细胞牵引力显微镜检测Hela细胞对于诺考达唑应答的方法

摘要

细胞牵引力显微镜检测HeLa细胞对于诺考达唑应答的方法，涉及细胞牵引力显微镜。所述细胞牵引力显微镜是一种无标记和非侵入性方式的检测平台，设有弹性PDMS基底，在弹性PDMS基底界面处嵌入荧光标记颗粒，并用该弹性PDMS基底作为细胞培养基底模拟正常细胞贴附，细胞在贴附过程中将引起弹性PDMS基底弹性变形，所述弹性变形的信息被随机分布在凝胶基底表面的荧光标记颗粒位移所记录，以此获得基底弹性变形场，进而反演求解相应的细胞牵引力场。所述细胞牵引力显微镜可在抗癌药物药效及药理检测中应用。

说明书

技术领域

本发明涉及细胞牵引力显微镜，尤其是涉及细胞牵引力显微镜检测HeLa细胞对于诺考达唑应答的方法。

背景技术

化疗，即利用化学药物阻止癌细胞的增殖、浸润、转移并引起肿瘤细胞死亡的一种治疗方式，是目前治疗恶性肿瘤的重要策略之一。其药理学研究重点在观测肿瘤细胞对于化学药物的摄取，及其引起的细胞内DNA损伤、细胞周期阻滞、药物靶点结合、癌基因或肿瘤相关调节蛋白表达量改变等相关的细胞内信号转导及死亡机制。虽然肿瘤细胞对于化学药物的细胞应答为抗癌药物设计的合理性以及新的治疗策略开发提供许多有价值的线索，但是通常该过程的研究需要花费高昂的成本，并且需要较长的开发周期用于探明该细胞及生理过程，使得研究人员迫切需要开发出一种能够以无标记和非侵入性方式实时、无损、快速检测肿瘤细胞对于化学药物应答。

细胞形态和牵引力是细胞的重要物理性质，它涉及许多复杂的生物信号转导通路，同时对于细胞的增殖、分化、收缩、迁移和凋亡等都起着重要的调控作用，而且也直接与诸多严重疾病(如肿瘤)的发生发展有着密切关系。在单细胞水平上，运用细胞牵引力显微镜方法定量研究细胞活动规律及特点具有重要的生理病理学意义。近期，我们在影响因子超过20的国际权威杂志(Wu,Y.-L.；Putcha,N.；Ng,K.W.；Leong,D.；Lim,C.T.；Loo,S.C.；Chen,X.Biophysical Responses upon the Interaction of Nanomaterials with Cellular Interfaces.Accounts ofChemical Research,2013,46(3):782-791)发表的文章表明，细胞物理性能的变化可作为细胞对于外界化学刺激应答的一个重要指标。类似的报道也表明，例如大黄素(emodin)、细胞松弛素D(cytochalasin D)和微丝抑制剂(latrunculin B)等典型的化疗药物对于肿瘤细胞生理功能的影响也涉及到细胞牵引力的变化，其关键原因在于这些化疗药物对于与肿瘤细胞牵引力密切相关的细胞肌动蛋白丝具有显著的破坏能力,同时也提示了以该细胞牵引力为指标用于药物应答检测的可能性。

发明内容

本发明的第一目的是提供一种用于无标记和非侵入性方式的检测平台细胞牵引力显微镜。

本发明的第二目的是提供细胞牵引力显微镜在抗癌药物药效及药理检测中的应用。

本发明的第三目的是提供所述细胞牵引力显微镜检测的构建方法。

本发明的第四目的是提供所述细胞牵引力显微镜检测HeLa细胞对于紫杉醇(paclitaxel)应答的方法。

本发明的第五目的是提供细胞牵引力显微镜检测HeLa细胞对于诺考达唑应答的方法。

所述细胞牵引力显微镜是一种无标记和非侵入性方式的检测平台，设有弹性PDMS基底，在弹性PDMS基底界面处嵌入荧光标记颗粒，并用该弹性PDMS基底作为细胞培养基底模拟正常细胞贴附，细胞在贴附过程中将引起弹性PDMS基底弹性变形，所述弹性变形的信息被随机分布在凝胶基底表面的荧光标记颗粒位移所记录，以此获得基底弹性变形(位移)场，进而反演求解相应的细胞牵引力场。

所述荧光标记颗粒可采用单层荧光微球。

所述弹性PDMS基底的底部可设有盖玻片。

所述细胞牵引力显微镜可在抗癌药物药效及药理检测中应用。

所述细胞牵引力显微镜(细胞牵引力检测平台)可以灵敏地检测人宫颈癌HeLa细胞对于化疗药物紫杉醇(paclitaxel)的实时动力学细胞应答，并且该应答具有浓度依赖性。

所述细胞牵引力显微镜检测的构建方法如下：

(a)在弹性PDMS基底界面处嵌入单层荧光微球(microspheres，Invitrogen公司)，用弹性PDMS基底作为细胞培养基底模拟正常细胞贴附；

(b)采取荧光图像记录的单层荧光微球的位置为“力加载”图像；

(c)除去细胞后再次记录单层荧光微球位置作为“空”图像；

(d)对比“力加载”图像和“空”图像用以确定单层荧光微球位移；

(e)最后利用已得到的位移信息使用基底变形反演计算获得细胞牵引力力映射图像和数据，在(x_i,y_i)位置上的牵引力计算是基于其中代表格林应变张量，代表该点位置上荧光微球的位移。

所述细胞牵引力显微镜检测HeLa细胞对于紫杉醇(paclitaxel)应答的方法如下：

1)准备实验材料

细胞系：人宫颈癌HeLa细胞；

癌细胞系用DMEM(Gibco公司)+10％胎牛血清(Hyclone公司)培养，实验还需紫杉醇及其衍生物；

2)实验方法

将人宫颈癌HeLa细胞培养在掺有荧光微球的弹性PDMS基底上，并观测细胞牵引力场在化疗药物紫杉醇刺激下的变化，具体测定方法如下：

A.胰酶消化对数期细胞，终止后离心收集，制成细胞悬液，细胞计数调整其浓度至(1～2)×10⁴个/ml；

B.将细胞悬液制备好后，轻轻混匀，在掺有荧光微球的弹性PDMS基底上加入300μl细胞悬液,这样待测细胞的密度为3000～6000/孔；

C.将接种好的细胞培养板放入培养箱中培养，过夜后加入不同浓度梯度的药物紫杉醇，每孔300μl,设3～5个复孔；

D.5％CO₂，37℃孵育，活细胞连续观测共聚焦显微镜下(Leica>

F.同时设置空白实验(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液)，对照实验(细胞、相同浓度的药物溶解介质、紫杉醇类似物)。

所述细胞牵引力显微镜检测HeLa细胞对于诺考达唑应答的方法如下：

1)准备实验材料

细胞系：人宫颈癌HeLa细胞；

癌细胞系用DMEM(Gibco公司)+10％胎牛血清(Hyclone公司)培养，实验还需诺考达唑(Sigma公司)；

细胞牵引力显微镜：在弹性PDMS基底(Dow Corning公司)界面处嵌入单层荧光微球(microspheres，Invitrogen公司)，用此弹性PDMS基底作为细胞培养基底模拟正常细胞贴附，采取荧光图像记录的荧光微球的位置为“力加载”图像，除去细胞后再次记录荧光微球位置作为“空”的图像；对比“力加载”图像和“空”图像用以确定荧光微球位移，最后利用已得到的位移信息使用基底变形反演计算获得细胞牵引力力映射图像和数据，在(x_i,y_i)位置上的牵引力计算是基于其中代表格林应变张量，代表该点位置上荧光微球的位移；

2)实验方法

将人宫颈癌HeLa细胞培养在掺有荧光微球的弹性PDMS基底上，并观测细胞牵引力场在化疗药物诺考达唑刺激下的变化，具体测定方法如下：

A.胰酶消化对数期细胞，终止后离心收集，制成细胞悬液，细胞计数调整其浓度至(1～2)×10⁴个/ml；

B.将细胞悬液制备好后，轻轻混匀，在掺有荧光微球的弹性PDMS基底上加入300μl细胞悬液,这样待测细胞的密度为3000～6000/孔；

C.将接种好的细胞培养板放入培养箱中培养，过夜后加入不同浓度梯度的药物诺考达唑，每孔300μl，设3～5个复孔；

D.5％CO₂，37℃孵育，活细胞连续观测共聚焦显微镜下(Leica>

E.同时设置空白实验(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液)。

所述HeLa细胞牵引力应答，与细胞活性MTT实验、细胞凋亡PARP切割实验、细胞周期分析实验以及目前已经商业化的细胞阻抗检测传感系统(xCELLigence RTCA SPInstrument)相比，具有更高的灵敏性，可以在更短时间内表征出肿瘤细胞对于化疗药物的应答。体现本发明中所提供的检测平台具有快速、无损的化疗药物药效表征能力。

所述HeLa细胞牵引力应答可作为一种药理检测的新方法，其特点是当选择诺考达唑(nocodazole)这一与紫杉醇有着相同细胞内微管靶点的药物时，该细胞牵引力检测平台能够给出显著区别于紫杉醇的不同动力学特征细胞应答曲线，体现其具有探明不同药物作用机理的能力。

用于实时、无损、快速检测肿瘤细胞对于化学药物的应答，并评估化疗药物药理及药效的新方法。

本发明涉及基于高性能细胞牵引力显微镜用于定量研究并评估抗癌药物药效及药理的应用。所述细胞牵引力显微镜可获得肿瘤细胞对于抗癌药物的实时动力学应答。所述实时动力学特征曲线的变化，较传统的细胞活性MTT实验、细胞凋亡PARP切割实验、细胞周期分析实验以及目前已经商业化的细胞阻抗检测传感系统(xCELLigence RTCA SP Instrument)相比具有较短的反应时间以及较高的灵敏度。由于所述的实时动力学应答对于不同作用机制的药物表现出显著不同的特征曲线，可用于药物作用机理的揭示。

附图说明

图1为细胞牵引力显微镜的结构组成示意图。

图2为细胞贴附过程示意图。

图3表示细胞牵引力显微镜可灵敏地(1h之内)检测出人宫颈癌HeLa细胞对于化疗药物紫杉醇(paclitaxel)的应答。

图4表示细胞活性MTT实验结果表明化疗药物紫杉醇无法在1h内引起细胞活性的显著下降。

图5表示细胞周期分析实验表明化疗药物紫杉醇无法在1h内引起细胞周期的显著变化，其变化只能出现在药物作用24h后。

图6表示细胞凋亡PARP切割实验结果表明化疗药物紫杉醇无法在1h内引起细胞的凋亡，其显著凋亡作用只能出现在药物作用24h后。

图7表示目前已经商业化的细胞阻抗检测传感系统(xCELLigence RTCA SP Instrument)在1h内只能检测出HeLa细胞对于较高浓度(1μM)的化疗药物紫杉醇的应答，而无法检测出较低浓度(0.2μM)的化疗药物紫杉醇所引起的细胞反应。

图8表示当选择诺考达唑(nocodazole)这一与紫杉醇有着相同细胞内微管靶点的药物时，该细胞牵引力检测平台能够给出显著区别于紫杉醇的不同动力学特征细胞应答曲线；归其原因在于不同于紫杉醇具有稳定微管的能力，诺考达唑只能通过让微管解聚发挥抗癌作用；体现该检测平台具有探明不同药物作用机理的能力。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的描述，但具体实施例并不对本发明做任何限定。

参见图1和2，所述细胞牵引力显微镜是一种无标记和非侵入性方式的检测平台，设有弹性PDMS基底，在弹性PDMS基底界面处嵌入荧光标记颗粒，并用该弹性PDMS基底作为细胞培养基底模拟正常细胞贴附，细胞在贴附过程中将引起弹性PDMS基底弹性变形，所述弹性变形的信息被随机分布在凝胶基底表面的荧光标记颗粒位移所记录，以此获得基底弹性变形(位移)场，进而反演求解相应的细胞牵引力场。

所述荧光标记颗粒可采用单层荧光微球。

所述弹性PDMS基底的底部可设有盖玻片。

所述细胞牵引力显微镜可在抗癌药物药效及药理检测中应用。

实施例1：细胞牵引力显微镜检测的构建

以聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane，PDMS，Dow Corning公司)材料制作弹性薄膜进行细胞培养及相应的牵引力测量，简要地说，实时细胞牵引力应力映射涉及以下几个步骤：

(a)在弹性PDMS基底界面处嵌入单层荧光微球(microspheres，Invitrogen公司)，用弹性PDMS基底作为细胞培养基底模拟正常细胞贴附；

(b)采取荧光图像记录的荧光微球的位置为“力加载”图像；

(c)除去细胞后再次记录荧光微球位置作为“空”图像；

(d)对比“力加载”图像和“空”图像用以确定荧光微球位移；

(e)最后利用已得到的位移信息使用基底变形反演计算获得细胞牵引力力映射图像和数据，在(x_i,y_i)位置上的牵引力计算是基于其中代表格林应变张量，代表该点位置上荧光微球的位移。

实施例2：细胞牵引力显微镜检测HeLa细胞对于紫杉醇(paclitaxel)的应答

本实施例采用聚二甲基硅氧烷材料制作弹性薄膜进行细胞培养及相应的牵引力测量法检测紫杉醇对于人宫颈癌HeLa细胞实时牵引力的影响，其具体操作如下：

(1)实验材料

细胞系：人宫颈癌HeLa细胞。

癌细胞系用DMEM(Gibco公司)+10％胎牛血清(Hyclone公司)培养。实验还需紫杉醇及其衍生物。

(2)实验方法

将人宫颈癌HeLa细胞培养在掺有荧光微球的弹性PDMS基底上，并观测细胞牵引力场在化疗药物紫杉醇刺激下的变化，具体测定方法如下：

A.胰酶消化对数期细胞，终止后离心收集，制成细胞悬液，细胞计数调整其浓度至1～2×10⁴个/ml。

B.将细胞悬液制备好后，轻轻混匀，在掺有荧光微球的弹性PDMS基底上加入300μl细胞悬液,这样待测细胞的密度为3000～6000/孔。

C.将接种好的细胞培养板放入培养箱中培养，过夜后加入不同浓度梯度的药物紫杉醇，每孔300μl,设3～5个复孔。

D.5％CO₂，37℃孵育，活细胞连续观测共聚焦显微镜下(Leica>

E.同时设置空白实验(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液)，对照实验(细胞、相同浓度的药物溶解介质、紫杉醇类似物)。

(3)实验结果如下：

从图3可以看出，相比于空白及对照实验中几乎稳定的细胞牵引力曲线，HeLa细胞能够在紫杉醇刺激的15min至1h内表现出显著的细胞牵引力下降曲线，并且其下降速率与紫杉醇在一定范围内的浓度成正比，显示出细胞牵引力显微镜能够有效地用于化疗药物的药效检测。

从图4可以看出，传统上用来评估化疗药物药效及作用机制的细胞活性MTT实验、细胞凋亡PARP切割实验、以及细胞周期分析实验都无法在短时间(1h)而只能在24h后才能检测出紫杉醇的药效，其原因在于紫杉醇所引起的线粒体凋亡通路及细胞周期阻滞通常需要16h以上才能发挥作用。

表示细胞凋亡PARP切割实验结果表明化疗药物紫杉醇无法在1h内引起细胞的凋亡，其显著凋亡作用只能出现在药物作用24h后(参见图6)。

将细胞牵引力显微镜同目前已经商业化的另外一种无标记细胞阻抗检测传感系统(xCELLigence RTCA SP Instrument)相比较，实验结果证明，本发明的测试平台能够在1h内测试到更低浓度(0.2μM)以下的肿瘤细胞应答，其原因在于细胞阻抗检测传感系统依赖于细胞的贴附形状，但细胞牵引力的变化显著敏感于细胞形态的变化。

表示目前已经商业化的细胞阻抗检测传感系统(xCELLigence RTCA SP Instrument)在1h内只能检测出HeLa细胞对于较高浓度(1μM)的化疗药物紫杉醇的应答，而无法检测出较低浓度(0.2μM)的化疗药物紫杉醇所引起的细胞反应(参见图7)。

综上所述，细胞牵引力显微镜能够快速、灵敏、无损地用于化疗药物的药效检测。实施例3：细胞牵引力显微镜检测HeLa细胞对于诺考达唑(nocodazole)的应答

本实施例选取同样以细胞内微管为靶点的另一种化疗药物诺考达唑(nocodazole)，考察其对于人宫颈癌HeLa细胞实时牵引力的影响，并与HeLa细胞在紫杉醇刺激下实时牵引力应答特征曲线比较，其具体操作如下：

(1)实验材料

细胞系：人宫颈癌HeLa细胞。

癌细胞系用DMEM(Gibco公司)+10％胎牛血清(Hyclone公司)培养。实验还需诺考达唑(Sigma公司)。

细胞牵引力显微镜：在弹性PDMS基底(Dow Corning公司)界面处嵌入单层荧光微球(microspheres，Invitrogen公司)，用此弹性PDMS基底作为细胞培养基底模拟正常细胞贴附。采取荧光图像记录的荧光微球的位置为“力加载”图像，除去细胞后再次记录荧光微球位置作为“空”的图像；对比“力加载”图像和“空”图像用以确定荧光微球位移，最后利用已得到的位移信息使用基底变形反演计算获得细胞牵引力力映射图像和数据，在(x_i,y_i)位置上的牵引力计算是基于其中代表格林应变张量，代表该点位置上荧光微球的位移。

(2)实验方法

将人宫颈癌HeLa细胞培养在掺有荧光微球的弹性PDMS基底上，并观测细胞牵引力场在化疗药物诺考达唑刺激下的变化，具体测定方法如下：

A.胰酶消化对数期细胞，终止后离心收集，制成细胞悬液，细胞计数调整其浓度至1～2×10⁴个/ml。

B.将细胞悬液制备好后，轻轻混匀，在掺有荧光微球的弹性PDMS基底上加入300μl细胞悬液,这样待测细胞的密度为3000～6000/孔。

C.将接种好的细胞培养板放入培养箱中培养，过夜后加入不同浓度梯度的药物诺考达唑，每孔300μl，设3～5个复孔。

D.5％CO₂，37℃孵育，活细胞连续观测共聚焦显微镜下(Leica>

E.同时设置空白实验(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液)。

(3)实验结果：

从图5可以看出，相同于紫杉醇刺激，HeLa细胞也会在诺考达唑刺激下表现出明显的细胞形态收缩，但却表现出显著不同的细胞牵引力应答。相比于空白实验中几乎稳定的细胞牵引力曲线，HeLa细胞能够在诺考达唑刺激的15min内表现出明显的细胞牵引力上升，然而在15min～1h内表现出细胞牵引力下降曲线，显示出与紫杉醇刺激下显著不同的细胞牵引力特征曲线，提示该测试平台能够用于化疗药物的药物作用机理检测。其原因在于诺考达唑能够靶向并解聚细胞微管，而细胞微管是细胞牵引力形成过程中的重要刚性缓冲结构且能够平衡细胞微丝产生的张力，细胞微管的解聚导致细胞微丝张力的失衡而导致牵引力的上升；但后期由于微管的加速解聚引起细胞收缩以及黏着斑的丧失，从而导致细胞牵引力的下降。然而对于紫杉醇并不存在上述分子机制，因而表现出不同动力学特征细胞应答曲线。综上所述，细胞牵引力显微镜能够快速、灵敏、无损地用于化疗药物的药理检测。

表示当选择诺考达唑(nocodazole)这一与紫杉醇有着相同细胞内微管靶点的药物时，该细胞牵引力检测平台能够给出显著区别于紫杉醇的不同动力学特征细胞应答曲线；归其原因在于不同于紫杉醇具有稳定微管的能力，诺考达唑只能通过让微管解聚发挥抗癌作用；体现该检测平台具有探明不同药物作用机理的能力(参见图8)。