葡萄糖磷酸异构酶的酶显色定量测定试剂盒及测定方法

摘要

本发明涉及葡萄糖磷酸异构酶的酶显色定量测定试剂盒及测定方法，D‑果糖‑6‑磷酸二钠在葡萄糖磷酸异构酶作用下生成葡萄糖‑6‑磷酸，葡萄糖‑6‑磷酸与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸在葡萄糖‑6‑磷酸脱氢酶作用下生成还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)，NADH与水溶性四氮唑盐反应，反应产物在550nm处有最大吸光度，吸光度值与GPI浓度成正比。本发明的葡萄糖磷酸异构酶的酶显色定量测定方法的各项指标均符合临床要求，可用于临床葡萄糖磷酸异构酶含量的检测。

说明书

技术领域

本发明涉及葡萄糖磷酸异构酶的酶显色定量测定试剂盒及方法，属于临床检测技术领域。

背景技术

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种病因尚未完全阐明、以侵犯四肢小关节为主的自身免疫性疾病，RA早期即可产生不可逆的骨侵蚀和关节破坏，如果未能得到及时治疗，RA患者在2-3年的致残率约为60％-70％，因此RA的早期诊断及规范化治疗极为重要。探讨其发病机制对于RA的诊治和预防至关重要。

葡萄糖磷酸异构酶(GPI)是一种广泛表达并且具有多种功能的蛋白质，它是能量循环过程和糖分解过程中必不可少的胞浆酶，同时它又作为细胞外信号传导分子。GPI是自分泌运动因子和神经细胞因子，可能在肿瘤和自身免疫方面起着一定的作用。近年研究发现，葡萄糖磷酸异构酶(GPI)可作为自身抗原与自身免疫病尤其是类风湿关节炎密切相关，且与活动期患者的疼痛及肿胀关节数成正相关。研究表明GPI可能通过与抗体复合物激活补体替代途径，诱发关节炎。GPI可诱导C57BL/10小鼠产生关节炎，疾病的发生与Ⅱ型主要组织相容性复合体相关。关于GPI及其抗体在RA中的诊断价值，大多数研究结果表明GPI抗原诊断RA的敏感性＞65％，特异性≥90％，有较高的诊断价值。随着GPI检测项目在临床应用上快速开展，对于检测技术的快速准确和高效提出了新的要求。所以迫切需求一种能快速准确且灵敏度和精密度高的检测葡萄糖磷酸异构酶的方法来满足RA的临床诊断。

中国专利文件CN102323401A公开了一种葡萄糖-6-磷酸异构酶(GPI)抗原体外检测试剂盒，包括检测板、羊抗GPI抗体、胶体金结合物、封闭液、洗涤液、阳性参考品和阴性参考品。采用双抗体夹心胶体金免疫吸附法原理检测人血清中的GPI抗原，将羊抗GPI抗体包被于硝酸纤维素膜，制成固相抗体，用以捕获人外周血清中可能存在的GPI抗原。再将胶体金标记于羊抗GPI抗体，形成胶体金结合物作为示踪物，如被测人血清中含有GPI抗原，则形成固相羊抗GPI抗体-GPI抗原-胶体金结合物。然而，该方法只能检测GPI的蛋白含量，而不能检测其酶活性高低。目前的临床研究证实GPI活性在类风湿关节炎诊断中更具有意义。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种葡萄糖磷酸异构酶的酶显色定量测定试剂盒及方法。

本发明的技术方案如下：

一种葡萄糖磷酸异构酶的酶显色定量测定试剂盒，包括试剂R₁、试剂R₂和稀释液A；

所述的试剂R₁包括如下组分浓度组成：D-果糖-6-磷酸二钠(F6P)1250-1300mg/L，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)450-500mg/L，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)4-6mg/L；

所述的试剂R₂包括如下组分浓度组成：水溶性四氮唑盐(WST-3)18-22mg/L，吩嗪硫酸甲酯(PMS)1-3mg/L，壬基酚聚氧乙烯醚(NP-40)990-1010mg/L；

所述的稀释液A包括如下组分组成：Tris 1200-1210mg/L，EDTA·2Na 370-375mg/L，KCl 3720-3730mg/L，MgCl₂>

所述的试剂R₁用稀释液A溶解，所述的试剂R₂用水溶解。

根据本发明，优选的，所述的试剂R₁包括如下组分浓度组成：F6P>

所述的试剂R₂包括如下组分浓度组成：WST-3>

所述的稀释液A包括如下组分组成：Tris 1210mg/L，EDTA·2Na 372.24mg/L，KCl3725mg/L，MgCl₂>

根据本发明，优选的，所述的稀释液A用1mol/L的柠檬酸调节pH到8.05。

根据本发明，所述的试剂盒放在2～8℃保存。

根据本发明，利用上述试剂盒对葡萄糖磷酸异构酶的酶显色定量测定方法，包括步骤如下：

(1)将试剂R₁与试剂R₂混合均匀，得到混合液；

(2)向混合液中加入待测样品，37℃反应10min，得反应液；

(3)测定反应液在550nm处的吸光度，根据GPI标准品制定的浓度与吸光度之间的标准曲线y＝0.0429x+0.1083，y表示样品中GPI的浓度，x表示吸光度，得到待测样品中GPI的浓度。

根据本发明，优选的，步骤(1)中试剂R₁与试剂R₂按照1：1体积比混合。

根据本发明，优选的，步骤(2)中混合液与待测样品的体积比为10:1。

本发明的原理：

本发明根据F6P在葡萄糖磷酸异构酶作用下生成G6P，G6P再与NAD在G6PDH的作用下生成NADH，NADH与WST-3发生颜色反应，在550nm处有最大吸光度，吸光度值与GPI浓度成正比。本发明通过测定酶催化反应产生的底物浓度，进而间接的体现出葡萄糖磷酸异构酶活性的高低。显示底物浓度越高说明葡萄糖磷酸异构酶的活性越高。

本发明的有益效果如下：

1、本发明应用酶显色法对GPI定量检测，操作简单快速，相比现有定量检测产品检测时间短，在10分钟内即可完成单一样本的检测，能够灵敏、准确、快速的反映出葡萄糖磷酸异构酶的活性。

2、本发明的检测线性范为0.00082-2.5mg/L，在线性范围内具有较好的精密度和准确度。稳定性试验显示，12个月内检测浓度为0.05mg/L、0.3mg/L、0.6mg/L的GPI质控品，各浓度相对偏差可以控制在允许范围以内，认为试剂有效期>12个月。干扰物胆红素(200mg/L)，血红蛋白(5g/L)，甘油三酯(15g/L)不影响试剂检测。检测结果与葡萄糖磷酸异构酶(GPI)ELISA检测试剂盒的测定结果具有良好的相关性，且两种方法测定结果偏差无统计学意义(P>0.05)。

3、本发明方法无需配备大型仪器设备，使用成本相对低廉，适用于地方基层医院应用。

附图说明

图1为实施例中GPI酶显色法测定的标准曲线。

具体实施方式

下面通过具体实施例并结合附图对本发明作进一步说明，但不限于此。

实施例中所用原料和设备均为常规市购产品。

1.标本来源：RA组选取2015年12月至2016年9月山东大学齐鲁医院风湿免疫科门诊和住院患者39例，其中男性13例，女性26例，年龄20-83岁，平均年龄(60±15)岁，所有患者均符合美国风湿病协会(ACR)联合欧洲抗风湿病联盟(EULAR)2009年修订的RA诊断标准。非RA组选取同期在我院门诊就诊和住院的患者52例，其中男性18例，女性34例，年龄19-83岁，平均年龄(54±17)岁，均符合国内或国际相应的诊断标准。其中系统性红斑狼疮患者23例，混合型结缔组织病2例，强直性脊柱炎6例，干燥综合征10例，未分化结缔组织病3例,多发性肌炎/皮肌炎5例，脊柱关节病2例，肠病性关节炎1例。正常对照组选取在我院体检健康者32名，其中男性10例，女性22例，年龄26-81岁，平均年龄(53±16)岁。所有病例均空腹采集静脉血3ml，分离血清，-80℃冰箱备用。所有标本一次冻融后测定。

2.仪器与试剂：Infinite M200 Pro多功能酶标仪购买自瑞士Tecan公司，PHS-3E型pH计购买自雷磁公司，Tris购买自美国sigma公司，EDTA.2Na、KCl、MgCl₂购买自西陇化工股份有限公司，D-果糖-6-磷酸二钠(F6P)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)、葡萄糖磷酸异构酶标准品购买自瑞士Roche公司，水溶性四氮唑盐(WST-3)购买自南京旋光科技有限公司，柠檬酸、吩嗪硫酸甲酯(PMS)购买自阿拉丁公司，壬基酚聚氧乙烯醚(NP-40)购买自安耐吉公司。葡萄糖磷酸异构酶(GPI)ELISA检测试剂盒购买自上海北加生化试剂有限公司。

实施例中GPI浓度与吸光度之间的标准曲线为y＝0.0429x+0.1083，R²＝0.9923，如图1所述。标准曲线的制备过程如下：

将0.75mg/L的GPI标准品，用0.05mol/L Tris缓冲液(pH＝7.6)分别稀释至0.6mg/L、0.45mg/L、0.3mg/L、0.15mg/L、0.05mg/L，Tris缓冲液本身作为空白校准品，测定GPI标准品浓度与吸光度之间的关系曲线。

实施例1

一种葡萄糖磷酸异构酶的酶显色定量测定试剂盒，包括：

配制稀释液A：其中Tris 1210mg/L，EDTA.2Na 372.24mg/L，KCl 3725mg/L，MgCl₂1016.5mg/L，用1mol/L的柠檬酸调节pH到8.05。

试剂R₁：F6P>

试剂R₂：WST-3>

上述试剂制备好均放在2～8℃保存。

实施例2

利用实施例1所述的试剂盒对葡萄糖磷酸异构酶的酶显色定量测定方法，包括步骤如下：

实验前10分钟先将试剂R₁与试剂R₂按1：1体积比混合均匀，得混合液，每孔吸取100uL混合液；

向混合液中加入10ul待测样品，37℃反应10min，得反应液；

用Infinite M200 Pro测定反应液在550nm处的吸光度，根据GPI标准品制定的浓度与吸光度的标准曲线，得到待测样品中GPI的浓度。

试验例1、GPI酶显色定量测定方法的精密度与准确度

抽取两个批次的检测试剂，分别对浓度0.05mg/L、0.30mg/L、0.60mg/L的GPI质控品进行测定，每个浓度重复20次，计算批内和批间各浓度测试结果的CV，并统计各浓度测试结果偏倚情况。采用两次配液同时测定，每个质控重复测定20次，批内与批间各检测浓度CV<10％，且t检验显示各浓度测试结果偏倚可接受(P>0.05)。见表1.

表1两批试剂精密度与准确度分析结果

由表1可知，本发明试剂的精密度和准确度CV值都小于10％，完全能够满足临床检测的要求。

试验例2、干扰实验

临床上对于血清测定的干扰主要有脂浊、黄疸和溶血。实验采用添加干扰物的方式进行，分别在高、中、低值血清中添加不同浓度的干扰物质，测定加入前后结果的差异。

分别检测标本添加200mg/L的胆红素、5g/L的血红蛋白、15g/L的甘油三酯的前后结果差异，结果相对偏差在±10％以内认为干扰物不影响标本测试。见表2。

表2各干扰物加入前后的测定结果

上述表2结果可见，该试剂在胆红素浓度≤200mg/L，血红蛋白浓度≤5g/L，甘油三酯浓度≤15g/L的情况下，各浓度范围的平均偏差均在5％内，根据临床标准实验要求偏差应在±10％以内，完全在临床上使用的可接受范围内。

试验例3、稳定性实验结果

试剂置于2～8℃保存，14个月(试剂有效期12个月+延长2个月)内每个月分别测试浓度为0.05mg/L、0.30mg/L、0.60mg/L的GPI质控品，每个浓度重复10次，检测结果用x±s表示，测试结果相对偏差在±20％以内认为试剂稳定性良好。

稳定性试验结果如表3所示，14个月内检测浓度为0.05mg/L、0.3mg/L、0.6mg/L的GPI质控品，各浓度相对偏差在±20％以内，试剂有效期>12个月。见表3。

表3葡萄糖磷酸异构酶的酶显色法定量测定的稳定性试验结果

注：0.05mg/L、0.3mg/L、0.6mg/L浓度的±20％分别为0.04～0.06mg/L、0.24～0.36mg/L、0.48～0.72mg/L.

由表3可知，本发明试剂盒具有良好的稳定性。

试验例4、回收率测定

分析样品1浓度0.3mg/L和分析样品2浓度0.6mg/L重复测定5次，平均回收浓度分别为0.31mg/L和0.59mg/L，回收率分别为103.3％和98.3％，平均回收率100.8％。如表4。

表4回收率测定

试验例5、临床标本检测结果对比

123份标本按照RA组(n＝39)、非RA组(n＝52)和对照组(n＝32)分为3组，其检测结果见表5。

分别用酶显色法和ELISA试剂盒检测这123份血清标本，均得到123份有效数据。将这两组数据进行相关分析，结果显示两组数据在RA组(n＝39)、非RA组(n＝52)和对照组(n＝32)各组均没有明显差异，关于两种方法对临床标本检测数据的比较，秩和检验结果显示：Z＝﹣1.38，P＝0.122>0.05，两者间无统计学差异。

表5 GPI酶显色法检测结果与ELISA检测试剂盒检测结果对比

由表5可知，用本发明方法检测123份临床血清标本，与GPI ELISA试剂盒检测结果比较，有较好的一致性。

采用SPSS 19.0拟合标准曲线方程，r≥0.99表示线性良好。各组数据用x±s表示。试剂准确度偏倚分析采用t检验方法。两种方法临床定量检测结果的相关性采用SPSS一元直线回归分析，相关系数(r)≥0.98表示相关性良好，偏差分析采用配对秩和检验。