以采用两轮PCR，将其添加到LP-1261序列的5’端，扩增LP-1261片段引物如下：

1261MF1：AAGCTTAGGAAACAGACC>ATGAATTTCAAAACAGCT

1261MF2：CGAGCTGTACAAGTAAAAGCTTAGGAAACAGACC

1261M R：CCTCCTCGCCCTTGCTCACCATGTCGACCGCCGCAATCG

a. 第一轮PCR反应体系如下：

b. 第一轮PCR反应条件如下：

以第一轮的PCR产物纯化后作为模板，使用上、下游引物1261MF2和1261M R进行第二轮PCR，反应体系与条件同第一轮，第二轮PCR产物LP-1261（大小301bp）。

3）荧光蛋白Mcherry片段

以pYA4545-Mcherry质粒为模板，扩增Mcherry片段，设计引物时候在片段3’端终止密码子TAA前添加HIS标签序列，引物如下：

Mcherry F：Atggtgagcaagggcgaggagg

Mcherry R1：

AAGCTTTTAATGGTGATGGTGATGATGCTTGTACAGCTCGTCC

Mcherry R2：

GCAACACGTGCTGTAATTTGAAGCTTTTAATGGTGATG（下划线标注为载体同源序列，斜体标注为HindⅢ酶切位点）

a. 第一轮PCR反应体系如下：

b. 第一轮PCR反应条件如下：

以第一轮的PCR产物纯化后为模板，使用上、下游引物Mcherry F和Mcherry R2进行第二轮PCR，反应体系与条件同第一轮，第二轮PCR产物Mcherry（大小755bp）。

4）锚定序列LP-1261、荧光蛋白Mcherry 片段与pSIP409PgsA’-EGFPAT（HindⅢ单酶切）载体无缝克隆连接

连接体系如下：

反应溶液50℃，连接15min，连接产物电转化E.coli 6212/Δasd感受态细胞，涂布普通LB固体培养基，无抗性筛选阳性重组子，重组质粒命名为pLQ2a-E-M，吉林省库美生物科技有限公司测序鉴定。将鉴定阳性质粒pLQ2a-E-M电转化至L.> NC8/Δalr感受态细胞，涂布MRS固体培养基，获得基因工程L.> NC8/Δalr-pLQ2a-E-M。

（5）基因工程L.> NC8/Δalr-pLQ2a-E-M锚定表达EGFP和Mcherry的Western Blot分析及菌体自发荧光检测

挑取L.> NC8/Δalr-pLQ2a-E-M单克隆接种于液体 MRS 培养基中过夜培养，转接液体MRS培养基（以菌液：培养基=1:50，37℃厌氧培养1h后加pSSIP诱导肽，继续培养4h待菌液生长至对数生长期后，离心收集菌体，PBS洗三次后，制备玻片，使用倒置荧光显微镜观察荧光，结果如图7。采用反复冻融方法提取菌体膜蛋白，Western Blot分析，分别用鼠抗EGFP单抗和鼠抗HIS标签单抗一抗孵育，二抗使用HRP标记羊抗鼠 IgG室温孵育1h，TBST洗膜三次后显色，锚定序列PgsA’加上EGFP蛋白大小约47.3kD如图8，锚定序列LP-1261加上Mcherry蛋白大小约35.6kD如图9。

实施例4 无抗筛选双抗原锚定表达载体pLQ2a的构建方法

1、载体pSIP409PgsA’-1261的制备

1）参照质粒pLP-1261 Inv上LP-1261基因序列设计含有同源手臂端的无缝克隆引物，并在LP-1261的上游添加SD序列（AGGAAACAGACC）和HindⅢ酶切位点，下游添加SalI和HindⅢ酶切位点，扩增含有同源手臂端298bp的LP-1261序列，引物序列如下：

1261F:TTCGAA>AAGCTTAGGAAACAGACC>

1261R:CACGTGCTGTAATTTGAAGCTTGTCGACCGCCGCAATCGTGCC；

2）将锚定表达载体pSIP409PgsA’用HindⅢ单酶切，获得线性化载体pSIP409PgsA’（HindⅢ），6202bp；

3）将锚定序列LP-1261与pSIP409PgsA’（HindⅢ）无缝克隆连接，将连接产物化学法转化E.coli TOP10感受态细胞，利用红霉素抗性基因筛选阳性克隆，获得双锚定表达载体命名为pSIP409PgsA’-1261。

2、P23-alr-asd基因制备

参照PYA4545载体asd基因序列，NCBI公布的P23启动子和植物乳杆菌alr基因序列设计添加同源手臂端的融合PCR（SOE-PCR）引物，将引物送苏州金唯智生物科技有限公司合成，将P23启动子（碱基序列如SEQ ID NO.3所示）、alr基因（碱基序列如SEQ ID NO.4所示）和asd基因（碱基序列如SEQ ID NO.5所示）串联，获得P23-alr-asd基因。

引物序列如下

asd F:>CGCTATGCGTGCGGGATCCTCTTCCCTAAATTTAAATATAAAC（下划线标注的是与pLPS载体上的同源手臂）

asd R:GTCTACAACATCAGGTAGTG

23F：GAATGGAGACCGGGGTAGACgaaaagccctgacaaccctc

23R：GTGGCGGTGCTCCCCAATTACAACCATAACATCATTGTCATTCAT

alr F：ATGGTTGTAATTGGGGAGCACCGCCACACACAAGTCACAGTGGACT（alr基因内含有SalI酶切位点，将C突变为G）

alr R：CAAATTTAAAAAAGCGACTCATAGAATTAATCTATATAAACTCTCG（与pLPS载体上的同源手臂）

分别扩增asd基因，P23启动子和alr基因，PCR产物纯化后，以分别asd F和alr R作为上下游引物，将asd基因，P23启动子和alr基因串联，基因大小3027bp 。

3、用P23-alr-asd基因替换载体pSIP409PgsA’-1261上红霉素（EM）基因获得无抗性筛选双抗原锚定表达载体pLQa

用P23-alr-asd基因替换载体pSIP409PgsA’-1261上红霉素基因，由于载体上没有合适的酶切位点线性化载体，所以采用PCR方法线性化载体，参照基因序列pSIP409PgsA’-1261设计引物，扩增去除红霉素基因5405bp的409PgsA’-1261片段，引物如下：

LPS F:TTCTATGAGTCGCTTTTTTAAATTTG

LPS R:GGATCCCGCACGCATAGCGGTGC

将扩增的409PgsA’-1261纯化后与P23-alr-asd无缝克隆连接，电转化E.coli>6212/Δasd感受态细胞，铺普通LB固体培养基，利用asd基因与宿主菌实现营养互补筛选阳性克隆，测序鉴定正确的双抗原锚定表达质粒命名为pLQa。

4、pLQa载体HindⅢ和Sal I酶切位点突变

在载体构建过程中致使载体引入三个HindⅢ酶切位点，影响载体使用，将alr基因内的HindⅢ酶切位点AAGCTT突变为AAACTT，点突变引物如下：

Hind F:CCAGTCTCTGGCATCAAACTTGCAATGGCAAC

Hind R:TTTGATGCCAGAGACTGGTGGCCGAATTGGAC

同时载体上还含有两处Sal I酶切位点，将alr基因下游的Sal I酶切位点GTCGAC突变GTAGAC，引物如下：

1261ATT F: cactacctgatgtt GTAGACgaaaagccctgac

1261ATT R:TACAACATCAGGTAGTGACACTTCTTTGACCTG

以质粒pLQa为模板PCR扩增产物纯化后，用Dpn I限制性内切酶处理后，电转化E.coli>6212/Δasd感受态细胞，经过两次突变后的筛选阳性载体命名为pLQ2a，载体总计8432bp，突变后载体用分别用Sal I和XbaI单酶切出8432bp线性载体片段结果如图10（A），用HindⅢ单酶切酶出8168bp和264bp的片段结果如图10（B），构建的pLQ2a载体，在PgsA’锚定序列下游可以通过XbaI、XhoI、EcoR I、KpnI酶切位点插入目的基因，可以在LP-1261锚定序列后通过Sal I酶切引入目的基因，质粒图谱见图11。

本发明的L.> NC8/Δalr、pSIP409PgsA’-IL-10、pSIP409PgsA’-EGFP、pYA4545-Mcherry在吉林农业大学吉林省动物微生态制剂工程研究中心构建保存；pYA4545、E.coli>6212/Δasd由Roy Curtiss III博士惠赠（美国弗罗里达大学），pLP-1261Inv由Lasse Fredriksen博士馈赠（Department of Chemistry, Biotechnology and FoodScience, Norwegian University of Life Sciences, Aas, Norway）。

序列表

<110> 吉林农业大学

<120> 无抗性筛选双抗原锚定表达载体pLQ2a及制备方法

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 8432

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 1

ttctatgagt cgctttttta aatttggaaa gttacacgtt actaaaggga atggagaccg 60

gggtagaccc ttcaatagag ttcttaacgt taatccgaaa aaaactaacg ttaatattaa 120

aaaataagat ccgcttgtga attatgtata atttgattag actaaagaat aggagaaagt 180

atgatgatat ttaaaaaact ttctcgttaa gataggttgt tggtgagcat gttatatacg 240

gatgtatcgg tttccttaat gcaaaatttt gttgctatct tattaatttt tctattatat 300

agatatattc aaagaaagat aacatttaaa cggatcatat tagatatttt aatagcgatt 360

attttttcaa tattatatct gtttatttca gatgcgtcat tacttgtaat ggtattaatg 420

cgattagggt ggcattttca tcaacaaaaa gaaaataaga taaaaacgac tgatacagct 480

aatttaattc taattatcgt gatccagtta ttgttagttg cggttgggac tattattagt 540

cagtttacca tatcgattat caaaagtgat ttcagccaaa atatattgaa caatagtgca 600

acagatataa ctttattagg tattttcttt gctgttttat ttgacggctt gttctttata 660

ttattgaaga ataagcggac tgaattacaa catttaaatc aagaaatcat tgaattttcg 720

ttagaaaaac aatattttat atttatattt attttattta tagtaataga aattatttta 780

gcagttggga atcttcaagg agtaacagcc acgatattat taaccattat cattattttt 840

tgtgtcctta tcgggatgac tttttggcaa gtgatgcttt ttttgaaggc ttattcgatt 900

cgccaagaag ccaatgacca attggtccgg aatcaacaac ttcaagatta tctagtcaat 960

atcgaacagc agtacaccga attacggcga tttaagcatg attatcaaaa catcttatta 1020

tcgttggaga gttttgccga aaagggcgat cagcaacagt ttaaggcgta ttaccaagaa 1080

ttattagcac aacggccaat tcaaagtgaa atccaagggg cagtcattgc acaactcgac 1140

tacttgaaaa atgatcctat tcgaggatta gtcattcaaa agtttttggc agccaaacag 1200

gctggtgtta ctttaaaatt cgaaatgacc gaaccaatcg aattagcaac cgctaatcta 1260

ttaacggtta ttcggattat cggtatttta ttagacaatg cgattgaaca agccgttcaa 1320

gaaaccgatc aattggtgag ttgtgctttc ttacaatctg atggtttaat cgaaattacg 1380

attgaaaata cggccagtca agttaagaat ctccaagcat tttcagagtt aggctattca 1440

acgaaaggcg ctggtcgggg gactggttta gctaatgtgc aggatttgat tgccaaacaa 1500

accaatttat tcttagaaac acagattgaa aatagaaagt tacgacagac attgatgatt 1560

acggaggaaa cttaatttgt atcccgttta tttattagag gatgatttac agcaacaagc 1620

gatttatcag caaattatcg cgaatacgat tatgattaac gaatttgcaa tgactttaac 1680

atgcgctgcc agtgatactg agacattgtt ggcggcaatt aaggatcagc aacgaggttt 1740

attctttttg gatatggaaa ttgaggataa ccgccaagcc ggtttagaag tggcaactaa 1800

gattcggcag atgatgccgt ttgcgcaaat tgtcttcatt acaacccacg aggaactgac 1860

attattaacg ttagaacgaa aaatagcgcc tttagattac attctcaagg accaaacaat 1920

ggctgaaatc aaaaggcaat tgattgatga tctattgtta gctgagaagc aaaacgaggc 1980

ggcagcgtat caccgagaaa atttatttag ttataaaata ggtcctcgct ttttctcatt 2040

accattaaag gaagttgttt atttatatac tgaaaaagaa aatccgggtc atattaattt 2100

gttagccgtt accagaaagg ttacttttcc aggaaattta aatgcgctgg aagcccaata 2160

tccaatgctc tttcggtgtg ataaaagtta cttagttaac ctatctaata ttgccaatta 2220

tgacagtaaa acacggagtt taaaatttgt agatggcagt gaggcaaaag tctcgttccg 2280

gaaatcacgg gaactagtgg ccaaattaaa acaaatgatg tagcgcctgc aggcacgcca 2340

aatgatccca gtaaaaagcc acccgcatgg cgggtggctt tttattagcc ctagaagggc 2400

ttcccacacg catttcagcg ccttagtgcc ttagtttgtg aatcataggt ggtatagtcc 2460

cgaaataccc gtctaaggaa ttgtcagata ggcctaatga ctggctttta taatatgaga 2520

taatgccgac tgtacttttt acagtcggtt ttctaatgtc actaacctgc cccgttagtt 2580

gaagaaggtt tttatattac agctccagat ctaccggttt aatttgaaaa ttgatattag 2640

cgtttaacag ttaaattaat acgttaataa tttttttgtc tttaaatagg gatttgaagc 2700

ataatggtgt tatagcgtac ttagctggcc agcatatatg tattctataa aatactatta 2760

caaggagatt ttagccatgg gcaagaaaga attaagtttc cacgagaagt tattaaaatt 2820

gactaaacaa caaaaaaaga agactaacaa gcatgtgttt attgctattc caattgtttt 2880

cgttttaatg tttgctttta tgtgggcagg taaagctgag actccaaaag ttaagactta 2940

tagtgatgac gttttgagtg cttcatttgt cggcgacatt atgatgggtc gttacgttga 3000

gaaagtcacg gaacaaaagg gtgcagatag tattttccaa tatgttgaac cgattttccg 3060

tgctagtgat tatgttgctg gcaattttga aaatcctgtt acttatcaga aaaactacaa 3120

acaagctgat aaagagattc atttacagac taataaggaa agtgttaaag ttttaaagga 3180

tatgaatttt actgtcttaa atagtgctaa taatcatgct atggattatg gtgttcaagg 3240

tatgaaagat acgttaggtg agtttgctaa acagaattta gatattgttg gtgctggtta 3300

ttcattaagt gacgctaaga agaaaattag ttaccagaaa gtgtctagac tcgaggaatt 3360

cggtaccccg ggttcgaagg cgccaagctt aggaaacaga ccatgaattt caaaacagct 3420

gcaaaagtaa ccgtcgttgc cggcgcatcc gtactattct tagctgcttg tggctcaagc 3480

aagagttctt caagttctaa gcaaacggcc aattggaccg aatcagccga attaccaacg 3540

atggacattt ctaagtccac cgatgtggtt agttctaacg cgttgaataa caccaatgaa 3600

gggttatacc gtctcggtaa gaacgggggc acgattgcgg cggtcgacaa gcttcaaatt 3660

acagcacgtg ttgctttgat tgatagccaa aaagcagcag ttgataaagc aattactgat 3720

attgctgaaa aattgtaatt tataaataaa aatcaccttt tagaggtggt ttttttattt 3780

ataaattatt cgtttgattt cgctttcgat agaacaatca aagcgagaat aaggaagata 3840

aatcccataa gggcgggagc agaatgtccg agactaattc atgaccaaaa tcccttaacg 3900

tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga 3960

tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt 4020

ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag 4080

agcgcagata ccaaatactg tccttctagt gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa 4140

ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag 4200

tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca 4260

gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac 4320

cgaactgaga tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa 4380

ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga ggcgcacgag ggagcttcca 4440

gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt 4500

cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg agcctatcga aaaacgccag caacgcggcc 4560

tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct tttgctcaca tgttctttcc tgcgttatcc 4620

cctgattctg tggataaccg tattaccgcc tttgagtgag ctgataccgc tcgccgcagc 4680

cgaacgaccg agcgcagcga gtcagtgagc gagaaggatt attcggctgg ttgagacgtt 4740

aaaatgataa aggttgtatt aatcttatat tacggttata atgtactcaa cttaataaat 4800

gaacgcaaaa aaaagaaccc tcaacttagc agagttagga ttcacgactt atcagcacaa 4860

cctgataaga ttttcgatag caagtactac caatacaagc tatctaactt ggtactatta 4920

taacatgtag gctaagtttt tcaaccattg atacttaaag taaacggttg ttatcgggaa 4980

tcttaacaga aacctgatag caaccgtttt tttgttattc aatggttagc aaccatcaaa 5040

gcaactaaag gctggaaacc tgttcttagc tagtaaaacc tcccgtgagt gtcgttcgtg 5100

accccgcttg cagttaacaa cataggtatg ctaaaccttg tcgagatcaa cgcgactaaa 5160

gacgtggctg gaagactagg aaatgatacg gacaggctaa ctattaacgc agattattcg 5220

ggttgctgct aaaaccaact ctaataatag ttagtgcaag ggctggttga gcttaaattg 5280

tctgataaag agttctctct ttatactgca aaagaagcgc agttattcac gattaggata 5340

actgtttgag agagcctaag ggcttgaccc ttgatggttt aagcaccgct atgcgtgcgg 5400

gatcctcttc cctaaattta aatataaaca acgaattatc tccttaacgt acgttttcgt 5460

tccattggcc ctcaaacccc taattaggat caataaaaca gcgacggaaa tgattccctt 5520

cctaacgcaa attccctgat aatcgccact ggactttctg cttgcgcggt aaggcaggat 5580

aagtcgcatt actgatggct tcgctatcat tgattaattt cacttgcgac tttggctgct 5640

ttttgtatgg tgaaggatgc gccacaggat actggcgcgc atacacagca catctctttg 5700

caggaaaaaa acgctatgaa aaatgttggt tttatcggct ggcgcggaat ggtcggctct 5760

gttctcatgc aacgcatggt agaggagcgc gatttcgacg ctattcgccc tgttttcttt 5820

tctacctccc agtttggaca ggcggcgccc accttcggcg acacctccgg cacgctacag 5880

gacgcttttg acctggatgc gctaaaagcg ctcgatatca tcgtgacctg ccagggcggc 5940

gattatacca acgaaattta tccaaagctg cgcgaaagcg gatggcaggg ttactggatt 6000

gatgcggctt ctacgctgcg catgaaagat gatgccatta ttattctcga cccggtcaac 6060

caggacgtga ttaccgacgg cctgaacaat ggcgtgaaga cctttgtggg cggtaactgt 6120

accgttagcc tgatgttgat gtcgctgggc ggtctctttg cccataatct cgttgactgg 6180

gtatccgtcg cgacctatca ggccgcctcc ggcggcggcg cgcgccatat gcgcgagctg 6240

ttaacccaga tgggtcagtt gtatggccat gtcgccgatg aactggcgac gccgtcttcc 6300

gcaattcttg atattgaacg caaagttacg gcattgaccc gcagcggcga gctgccggtt 6360

gataactttg gcgtaccgct ggcgggaagc ctgatcccct ggatcgacaa acagctcgat 6420

aacggccaga gccgcgaaga gtggaaaggc caggcggaaa ccaacaagat tctcaatact 6480

gcctctgtga ttccggttga tggtttgtgt gtgcgcgtcg gcgcgctgcg ctgtcacagc 6540

caggcgttca ccatcaagct gaaaaaagag gtatccattc cgacggtgga agaactgctg 6600

gcggcacata atccgtgggc gaaagtggtg ccgaacgatc gtgatatcac tatgcgcgaa 6660

ttaaccccgg cggcggtgac cggcacgttg actacgccgg ttggtcgtct gcgtaagctg 6720

aacatggggc cagagttctt gtcggcgttt accgtaggcg accagttgtt atggggcgcc 6780

gccgagccgc tgcgtcgaat gctgcgccag ttggcgtagt ggctattgca gcgcttatcg 6840

ggcctgcgtg tggttctgta ggccggataa ggcgcgtcag cgccgccatc cggcggggaa 6900

atttgtgtta aaccaggggt gcatcgtcac cctttttttg cgtaatacag gagtaaacgc 6960

agatgtttca tttttatcag gagttaagca gagcattggc tattctttaa gggtagctta 7020

atcccacggg tattaagcct aacctgaagg taggacgacg cagataggat gcacagtgtg 7080

ctgcgccgtt caggtcaaag aagtgtcact acctgatgtt gtagacgaaa agccctgaca 7140

accctcgttc ctaaaaagga ataagcgttt ggtcagtaaa taatagaaat aaaaaatcag 7200

acctaagact gatgacaaaa agagcaaatt ttgataaaat agtattagaa ttaaattaaa 7260

aagggaggcc aaatataatg aaaaatatga atgacaatga tgttatggtt gtaattgggg 7320

agcaccgcca cacacaagtc acagtggact tgcaggcaat taagacaaat attagtaatg 7380

aaatggcgca aaaggatgag ttgaccgagt tatgggcagt cgttaaagcg aatggttatg 7440

gacatggaat tatccaagtt gctcaggccg ccaaagaagc cggggcgacc ggcttttgtg 7500

ttgcaatcct ggatgaggcc ttagcgttgc gggccgctgg ctttgcggaa cccatcctag 7560

tacttggaat tacggaaccg gaatacgccc cactggtagc tgaaaaggat atttcactag 7620

ctgttggaac gcaagattgg ctgactacgg ccgcagcaat tttagcggct aatcaagtga 7680

cgacaccact tcacgttcat cttgcattag atacgggtat gggacgaatc gggtttcaga 7740

cgcccgaaga attggcaacg gcggttacga ctttgcgtca accgcagtca ccatttgact 7800

ttgaagggat ttttacgcat tttgcaacgg ctgaccaggc agatgatacg tattttactc 7860

atcaattaaa taattggaaa cacttgattg cagtggtgga tgagctacca cgctatgtcc 7920

acgtgtccaa ttcggccacc agtctctggc atcaaacttg caatggcaac atggtgcgct 7980

ttggggttgc actctatggt ctaaatcctt ctggtcgcga actcagcgca ccatacccct 8040

tgcaacccgc gttgtcgcta acggcacgct tgacgtttgt taaacgcttg gctcggggca 8100

aatcggtcag ctatggtgcc acgtatacgg ccgcacagga tgaatggatt ggcacggtgc 8160

cgattgggta tgcggacggc tatgaacgcc gattacaagg cttccatgta cttgttgatg 8220

gtgagttttg cgaaatcgtc ggacgggtct gcatggacca gctgatggtt cgtctgccac 8280

atgaagtacc ggttggagct aaggtaactt tggttggcac ggacggtgct cgtaccattt 8340

cgttgcaaga tattgctgac tattgtggga caattcatta tgagattgct tgtgggttag 8400

caccacgagt gccgagagtt tatatagatt aa 8432

<210> 2

<211> 3027

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 2

tcttccctaa atttaaatat aaacaacgaa ttatctcctt aacgtacgtt ttcgttccat 60

tggccctcaa acccctaatt aggatcaata aaacagcgac ggaaatgatt cccttcctaa 120

cgcaaattcc ctgataatcg ccactggact ttctgcttgc gcggtaaggc aggataagtc 180

gcattactga tggcttcgct atcattgatt aatttcactt gcgactttgg ctgctttttg 240

tatggtgaag gatgcgccac aggatactgg cgcgcataca cagcacatct ctttgcagga 300

aaaaaacgct atgaaaaatg ttggttttat cggctggcgc ggaatggtcg gctctgttct 360

catgcaacgc atggtagagg agcgcgattt cgacgctatt cgccctgttt tcttttctac 420

ctcccagttt ggacaggcgg cgcccacctt cggcgacacc tccggcacgc tacaggacgc 480

ttttgacctg gatgcgctaa aagcgctcga tatcatcgtg acctgccagg gcggcgatta 540

taccaacgaa atttatccaa agctgcgcga aagcggatgg cagggttact ggattgatgc 600

ggcttctacg ctgcgcatga aagatgatgc cattattatt ctcgacccgg tcaaccagga 660

cgtgattacc gacggcctga acaatggcgt gaagaccttt gtgggcggta actgtaccgt 720

tagcctgatg ttgatgtcgc tgggcggtct ctttgcccat aatctcgttg actgggtatc 780

cgtcgcgacc tatcaggccg cctccggcgg cggcgcgcgc catatgcgcg agctgttaac 840

ccagatgggt cagttgtatg gccatgtcgc cgatgaactg gcgacgccgt cttccgcaat 900

tcttgatatt gaacgcaaag ttacggcatt gacccgcagc ggcgagctgc cggttgataa 960

ctttggcgta ccgctggcgg gaagcctgat cccctggatc gacaaacagc tcgataacgg 1020

ccagagccgc gaagagtgga aaggccaggc ggaaaccaac aagattctca atactgcctc 1080

tgtgattccg gttgatggtt tgtgtgtgcg cgtcggcgcg ctgcgctgtc acagccaggc 1140

gttcaccatc aagctgaaaa aagaggtatc cattccgacg gtggaagaac tgctggcggc 1200

acataatccg tgggcgaaag tggtgccgaa cgatcgtgat atcactatgc gcgaattaac 1260

cccggcggcg gtgaccggca cgttgactac gccggttggt cgtctgcgta agctgaacat 1320

ggggccagag ttcttgtcgg cgtttaccgt aggcgaccag ttgttatggg gcgccgccga 1380

gccgctgcgt cgaatgctgc gccagttggc gtagtggcta ttgcagcgct tatcgggcct 1440

gcgtgtggtt ctgtaggccg gataaggcgc gtcagcgccg ccatccggcg gggaaatttg 1500

tgttaaacca ggggtgcatc gtcacccttt ttttgcgtaa tacaggagta aacgcagatg 1560

tttcattttt atcaggagtt aagcagagca ttggctattc tttaagggta gcttaatccc 1620

acgggtatta agcctaacct gaaggtagga cgacgcagat aggatgcaca gtgtgctgcg 1680

ccgttcaggt caaagaagtg tcactacctg atgttgtaga cgaaaagccc tgacaaccct 1740

cgttcctaaa aaggaataag cgtttggtca gtaaataata gaaataaaaa atcagaccta 1800

agactgatga caaaaagagc aaattttgat aaaatagtat tagaattaaa ttaaaaaggg 1860

aggccaaata taatgaaaaa tatgaatgac aatgatgtta tggttgtaat tggggagcac 1920

cgccacacac aagtcacagt ggacttgcag gcaattaaga caaatattag taatgaaatg 1980

gcgcaaaagg atgagttgac cgagttatgg gcagtcgtta aagcgaatgg ttatggacat 2040

ggaattatcc aagttgctca ggccgccaaa gaagccgggg cgaccggctt ttgtgttgca 2100

atcctggatg aggccttagc gttgcgggcc gctggctttg cggaacccat cctagtactt 2160

ggaattacgg aaccggaata cgccccactg gtagctgaaa aggatatttc actagctgtt 2220

ggaacgcaag attggctgac tacggccgca gcaattttag cggctaatca agtgacgaca 2280

ccacttcacg ttcatcttgc attagatacg ggtatgggac gaatcgggtt tcagacgccc 2340

gaagaattgg caacggcggt tacgactttg cgtcaaccgc agtcaccatt tgactttgaa 2400

gggattttta cgcattttgc aacggctgac caggcagatg atacgtattt tactcatcaa 2460

ttaaataatt ggaaacactt gattgcagtg gtggatgagc taccacgcta tgtccacgtg 2520

tccaattcgg ccaccagtct ctggcatcaa acttgcaatg gcaacatggt gcgctttggg 2580

gttgcactct atggtctaaa tccttctggt cgcgaactca gcgcaccata ccccttgcaa 2640

cccgcgttgt cgctaacggc acgcttgacg tttgttaaac gcttggctcg gggcaaatcg 2700

gtcagctatg gtgccacgta tacggccgca caggatgaat ggattggcac ggtgccgatt 2760

gggtatgcgg acggctatga acgccgatta caaggcttcc atgtacttgt tgatggtgag 2820

ttttgcgaaa tcgtcggacg ggtctgcatg gaccagctga tggttcgtct gccacatgaa 2880

gtaccggttg gagctaaggt aactttggtt ggcacggacg gtgctcgtac catttcgttg 2940

caagatattg ctgactattg tgggacaatt cattatgaga ttgcttgtgg gttagcacca 3000

cgagtgccga gagtttatat agattaa 3027

<210> 3

<211> 184

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 3

gtcgacgaaa agccctgaca accctcgttc ctaaaaagga ataagcgttt ggtcagtaaa 60

taatagaaat aaaaaatcag acctaagact gatgacaaaa agagcaaatt ttgataaaat 120

agtattagaa ttaaattaaa aagggaggcc aaatataatg aaaaatatga atgacaatga 180

tgtt 184

<210> 4

<211> 1128

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 4

atggttgtaa ttggggagca ccgccacaca caagtcacag tggacttgca ggcaattaag 60

acaaatatta gtaatgaaat ggcgcaaaag gatgagttga ccgagttatg ggcagtcgtt 120

aaagcgaatg gttatggaca tggaattatc caagttgctc aggccgccaa agaagccggg 180

gcgaccggct tttgtgttgc aatcctggat gaggccttag cgttgcgggc cgctggcttt 240

gcggaaccca tcctagtact tggaattacg gaaccggaat acgccccact ggtagctgaa 300

aaggatattt cactagctgt tggaacgcaa gattggctga ctacggccgc agcaatttta 360

gcggctaatc aagtgacgac accacttcac gttcatcttg cattagatac gggtatggga 420

cgaatcgggt ttcagacgcc cgaagaattg gcaacggcgg ttacgacttt gcgtcaaccg 480

cagtcaccat ttgactttga agggattttt acgcattttg caacggctga ccaggcagat 540

gatacgtatt ttactcatca attaaataat tggaaacact tgattgcagt ggtggatgag 600

ctaccacgct atgtccacgt gtccaattcg gccaccagtc tctggcatca aacttgcaat 660

ggcaacatgg tgcgctttgg ggttgcactc tatggtctaa atccttctgg tcgcgaactc 720

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cgcttggctc ggggcaaatc ggtcagctat ggtgccacgt atacggccgc acaggatgaa 840

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catgtacttg ttgatggtga gttttgcgaa atcgtcggac gggtctgcat ggaccagctg 960

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<210> 5

<211> 1715

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 5

tcttccctaa atttaaatat aaacaacgaa ttatctcctt aacgtacgtt ttcgttccat 60

tggccctcaa acccctaatt aggatcaata aaacagcgac ggaaatgatt cccttcctaa 120

cgcaaattcc ctgataatcg ccactggact ttctgcttgc gcggtaaggc aggataagtc 180

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tatggtgaag gatgcgccac aggatactgg cgcgcataca cagcacatct ctttgcagga 300

aaaaaacgct atgaaaaatg ttggttttat cggctggcgc ggaatggtcg gctctgttct 360

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taccaacgaa atttatccaa agctgcgcga aagcggatgg cagggttact ggattgatgc 600

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ccagatgggt cagttgtatg gccatgtcgc cgatgaactg gcgacgccgt cttccgcaat 900

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ctttggcgta ccgctggcgg gaagcctgat cccctggatc gacaaacagc tcgataacgg 1020

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<210> 6

<211> 4442

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 6

ctgcaggcac gccaaatgat cccagtaaaa agccacccgc atggcgggtg gctttttatt 60

agccctagaa gggcttccca cacgcatttc agcgccttag tgccttagtt tgtgaatcat 120

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tttataatat gagataatgc cgactgtact ttttacagtc ggttttctaa tgtcactaac 240

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tagggatttg aagcataatg gtgttatagc gtacttagct ggccagcata tatgtattct 420

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attccaattg ttttcgtttt aatgtttgct tttatgtggg caggtaaagc tgagactcca 600

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ttactgatat tgctgaaaaa ttgtaattta taaataaaaa tcacctttta gaggtggttt 1680

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ac 4442

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taatagaaat aaaaaatcag acctaagact gatgacaaaa agagcaaatt ttgataaaat 120

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acgccaaatg atcccagtaa aaagccaccc gcatggcggg tggcttttta ttagccctag 1380

aagggcttcc cacacgcatt tcagcgcctt agtgccttag tttgtgaatc ataggtggta 1440

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ttcattatga gattgcttgt gggttagcac cacgagtgcc gagagtttat atagattaa 3719

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