溶血磷脂酸、溶血磷脂酸受体3以及溶血磷脂酸受体3激动剂的应用

摘要

本发明公开了溶血磷脂酸、溶血磷脂酸受体3及溶血磷脂酸受体3激动剂的应用，涉及生物医药领域。本发明的研究发现，溶血磷脂酸、或溶血磷脂酸受体3及其激动剂可以促进心肌细胞增殖和抑制心肌细胞凋亡修复损伤心肌，可显著减小心梗面积，并显著提高心梗后心功能，效果明显。因此，溶血磷脂酸、溶血磷脂酸受体3及其激动剂可以用于制备治疗或预防心脏病的药物或制剂等领域中，为治疗或预防心脏病例如缺血性心脏病提供一种新的药物和治疗思路。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体而言，涉及溶血磷脂酸、溶血磷脂酸受体3以及溶血磷脂酸受体3激动剂的应用。

背景技术

心脏疾病是全世界范围内导致成人死亡的最主要原因，缺血性冠状动脉疾病、高血压等都可以导致心脏病，致使心功能下降、心律失常、心力衰竭进而死亡，成年哺乳动物心脏不能有效生成新的心肌细胞替代损伤心肌，尽管许多药物和机械装置可以改善心功能，但这些方法并不能替代丢失的心肌细胞，因此需要新的策略治疗心肌损伤。促进心肌再生和抑制心肌细胞凋亡是修复损伤心肌的重要策略。

干细胞移植是心肌再生治疗的重要方向，但移植的外源干细胞在病损心肌的存留和存活是其面临的重大问题。近些年，基于激活内源性心肌再生的治疗策略已被提出，越来越多的证据显示哺乳动物心肌细胞在出生后仍具有增殖潜能(Bergmann O等，Science,2009, 324:98-102。Enzo R.Porrello等，Science,2011,331:1078-1080)，近来的一项研究显示人由1岁到20岁左室心肌细胞数量增加3.4倍 (Mollova M等，Proc Natl Acad Sci US A,2013,110(4):1446-1451)，提示心肌细胞增殖参与人类出生后心脏发育生长过程。此外，斑马鱼和小鼠的研究显示，阻断心肌细胞增殖足以抑制损伤后心肌再生和修复(Jopling C等，Nature,2010,464:606-609)。因此，促进心肌细胞增殖是激活内源性心肌再生的重要方向。心肌细胞凋亡是心肌细胞的一种程序性死亡，在心脏发育和多种心脏疾病的病理生理过程中发挥关键作用，通过抑制心肌细胞凋亡可减小心肌梗死小鼠的心梗面积。

目前，用于治疗心脏病尤其是缺血性心脏病的药物和手段还比较有限，需要开发出更多的可用于治疗心脏病的药物和治疗手段。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供溶血磷脂酸、溶血磷脂酸受体3及其激动剂的应用，为心脏病例如缺血性心脏病提供一种新的治疗思路和药物。

本发明是这样实现的：

溶血磷脂酸或溶血磷脂酸受体3在制备用于治疗或预防心脏病的药物或制剂中的应用。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述心脏病为缺血性心脏病。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述缺血性心脏病包括但不限于心肌梗死、缺血性心力衰竭等。

溶血磷脂酸或溶血磷脂酸受体3在制备用于促进心肌细胞再生、抑制心肌细胞凋亡、改善心肌细胞活力或修复心肌细胞损伤的药物或制剂中的应用。

溶血磷脂酸(Lysophosphatidic acid，LPA)是一种结构最简单的水溶性甘油磷脂分子，通过其特异性受体发挥生物学功能。目前已确定至少有七种溶血磷脂酸受体(LPA1-LPA7)，属于G蛋白偶联受体家族，这些不同亚型的LPA受体广泛存在于心血管系统、神经系统、生殖系统、免疫系统等，参与血管生成、血管新生、神经发育、受精卵的存活、淋巴细胞迁移、炎症反应等病理生理过程。LPA的分子式为C₂₁H₄₁O₇P，分子量为436.52，化学结构式如下：

溶血磷脂酸受体3激动剂在制备用于治疗或预防心脏病的药物或制剂中的应用。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述心脏病为缺血性心脏病。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述缺血性心脏病包括包括但不限于心肌梗死和缺血性心力衰竭等。

溶血磷脂酸受体3激动剂在制备用于促进心肌细胞再生、抑制心肌细胞凋亡、改善心肌细胞活力或修复心肌细胞损伤的药物或制剂中的应用。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述溶血磷脂酸受体3 激动剂包括但不限于溶血磷脂酸和溶血磷脂酸的化学类似物例如 OMPT等。

OMPT，英文名称1-oleoyl-2-O-methyl-rac-glycerophosphothionate 其分子式为C₂₂H₄₃O₆PS，分子量为466.52，化学结构式如下：

OMPT可特异性地激活溶血磷脂酸受体3(LPA3)，而溶血磷脂酸可针对多种亚型溶血磷脂酸受体产生作用。

一种用于治疗或预防心脏病的药物或制剂，其含有溶血磷脂酸受体3、表达溶血磷脂酸受体3的载体或溶血磷脂酸受体3激动剂。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，表达溶血磷脂酸受体3 的载体包括但不限于可以表达溶血磷脂酸受体3的腺相关病毒或其它病毒等。

本发明的研究发现，溶血磷脂酸、溶血磷脂酸受体3及其激动剂可以促进心肌细胞增殖和抑制心肌细胞凋亡修复损伤心肌，可显著减小心梗面积(12％)，并显著提高心梗后心功能(LVEF增加近50％)，效果明显。

因此，溶血磷脂酸、溶血磷脂酸受体3及其激动剂可以用于制备治疗或预防心脏病的药物或制剂等领域中，为治疗或预防心脏病例如缺血性心脏病提供一种新的药物和治疗思路。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例中的过表达LPA3(溶血磷脂酸受体3)对小鼠心梗后心功能的影响(图中：A为左室短轴M型超声代表图；B 为过表达LPA3小鼠心梗后2周和8周左室射血分数(LVEF))；

图2为本发明实施例中的过表达LPA3对小鼠心梗后8周心肌梗死面积的影响(图中：A为天狼猩红染色显示梗死面积的代表图；B 为梗死面积计算结果，梗死面积的计算方法为：(梗死内径+梗死外径) /(左心室内径+左心室外径))；

图3为本发明实施例中的过表达LPA3对小鼠心梗后8周非梗死区心肌细胞增殖的影响(图中：A为pH3免疫荧光染色代表图；B 为心梗后不同部位pH3阳性心肌细胞数量；C为Ki67免疫荧光染色代表图；D为心梗后不同部位Ki67阳性心肌细胞数量；MI为心肌梗死区；border为梗死周边区；remote为梗死远端区)；

图4为本发明实施例中的过表达LPA3对小鼠心梗后8周凋亡细胞数量的影响(图中：A为TUNEL染色代表图；B为心梗后不同部位TUNEL阳性心肌细胞百分比)；

图5为本发明实施例中的过表达LPA3对小鼠心梗后8周凋亡相关基因的影响(图中：A为促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2的 Western blot图；B为统计结果图)；

图6为本发明实施例中的LPA3基因缺失对小鼠心梗后8周心功能的影响(图中：A为左室短轴M型超声代表图；B为LPA3基因缺失小鼠心梗后8周左室射血分数(LVEF)；sham为假手术；MI8W 为心梗后8周)；

图7为本发明实施例中的LPA3基因缺失对小鼠心梗后8周心肌梗死面积的影响(图中：A为天狼猩红染色显示梗死面积的代表图； B为梗死面积计算结果，其计算方法为：(梗死内径+梗死外径)/(左心室内径+左心室外径))；

图8为本发明实施例中的LPA对大鼠乳鼠心肌细胞的促增殖作用(图中：A为不同剂量LPA刺激48小时对心肌细胞数量的影响； B为1μMLPA刺激心肌细胞48小时后Ki67的阳性率)；

图9为本发明实施例中的OMPT对大鼠乳鼠心肌细胞的促增殖作用不同剂量OMPT刺激48小时对心肌细胞数量的影响；

图10为本发明实施例中的过表达LPA3的载体结构示意图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

过表达LPA3对小鼠心梗后心功能和梗死面积的影响

(1)小鼠心肌梗死模型的建立

小鼠称重记录体重后，按照400mg/kg的浓度腹腔注射三溴乙醇溶液进行麻醉(25ng左右小鼠约0.2mL)；

用75％酒精对小鼠左侧胸部进行消毒，使用脱毛膏将手术视野附近毛发脱去；进行气管插管，连接呼吸机；

沿左侧肋骨平行方向左胸外部剪开皮肤，沿肌肉走形方向钝性分离各层肌肉露出肋骨，用撑开器撑开肌肉，让肋骨层暴露在视野中央；在第3-4肋间隙用精细直镊分开肌肉层，用小鼠撑开器撑开上、下肋间，暴露心脏和肺脏器官；

用精细直镊及弯镊小心拉开心包膜；用7-0带针丝线在心耳下缘 1-2毫米处结扎血管，打结后可见远端左心室心肌迅速缺血变白，以此作为结扎成功的依据；

撤出撑开器至皮下肌肉层，用7-0带针丝线缝合开口后的上下肋骨，肌肉逐层覆盖后，5-0带针线缝皮；用75％酒精清洁切口及周围皮肤，将小鼠俯卧平放于温热的加热垫上，待小鼠清醒后归还于饲养笼中。

(2)腺病毒载体构建

腺相关病毒包装采用的病毒类型为AAV2/9，LPA3过表达载体插入有小鼠Lpar3基因全长序列NM_022983，LPA3过表达载体购自元和生物技术(上海)股份有限公司，载体信息如图10所示,A图和 B图分别代表空载体和LPA3过表达载体，空载体名称为H3058Amp 抗性，在其上游(Hind III)和下游(KpnI)克隆酶切位点插入融合表达的Lpar3-EGFP构建成为LPA3过表达载体。

(3)实验分组和处理

a.对照组：心肌梗死模型结扎成功后，用微量进样针，吸取40μL AAV9-control病毒(总含量为1×10¹¹vg)沿梗死边缘区三点注射后关胸。

b.实验组：心肌梗死模型结扎成功后，用微量进样针，吸取40μL AAV9-LPA3过表达病毒(总含量为1×10¹¹vg)沿梗死边缘区三点注射后关胸。

(4)实验方法

采用小鼠心肌梗死模型，在梗死同时于梗死区注射LPA3过表达病毒和对照病毒，于心梗后2周和8周心脏超声检测心功能，并于8 周超声后进行心脏取材，采用天狼猩红染色确定梗死面积，具体方法为将准备好的石蜡切片烤片脱蜡后滴加适量天狼猩红染色液覆盖组织，染色1小时，水洗5分钟后，切片脱水透明，用中性树脂胶封片，晾干后于显微镜下拍照，计算心肌梗死面积。

(5)结果

心梗的小鼠注射AAV9-LPA3或者AAV9-control病毒后2周时和 8周时分别对小鼠进行心脏超声检测，并在8周超声检测后取材。从图1可以看出，心梗后2周即可见LPA3过表达组(AAV9-LPA3)相比于对照组(AAV9-Control)左室射血分数(LVEF)有一定的提高，至心梗后8周对照组LVEF进一步降低，而LPA3过表达组与自身2 周比未见明显下降，且LVEF显著高于对照组。心脏取材后，采用天狼猩红染色确定心肌梗死面积，从图2可以看出：心梗后8周LPA3 过表达组心肌梗死面积显著小于对照组。这些结果表明LPA3过表达改善心梗后心功能并能显著降低梗死面积。

实施例2

过表达LPA3对小鼠心梗后心肌细胞增殖的影响

(1)实验分组和处理

同实施例1。

(2)实验方法

采用小鼠心肌梗死模型，在梗死同时于梗死区注射LPA3过表达和对照病毒，于心梗后8周进行心脏取材，通过免疫荧光共染心肌标志物α-s-actin和增殖标志物Ki67及pH3。具体方法为将准备好的石蜡切片烤片脱蜡后进行抗原修复，磷酸缓冲液清洗后用山羊血清封闭 1小时，然后加适当浓度的一抗(抗α-s-actin、Ki67或pH3)4℃孵育过夜，磷酸缓冲液清洗后加入适当浓度的带有不同荧光的二抗37℃避光孵育1小时，磷酸缓冲液清洗后用含DAPI的封片剂封片，荧光显微镜下观察并计数梗死周边区和梗死远端增殖的心肌细胞数量。

(3)结果

从图3中可以看出：心梗后8周，在梗死周边区，实验组即LPA3 过表达组(AAV9-LPA3)pH3阳性心肌细胞数量显著高于对照组 (AAV9-Control)，而在梗死远端区域，实验组pH3阳性和Ki67阳性心肌细胞的数量均显著高于对照组。这些结果表明LPA3过表达可以促进心梗后心肌细胞增殖。

实施例3

过表达LPA3对小鼠心梗后心肌细胞凋亡水平的影响

(1)实验分组和处理

同实施例1。

(2)实验方法

采用小鼠心肌梗死模型，在梗死同时于梗死区注射LPA3过表达和对照病毒，于心梗后8周进行心脏取材，通过TUNEL实验检测梗死周边区和梗死远端心肌细胞凋亡情况，具体方法为将准备好的石蜡切片烤片脱蜡后用蛋白酶K预处理破细胞膜，然后用山羊血清封闭1 小时，滴加适当浓度的cTNT抗体4℃孵育过夜，磷酸缓冲液清洗后加入适当浓度的荧光二抗37℃避光孵育1小时，磷酸缓冲液清洗后用含DAPI的封片剂封片，荧光显微镜下观察凋亡细胞数量。另外，同时通过western blot实验检测细胞凋亡相关蛋白Bax、Bcl2的表达情况，western blot的操作包括蛋白提取、蛋白定量、聚丙稀酰胺凝胶电泳、转膜、封闭、一抗孵育、二抗孵育、显色、光度仪拍照、灰度分析，操作参考：Wang F,et al.Developmentalchanges inlysophospholipid receptor expression in rodent heart from near-termfetus to adult.Mol Biol Rep.2012Sep；39(9):9075-84。

(3)结果

从图4可以看出：TUNEL实验结果显示LPA3过表达组 (AAV9-LPA3)梗死远端的TUNEL阳性率显著低于对照组 (AAV9-Control)，而梗死边缘区也有下降趋势。同时，从图5可以看出：凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2检测结果显示LPA3过表达组 (AAV9-LPA3)梗死远端凋亡指标Bax/Bcl-2显著低于对照组 (AAV9-Control)，这些结果表明心梗后LPA3过表达可明显降低梗死远端心肌细胞凋亡水平。

实施例4

LPA3基因缺失对小鼠心梗后心功能和梗死面积的影响

(1)小鼠心肌梗死模型的建立

同实施例1。

(2)实验分组和处理

a.野生小鼠假手术组：取SPF级BALb/c品系野生小鼠，在按照实施例1构建心肌梗死模型过程中，以7-0带针丝线穿过左前降支后不打结，其余操作同心梗组。

b.Lpar3基因缺失小鼠假手术组：取Lpar3基因缺失小鼠，在按照实施例1构建心肌梗死模型过程中，以7-0带针丝线穿过左前降支后不打结，其余操作同心梗组。

c.野生小鼠心梗组：取SPF级BALb/c品系野生小鼠(该小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司)，按照实施例1构建心肌梗死模型。

d.Lpar3基因缺失小鼠心梗组：取Lpar3基因缺失小鼠(该小鼠由Sanford BurnhamPrebys医学研究中心的Jerold Chun教授赠予，国内繁殖所得)，按照实施例1构建心肌梗死模型。

(3)实验方法

利用Lpar3基因缺失小鼠和小鼠心肌梗死模型，设假手术对照组，于心梗后8周进行心脏超声检测心功能，并进行心脏取材，采用天狼猩红染色确定梗死面积，具体方法同实施例1。

(4)结果

由图6可见：超声结果显示心梗8周后(MI8W)野生小鼠 (Lpar3^+/+)较假手术组(sham)左室射血分数(LVEF)显著下降，>-/-)心功能也较其假手术组显著下降，同时还显著低于野生小鼠心梗组，表明Lpar3基因缺失导致心梗后心功能进一步下降。由图7天狼猩红染色计算心肌梗死面积结果则显示，与野生小鼠相比，基因缺失小鼠心肌梗死面积更大，同时心腔进一步扩大。结合心脏超声方面的改变，以上结果说明Lpar3基因缺失小鼠在心梗后心肌梗死面积更大、心功能更差，其心肌损伤更为严重。

实施例5

LPA促进心肌细胞增殖的体外实验

(1)原代乳鼠心肌细胞培养

用75％酒精消毒乳鼠后，左手捏住其颈部，伸长其躯干，剪刀从剑突左缘剪开胸骨，暴露心脏后用镊子夹出置于PBS中清洗，将清洗后的心脏置于另一玻璃平皿，尽可能除去结缔组织和心房；将心脏用剪刀剪碎，加10mL消化液后用吸管移至刻度瓶中，置于37℃水浴中，并调节到适当的转速进行消化。头一个8分钟消化的上清弃去，第二个8分钟开始，收集消化后的上清，将其转移至含10mL 含10％FBS的DMEM的离心管中，再加入10mL消化液并轻轻将心肌细胞分散，在水浴锅中继续消化；此后每8分钟收集一次上清，当消化后的上清变成近似于无色澄清后可以终止消化；收集的消化液于室温1200rpm离心10分钟；弃去上清，加适量含10％FBS的DMEM，通过70μm滤器后，进行细胞贴壁培养60分钟，取出培养瓶，轻柔晃数次，将含有心肌细胞的悬液移入50mL离心管，1000rpm离心10 分钟，弃上清，用心肌细胞培养液重悬细胞，按5×10⁵/cm²的密度接种至25cm²培养瓶或六孔板中培养。

(2)实验分组和处理

a.对照组：原代培养乳鼠心肌细胞用PBS洗2遍，加入DMEM 基础培养液，静息培养24小时，更换为DMEM基础培养液作为对照组，与实验组同步进行培养。

b.实验组：原代培养乳鼠心肌细胞用PBS洗2遍，加入DMEM 基础培养液，静息培养24小时，加入不同浓度LPA(0.1、1、5、10μM，购自Avanti公司，货号857328)进行培养。

(3)实验方法

将原代培养乳鼠心肌细胞以一定密度接种于盖玻片上，静息处理后，进行LPA刺激实验，以无LPA处理者为对照，5％CO₂细胞培养箱中处理48小时，固定细胞后用山羊血清封闭1小时，然后加适当浓度的一抗(抗α-sarcomeric>

(4)结果

由图8可以看出：LPA对培养的乳鼠心肌细胞有明显的促增殖作用，并呈现剂量依赖关系，与对照组相比，0.1μM、1μM、5μM LPA 作用48小时分别可促进心肌细胞增殖23％、43％、55％。增殖标志物Ki67的免疫荧光结果显示，与对照组相比，1μM LPA作用心肌细胞48小时后，Ki67的阳性率显著增加(p<0.05)，对照组和LPA处理组Ki67的阳性率分别为23％和35％。

实施例6

LPA3激动剂OMPT促进心肌细胞增殖的体外实验

(1)实验分组和处理

a.对照组：原代培养乳鼠心肌细胞用PBS洗2遍，加入DMEM 基础培养液，静息培养24小时，更换为DMEM基础培养液作为对照组，与实验组同步进行培养。

b.实验组：原代培养乳鼠心肌细胞用PBS洗2遍，加入DMEM 基础培养液，静息培养24小时，加入不同浓度OMPT(0.1、0.5、1、2.5、5μΜ，购自Avanti公司，货号857235)进行培养，37℃，5％CO₂细胞培养箱中处理48小时，免疫荧光染色标记心肌细胞，5％CO₂细胞培养箱中处理48小时。

(2)实验方法

将原代培养乳鼠心肌细胞以一定密度接种于盖玻片上，静息处理后，进行OMPT刺激实验，以无OMPT处理者为对照，5％CO₂细胞培养箱中处理48小时，固定细胞进行α-sarcomeric>

(4)结果

由图9可以看出：采用不同剂量OMPT刺激心肌细胞48小时后，α-sarcomeric actin免疫荧光标记心肌细胞进行细胞计数，结果显示 OMPT也可以明显促进心肌细胞的增殖，并呈现剂量依赖关系，表明 LPA3受体特异激活剂可以促进体外培养心肌细胞增殖。

综上，本发明实施例的研究结果表明：溶血磷脂酸、或溶血磷脂酸受体3及其激动剂可以促进心肌细胞增殖和抑制心肌细胞凋亡，进而修复损伤心肌，可显著减小心梗面积(12％)，并显著提高心梗后心功能(LVEF增加近50％)，效果明显。因此，溶血磷脂酸、溶血磷脂酸受体3及其激动剂可以用于制备治疗或预防心脏病的药物或制剂等领域中，为治疗或预防心脏病例如缺血性心脏病提供一种新的药物和治疗思路。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。