一种中药五谷虫脂肪酸提取工艺

摘要

本发明公开了一种中药五谷虫脂肪酸提取工艺，采用乙酸乙酯索氏提取法以料液比为1：5、提取时间为2h、提取次数为1次时提取效果最佳，五谷虫提取物的提取率得到提高，并最大限度保留活性成分，之后，对其进行脱胶、脱酸精炼，目的是除去五谷虫脂肪酸粗提取物中的少量的蛋白质、磷脂和黏液性等胶状物质，重金属，以及除去其中的游离脂肪酸，并经过冷冻结晶最终得到浓缩后的五谷虫脂肪酸，经分析，运用该工艺得到的中药五谷虫脂肪酸提取物中全部为不饱和脂肪酸，并经实验证实，该中药五谷虫脂肪酸提取物对金黄色葡萄球菌、肺炎双链球菌以及铜绿假单胞菌都具有抗菌性，可以和药学上可接受的载体制备成各种剂型药物，方便临床服用。

说明书

技术领域

本发明涉及动物油脂提取技术领域，更具体地，涉及一种中药五谷虫脂肪酸提取工艺。

背景技术

近些年抗生素的滥用导致细菌耐药性显著增强，由耐药菌引起的严重感染性创面病例逐年增多，给临床治疗带来了严重挑战。开发一种既可以抗菌又不易产生耐药的有效外用药物，成为当今医药领域迫切需要解决的问题。中药具有毒副作用小、作用靶点多、作用效果持久等优点，是治疗细菌感染的有效途径之一。

五谷虫，俗称蛆，为丽蝇科昆虫的幼虫。因其无耐药性、持久有效安全的抗菌作用和明显的促进愈合作用日益引起国际医学界的关注，是通过美国FDA和欧洲CE认证的唯一可以在临床使用的医疗用昆虫。传统中医将五谷虫制备成中药来治疗感染性外科疾病，据《本草求源》、《本草便读》中记载，该虫性寒，经干燥研末后，外敷，能治疗臁烂、唇疔，说明五谷虫体内含有某些抗菌活性成分。因此，发明一种中药五谷虫提取工艺来解决中药五谷虫在临床上的应用问题非常必要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种中药五谷虫脂肪酸提取工艺。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

一种中药五谷虫脂肪酸提取工艺，其特征在于，包括以下步骤：

步骤S1：将干燥后的中药五谷虫干粉用滤纸包好投入索氏提取器中，加入二氯甲烷或石油醚或乙酸乙酯溶剂，升温至溶剂沸点，回流提取2h～4h，回流次数为1～3次，其中，干燥后的中药五谷虫干粉与溶剂的质量比为1:5～20；

步骤S2：将步骤S1所得的提取液置于旋转蒸发仪中减压蒸馏，回收溶剂，并于通风橱中挥发掉剩余溶剂，得到中药五谷虫脂肪酸粗提取物；

步骤S3：采用酸炼法脱胶，将步骤S2所得的中药五谷虫脂肪酸粗提取物放入容器中，在水浴中搅拌加热至70℃～80℃，边搅拌边加入质量为中药五谷虫脂肪酸粗提取物质量的1％的、浓度为75％～80％的磷酸，持续1min～15min，然后离心分离得液体，取上层油样，为脱胶五谷虫脂肪酸；

步骤S4：向步骤S3所得的脱胶五谷虫脂肪酸中加入质量为脱胶五谷虫脂肪酸质量的1％～1.5％的、浓度为300g/L的氢氧化钠溶液，均匀搅拌后，加热至65℃～70℃，保温30min，然后冷却至室温，静置分层，离心分离得液体；用去离子水清洗液体中残留的皂脚，反复清洗3次，之后，离心分离得液体，取液体上层油样，为精炼后的五谷虫脂肪酸。

进一步地，还包括采用冷冻结晶法对精炼后的五谷虫脂肪酸进行浓缩的步骤。

进一步地，所述步骤S1中，以乙酸乙酯为溶剂，升温至70℃，回流提取2h，回流次数为1次，干燥后的中药五谷虫干粉与乙酸乙酯的质量比为1:5。

权利要求1～3所述的任意一种中药五谷虫脂肪酸提取工艺制备的中药五谷虫脂肪酸应用于抗菌药物中。

从上述技术方案可以看出，本发明通过优化提取剂、反应条件，可以制备抗菌能力强的五谷虫提取物，通过进一步增加精炼和浓缩步骤，得到浓度和纯度更高的五谷虫提取物，用于抗菌药品中，可以代替抗生素的使用，是一种新型的、无副作用的抗菌产品。

附图说明

图1是不同料液比条件下的脂肪酸提取量结果对比图；

图2～图4是分别以二氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯为提取试剂，在料液比1:5提取时的脂肪酸提取质量随提取时间的结果示意图；

图5～图7是分别以二氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯为提取试剂，在料液比1:5提取时的脂肪酸提取质量随提取次数的结果示意图；

图8是采用优化条件提取的脂肪酸粗提取物的气质谱图；

图9是三种方法提取的脂肪酸溶液的OD600值的结果对比图；

图10是1mg/ml脂肪酸对金葡菌的抗菌曲线；

图11是2mg/ml脂肪酸对大肠杆菌的抗菌曲线；

图12是1mg/ml脂肪酸对肺炎双链球菌抗菌曲线；

图13是2mg/ml脂肪酸对铜绿假单胞菌的抗菌曲线。

具体实施方式

下面结合附图，对本发明的具体实施方式作进一步的详细说明。

本发明公开了一种中药五谷虫脂肪酸提取工艺，包括以下步骤：

步骤S1：将干燥后的中药五谷虫干粉用滤纸包好投入索氏提取器中，加入二氯甲烷或石油醚或乙酸乙酯溶剂，升温至溶剂沸点，回流提取2h～4h，回流次数为1～3次，其中，干燥后的中药五谷虫干粉与溶剂的质量比为1:5～20。

步骤S2：将步骤S1所得的提取液置于旋转蒸发仪中减压蒸馏，回收溶剂，并于通风橱中挥发掉剩余溶剂，得到中药五谷虫脂肪酸粗提取物。

本发明还进一步优化反应条件，以提高中药五谷虫提取物的质量，分别对物料比例、提取时间、提取温度等进行了优化。

一、五谷虫干粉与提取试剂的料液比优化

称取10g已经研磨好的五谷虫干粉，滤纸包好置于脂肪测定仪中，分别按1:2、1:5、1:10、1:15、1:20的料液比加入各有机提取试剂，以各试剂的沸点加热索氏提取器回流提取4h后，取出五谷虫干粉，待提取试剂完全挥发后，称取干粉重量，按以下公式计算不同料液比的脂肪酸提取质量：

脂肪酸质量(g)＝M-m(M：为五谷虫干粉提取前的干重；m：为五谷虫干粉提取后有机试剂完全挥发后的干重)。

分别按1:2、1:5、1:10、1:15、1:20的料液比加入各有机提取试剂，当料液比为1:2时，无法有效提取五谷虫脂肪酸，推测原因可能为五谷虫干粉吸收溶剂导致溶液量太少，脂肪酸提取效率极低。当料液比为1:5、1:10、1:15和1:20时，脂肪酸的提取效量没有明显差别(如图1所示)，因此，为了节约试剂用量，选取料液比为1:5进行后续实验。

二、提取时间优化

称取10g已经研磨好的五谷虫干粉，滤纸包好置于脂肪测定仪中，按料液比为1:5加入试剂，分别以1h、2h、3h、4h的提取时间索氏回流提取后，按以上方法计算各脂肪酸提取质量，结果如图2-4所示。

以料液比1:5提取，在不同时间的提取结果如图，在提取3h后，三种试剂的提取质量相差不大，但是以乙酸乙酯最多；并且在提取2h时，乙酸乙酯的提取质量和提取4h时的质量相差不大，权衡后我们认为应该采取乙酸乙酯2h的提取方法更为合理。

三、提取次数优化

称取10g已经研磨好的五谷虫干粉，滤纸包好置于脂肪测定仪中，按料液比1:5加入试剂，并按提取时间2h分别按提取1次、2次、3次的提取次数索氏回流提取后，按上述方法计算各脂肪酸提取质量。

以上述条件提取脂肪酸，在不同提取次数的结果如图5-图7，提取1次后乙酸乙酯的脂肪酸提取质量最多，且和其他试剂提取质量具有差异性；在提取3次后，乙酸乙酯的脂肪酸提取质量仍最多，但是三种试剂提取质量相差不大并且乙酸乙酯在提取1次和提取3次的脂肪酸质量相差不大，综合考虑以乙酸乙酯料液比1:5，提取1次，提取2h为五谷虫脂肪酸提取方法，其提取率为21.43％，比相同情况下二氯甲烷的提取率18.67％和石油醚的提取率18.80％都大，且具有统计学意义。[提取率公式：提取率(％)＝(M-m)/M率(义。提(M：为五谷虫干粉提取前的重量；m：为五谷虫干粉提取后有机试剂完全挥发后的重量)]。

下面对采用上述优化条件提取的脂肪酸粗提取物的成分进行分析。

分析前样品准备：取0.1g脂肪酸放入25ml管内，分别加入4ml苯-石油醚(v:v＝1:1)、4ml 0.4M NaOH-MEOH，剧烈斡旋后，放入50℃水浴加热30min，再加入10ml的三蒸水，取上清液氮气吹干，加入100ul甲醇复溶，即可作为气相色谱-质谱联用仪上样分析样本。

GC-MS条件：色谱条件为进样口温度250℃，分流进样，分流比为10:1，进样量为1ul；分析柱为Rxi-5Sil MS 30m x 0.25mm x 0.25um，柱温升温程序为初始柱温60℃，保持1min，以5℃/min升至170℃，保持5min，以5℃/min升至230℃，保持5min。质谱条件为EI源离子源，离子源温度230℃；接口温度250℃；电子能量为70eV；采集方式为扫描质量范围m/z45-600；用NIST标准质谱库检索定性。

脂肪酸粗提取物气质谱图如图8所示，其中，图中数字标记的峰号所对应的成分及其含量见表1。由表1可知：脂肪酸粗提取物中除了不饱和脂肪酸外还含有饱和脂肪酸等杂质。

表1：中药五谷虫脂肪酸分析

但是，起抗炎症作用的仅为不饱和脂肪酸，为了提高不饱和脂肪酸的纯度，本发明还进一步对脂肪酸粗提取物进行精炼，还包括以下步骤：

步骤S3：采用酸炼法脱胶，将步骤S2所得的中药五谷虫脂肪酸粗提取物放入容器中，在水浴中搅拌加热至70℃～80℃，边搅拌边加入质量为中药五谷虫脂肪酸粗提取物质量的1％的、浓度为75％～80％的磷酸，持续1min～15min，然后在4500r/min下离心分离得液体，取上层油样，为脱胶五谷虫脂肪酸。

步骤S4：向步骤S3所得的脱胶五谷虫脂肪酸中加入质量为脱胶五谷虫脂肪酸质量的1％～1.5％的、浓度为300g/L的氢氧化钠溶液，均匀搅拌后，加热至65℃～70℃，保温30min，然后冷却至室温，静置分层，离心分离得液体；用去离子水50ml清洗液体中残留的皂脚，反复清洗3次，之后，以4500r/min离心10～15min，离心分离得液体，取液体上层油样，为精炼后的五谷虫脂肪酸。

上述步骤3和步骤4主要去除五谷虫脂肪酸粗提取物中的少量的蛋白质、磷脂和黏液性等胶状物质、重金属、以及除去其中的游离脂肪酸，使精炼后的五谷虫脂肪酸全部为不饱和脂肪酸。

本发明从中药五谷虫中提取脂肪酸的用处主要是为了作为抗菌、消炎成分，下面对精制后的脂肪酸抗菌活性进行检测。

一、脂肪酸溶液的配制

将采用优化条件精制后的脂肪酸稀释至20mg/ml，然后在一新的96孔板中加入90ul培养基加入10ul 20mg/ml的各脂肪酸钠盐溶液，于酶标仪600nm下测OD值(OD600)。

二、细菌培养

取20uL复苏好的细菌加入到3ml新鲜无菌的NB培养基中，放入恒温摇床内，37℃、160转振荡3～4h至对数期(OD值0.6～0.8)，取新鲜的NB培养基将菌液稀释至约106cfu/ml的悬液备用。

三、抗菌活性检测

取无菌的96孔板，于超净工作台内向每孔中加入90uL稀释的菌悬液，给药组加入10uL所需浓度的脂肪酸溶液，阴性对照组加入10uL 0.1M NaOH溶液，空白组加入10uL新鲜培养基，阳性对照组加入10uL抗生素溶液，每孔设4个复孔，封口膜封口后置于37℃、5％CO2的恒温培养箱中静置培养，分别在培养0、3、6、9、18h时于570nm波长下测量OD值(OD570)。最后所有数据扣除0时刻D570值，得到脂肪酸的抗菌作用曲线。

三种方法提取的脂肪酸溶解性质存在一定的差异，用酶标仪检测各方法提取脂肪酸浓度为2mg/ml时的OD600值如图9所示。可以看出：乙酸乙酯提取的脂肪酸溶解后吸光度最小。

三种方法提取脂肪酸样品与金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎双链球菌、铜绿假单胞菌在37℃共同孵育18h，以空白样品和0.1M NaOH样品做对比，其抗菌作用曲线如图10-图13。可以看出：1mg/ml脂肪酸对金黄色葡萄球菌有很强的抗菌活性，且乙酸乙酯提取的脂肪酸效果最佳；如图6-2可知，2mg/ml脂肪酸对大肠杆菌的抗菌效果很弱，说明五谷虫脂肪酸对大肠杆菌的作用效果不强；如图6-3可知，脂肪酸对肺炎双链球菌有很强的抗菌作用，且以乙酸乙酯提取法脂肪酸抗菌效果最佳；如图6-4可知，三种试剂提取脂肪酸都对铜绿假单胞菌抗菌活性相当。由上述结果可知，脂肪酸对G+和G-的细菌都有较好的活性，其中对金黄色葡萄球菌和肺炎双链球菌的效果最好，对铜绿假单胞菌次之，对大肠杆菌的效果较差。并且在抗菌作用曲线上可以看出，乙酸乙酯提取脂肪酸的作用效果都较其他两种试剂提取脂肪酸效果要好。

四、二倍稀释法检测脂肪酸的最小抑菌浓度

取无菌的96孔板，于超净工作台内向第一孔内加入180ul菌液，其余孔中加入100ul的菌液；第一孔给药组加入20ul(2mg/mL)脂肪酸，阴性对照组加入20ul 0.1M NaOH溶液，阳性对照组加入20ul抗生素，空白组加入20ul新鲜培养基，混匀后吸出100ul加入第二孔，依此类推，最后一孔混匀后去除100ul液体，最终每孔含100ul的液体；每孔3个复孔。封口后将96孔板放于37℃恒温孵箱内静置培养24h，然后于570nm波长下测量OD值(OD570)。抑菌率计算公式如下：

抑菌率(％)＝(阴性对照组OD值-药物组OD值)/阴性对照组OD值×100％

三种方法提取脂肪酸的最小抑菌浓度(MIC)结果如表2。从表2可以看出，乙酸乙酯提取脂肪酸对于金葡菌和铜绿假单孢菌的MIC最小，且三种提取方法提取的脂肪酸对于肺炎双链球菌三者MIC相当，综合考虑乙酸乙酯提取的脂肪酸的抗菌效果最优。

表2：中药五谷虫脂肪酸的最小抑菌浓度(MIC)

可见，本发明提取的中药五谷虫脂肪酸可以应用于抗菌药物中，具备对金黄色葡萄球菌、肺炎双链球菌、铜绿假单胞菌的抗菌能力。抗菌能力随中药五谷虫脂肪酸含量的增加而增强。因此，为了提高药物的抗菌能力，本发明对精制后的中药五谷虫脂肪酸进一步浓缩，将浓缩后的产品添加至药物中，增强抗菌效果。

采用冷冻结晶法进行浓缩，将精制后的脱酸五谷虫脂肪酸置于0℃冰箱内放置12h，五谷虫脂肪酸结晶不断析出，迅速用抽滤法得到五谷虫脂肪酸固体结晶，即得精制五谷虫脂肪酸。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。