壬二酸的应用、含有壬二酸的佐剂和疫苗剂

摘要

本发明涉及壬二酸的应用、含有壬二酸的佐剂和疫苗剂，所述壬二酸作为佐剂在疫苗中的用量为：每单份疫苗液中含有0.5～3mg的壬二酸。含有壬二酸的佐剂，由5～30μL的浓度为75v/v%的乙醇和0.5～3mg的壬二酸组成。本发明佐剂原料易得，疫苗制备工艺简单，成本低，性能稳定，毒副作用小，在免疫剂量范围内使用是安全可靠的，能够有效的诱导抗原特异性的体液免疫应答，显著增强抗原特异性的体液免疫反应，效果优于无佐剂、单一佐剂组、效果相当铝佐剂。

说明书

技术领域

本发明涉及壬二酸的应用、含有壬二酸的佐剂和疫苗剂，属于免疫学领域。

背景技术

疫苗佐剂是当与抗原一起注射或预先注入机体时，可增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答的物质，而本身无抗原性的物质。可以在免疫反应低下的人群(如老人、儿童和免疫低下的人)中诱导全面持久的免疫应答。自20世纪初被发现以来，已有使用佐剂来改善以及增强疫苗对机体的免疫应答，比如铝佐剂。但铝佐剂不适于重组蛋白和亚单位疫苗，也会产生不良反应，如炎症，刺激局部产生红斑，肉芽肿，皮下结节，接触性皮炎，IgE介导的超敏反应，铝佐剂也不能诱导细胞毒性T细胞应答。目前，尽管已经有大量新型疫苗佐剂处于研究开发和临床试验阶段，但是真正获得批准用于人类疫苗的佐剂寥寥无几。因此研发新型的疫苗佐剂在疫苗的研发中具有重要的作用。

壬二酸为9碳直链饱和二元酸，亦称为杜鹃花酸、anchoec acid、azelaic acid、1，9-nonanedioic acid、1,7-heptanedicarboxylic acid、lepargylic acid，分子式为C₉H₁₆O₄和(CH₂)₅(CH₂COOH)₂，相对分子质量为188.22，CAS注册号为123-99-9，化合物目录数据库EINECS号码为204-669-1。壬二酸呈白色至微黄色单斜棱晶、针状结晶或粉末。熔点98～103℃，沸点286℃(100mmHg)，闪点215℃，蒸气压0.13kPa(20℃)，相对密度1.03(水20℃)，微溶于冷水(2.4g/L>

壬二酸是由共生酵母马拉色菌(Malassezia furfur)天然产生的中链二羧酸，马拉色菌是人类和许多其它动物的正常皮肤菌群的一部分，在人体中以低水平存在，摄入的食物来源如小麦，大麦和黑麦。壬二酸是一种具有多种活性的复合分子，随着对其临床应用的不断认识，发现及证实了壬二酸的抗炎、抗感染和抗菌作用。目前，壬二酸在治疗痤疮、黑色素瘤、黄褐斑、酒糟鼻、色素过度沉着及硬化症等方面得到了广泛应用。已经证明壬二酸通过几种途径调节正常人角质形成细胞的炎症反应，包括调节过氧化物酶体增殖物激活受体g和核因子(nuclear factor kB)NF-KB的信号传导途径，调控细胞因子TNF-a、IL-1、IL-6等，这些细胞因子与免疫应答相关，同时观察到促炎细胞因子分泌的抑制作用。壬二酸是体外酪氨酸酶和其他氧化还原酶的可逆抑制剂，抑制线粒体呼吸，也可以抑制厌氧糖酵解。在体外和体内，它对有氧和厌氧(丙酸杆菌)都具有抗菌作用。虽然抗菌活性的确切机制尚待完全阐明，但是壬二酸对代谢，酶活性和细胞内pH都有影响。较低的环境pH也可能增强这种二羧酸的杀菌作用。另外，壬二酸可以抑制活性氧(reactive oxygen species，ROS)从中性粒细胞的释放，也可以通过直接清除作用减少ROS。

目前没有关于壬二酸作为佐剂的相关研究的报道。鉴于壬二酸具有抗菌及抗炎的作用，以及一些研究发现，壬二酸具有抗肿瘤作用，不仅对黑素瘤细胞有抑制作用还对其他肿瘤细胞(如磷癌细胞)也有抑制作用，推测其具备潜在的疫苗佐剂效应。

发明内容

为解决现有疫苗佐剂存在的价格昂贵、注射后副反应严重、促进免疫应答效果不显著等问题，本发明提供壬二酸在制备疫苗佐剂中的应用，以及提供一种经济、有效、安全、稳定的含有壬二酸的佐剂和疫苗剂及其制备方法。

本发明通过下列技术方案实现：壬二酸在制备疫苗佐剂中的应用。

所述壬二酸作为佐剂在疫苗中的用量为：每单份疫苗液中含有0.5～3mg的壬二酸。

进一步地，作为一个优选，所述壬二酸用量为3mg。

本发明的另一目的还在于提供一种含有壬二酸的佐剂，由5～30μL的浓度为75v/v％的乙醇和0.5～3mg的壬二酸组成。

一种含有壬二酸的疫苗剂，所述疫苗剂为300μL，由下列组分组成：

单份疫苗液、

浓度为75v/v％的乙醇5～30μL、

壬二酸0.5～3mg、

生理盐水为余量。

上述含有壬二酸的疫苗剂的制备方法，包括如下步骤：

(1)在5～30μL的浓度为75v/v％的乙醇加入0.5～3mg的壬二酸，待壬二酸完全溶解后得佐剂混合液；

(2)在步骤(1)所得佐剂混合液中加入单份疫苗液得到含佐剂的疫苗液；

(3)在步骤(2)所得含佐剂的疫苗液中加入生理盐水至300μL，混合均匀，即得含有壬二酸的疫苗剂。

壬二酸分子式为C₉H₁₆O₄，与现有合成佐剂性质不同，壬二酸的安全性高，可用于孕妇。壬二酸具有抗炎、抗感染和抗菌作用。

本发明与现有技术相比具有下列优点和效果：(1)本发明的佐剂原料易得，疫苗制备工艺简单，成本低，性能稳定，毒副作用小，在免疫剂量范围内使用是安全可靠的；(2)壬二酸佐剂能够有效的诱导抗原特异性的体液免疫应答，显著增强抗原特异性的体液免疫反应，效果优于无佐剂、单一佐剂组。实验期间内，所有小鼠饮食、活动均正常，各个实验组之间小鼠体重无明显差异，小鼠均未出现松毛、缩团、发抖等异常反应，注射部位也无异常，实验结束后小鼠无死亡。对实验小鼠进行心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏的组织切片观察均未观察到病变。证明壬二酸作为佐剂安全无毒。

具体实施方式

下面结合实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件，文中所述的较佳条件实施方法仅作示范之用。

以下选择壬二酸作为佐剂，观察其对甲型肝炎抗原诱导小鼠体液免疫应答的影响，以此评价壬二酸的佐剂效果。

实施例1

本例提供的含有壬二酸佐剂的甲肝疫苗是：用5μL75％乙醇溶解0.5mg壬二酸后得佐剂，佐剂中按常规加入每单份HAV抗原(即动物实验使用的单次注射剂量)，最后加入生理盐水至300μL，混合均匀，得含有壬二酸佐剂的甲肝疫苗。

其中，壬二酸为市购产品，分子式为C₉H₁₆O₄，分子量约为188.22，购自瑞士adamas-beta；HAV抗原为市购的滴度为256EU/mL>

所得含有壬二酸佐剂的甲肝疫苗的免疫试验和效果如下：

A、免疫

将清洁级雌性ICR小鼠共49只，5～6周龄，体质量18～22/g，随机分为壬二酸佐剂组、氢氧化铝佐剂组、无佐剂组和空白组，共四组，每组7只；所用氢氧化铝为常用的氢氧化铝胶体佐剂，在人体中的剂量为1.8-2.7mg。

对壬二酸佐剂组：注射实施例1的含有壬二酸佐剂的甲肝疫苗至小鼠体内，注射剂量为每只小鼠300μL，其中300μL疫苗中含有壬二酸0.5mg，甲肝抗原18EU。

对氢氧化铝佐剂组：将氢氧化铝300μg与甲肝抗原18EU混合后生理盐水加至300μL，经皮下多点注射到小鼠体内，注射剂量为每只小鼠300μL。

对无佐剂组：将甲肝抗原18EU与生理盐水混合至300uL，再经皮下多点注射到小鼠体内，注射剂量为每只小鼠300μL。

对空白组：仅注射生理盐水，注射剂量为每只小鼠300uL。

免疫方案：在第0周经皮下多点注射到小鼠体内，免疫次数为一次。

B、ELISA检测血清抗－HAV IgG水平

在免疫后的第4、8、12、16周，采集小鼠尾静脉血，分离血清，ELISA检测血清抗-HAVIgG水平，按KPL公司生产的小鼠IgG ELISA试剂盒说明书进行检测操作。

C、数据分析

对所获得的实验数据以Graphpad prism5统计软件进行t检验，以P<0.05为差异的统计学意义。

表1为使用实施例1提供的佐剂后，16周内，各实验组小鼠血清抗-HAV IgG水平(抗体效价值)。

表1

通过数据分析可以看出，除空白对照组外，各组小鼠免疫后4周、8周、12周、16周，均产生抗HAV IgG抗体。第4周时，壬二酸佐剂组(0.5mg)小鼠抗HAV IgG抗体水平均高于无佐剂组，具有统计学差异(P<0.05)。

实施例2

本例提供的壬二酸佐剂的甲肝疫苗是：用10μL75％乙醇溶解1mg壬二酸后佐剂，佐剂中按常规加入每单份HAV抗原(即动物实验中使用的单次注射剂量)，最后加入生理盐水至300μL，混合均匀，得含有壬二酸佐剂的甲肝疫苗。

本例所得含有壬二酸佐剂的甲肝疫苗的免疫试验同实施例1，结果见表2。

表2为使用实施例2提供的佐剂后，16周内，各实验组小鼠血清抗-HAV IgG抗体水平。

表2

通过数据分析可以看出，除空白组外，各实验组小鼠免疫4周后，均检测到抗-HAVIgG。

实施例3

本例提供的壬二酸佐剂的甲肝疫苗是：用20μL75％乙醇溶解2mg壬二酸后佐剂，佐剂中按常规加入每单份HAV抗原(即动物实验中使用的单次注射剂量)，最后加入生理盐水至300μL，混合均匀，得含有壬二酸佐剂的甲肝疫苗。

本例所得含有壬二酸佐剂的甲肝疫苗的免疫试验同实施例1，结果见表3。

表3为使用实施例3提供的佐剂后，16周内，各实验组小鼠血清抗-HAV IgG抗体水平。

表3

通过数据分析可以看出，除空白对照组外，各组小鼠免疫后4周、8周、12周、16周，均产生抗HAV IgG抗体。第12周壬二酸佐剂组(2mg)小鼠抗HAVIgG抗体水平均高于无佐剂组，具有统计学差异(P<0.05)。

实施例4

本例提供的壬二酸佐剂的甲肝疫苗是：用30μL75％乙醇溶解3mg壬二酸后佐剂，佐剂中按常规加入每单份HAV抗原(即动物实验中使用的单次注射剂量)，最后加入生理盐水至300μL，混合均匀，得含有壬二酸佐剂的甲肝疫苗。

本例所得含有壬二酸佐剂的甲肝疫苗的免疫试验同实施例1，结果见表4。

表4为使用实施例4提供的佐剂后，16周内，各实验组小鼠血清抗-HAV IgG抗体水平。

表4

通过数据分析可以看出，除空白对照组外，各组小鼠免疫后4周、8周、12周、16周，均产生抗HAV IgG抗体，在第8周时达到峰值，此后逐渐下降。在第4周时，壬二酸佐剂组(3mg)小鼠抗HAV IgG抗体水平均高于无佐剂组和氢氧化铝佐剂组，具有统计学差异(P<0.05)。第8、12周壬二酸佐剂组(3mg)小鼠抗HAV IgG抗体水平高于无佐剂组具有统计学差异(P<0.05)。

实施例5

本例提供的含有壬二酸佐剂的乙肝疫苗是：用10μL75％乙醇溶解1mg壬二酸后佐剂，佐剂中按常规加入每单份乙肝表面抗原(即动物实验中使用的单次注射剂量)，最后加入生理盐水至300μL，混合均匀，得含有壬二酸佐剂的乙肝疫苗。

其中，壬二酸获得方式同实施例1，乙肝表面抗原为常规的含乙肝表面抗原1μg的市购产品，购自中国医学科学院医学生物学研究所。

本例所得含有壬二酸佐剂的乙肝疫苗的免疫试验同实施例1，效果见表5。

表5为使用实施例5提供的佐剂后，16周内，各实验组小鼠血清抗-乙肝表面抗原IgG抗体水平。

表5

通过数据分析可以看出，除空白对照组外，各组小鼠免疫后4周、8周、12周、16周，均产生抗HBV IgG抗体，在第8周时达到峰值，壬二酸佐剂组(1mg)小鼠抗HBV IgG抗体水平高于无佐剂组，具有统计学差异(P<0.05)。

实施例6

本例提供的含有壬二酸佐剂的乙肝疫苗是：用20μL75％乙醇溶解2mg壬二酸后佐剂，佐剂中按常规加入每单份乙肝表面抗原(即动物实验中使用的单次注射剂量)，最后加入生理盐水至300μL，混合均匀，得含有壬二酸佐剂的乙肝疫苗。

其中，壬二酸获得方式同实施例1，乙肝表面抗原为常规的含乙肝表面抗原1μg的市购产品，购自中国医学科学院医学生物学研究所。

本例所得含有壬二酸佐剂的乙肝疫苗的免疫试验同实施例1，效果见表6。

表6为使用实施例6提供的佐剂后，16周内，各实验组小鼠血清抗-乙肝表面抗原IgG抗体水平。

表6

通过数据分析可以看出，除空白对照组外，各组小鼠免疫后4周、8周、12周、16周，均产生抗HBV IgG抗体于第8周达到峰值，此后逐渐下降。第八周时，壬二酸佐剂组(2mg)产生抗HBV IgG抗体高于无佐剂组，具有统计学差异(P<0.05)。

实施例7

本例提供的含有壬二酸佐剂的乙肝疫苗是：用30μL75％乙醇溶解3mg壬二酸后佐剂，佐剂中按常规加入每单份乙肝表面抗原(即动物实验中使用的单次注射剂量)，最后加入生理盐水至300μL，混合均匀，得含有壬二酸佐剂的乙肝疫苗。

其中，壬二酸获得方式同实施例1，乙肝表面抗原为常规的含乙肝表面抗原1μg的市购产品，购自中国医学科学院医学生物学研究所。

本例所得含有壬二酸佐剂的乙肝疫苗的免疫试验同实施例1，效果见表7。

表7为使用实施例7提供的佐剂后，16周内，各实验组小鼠血清抗-乙肝表面抗原IgG抗体水平。

表7

通过数据分析可以看出，除空白对照组外，各组小鼠免疫后4周、8周、12周、16周，均产生抗HBV IgG抗体，在第8周时达到峰值，此后逐渐下降。第4周，壬二酸佐剂组(3mg)产生抗HBV IgG抗体均高于无佐剂组和氢氧化铝佐剂组,具有统计学差异(P<0.05)。第8、12周，壬二酸佐剂组(3mg)产生抗HAVIgG抗体高于无佐剂组,具有统计学差异(P<0.05)。

实施例8

本发明提供的含有壬二酸佐剂的疫苗是：用20μL75％乙醇溶解2mg壬二酸后得佐剂，佐剂中按常规加入每单份狂犬病毒抗原(即动物实验中使用的单次注射剂量)，最后加入生理盐水至300μL，混合均匀，得含有壬二酸佐剂的狂犬疫苗。

其中，壬二酸获得方式同实施例1；狂犬病毒抗原为常规的含狂犬病毒抗原0.125IU的市购产品，购自大连汉信生物制药有限公司。

本例所得含有壬二酸佐剂的狂犬疫苗的免疫试验同实施例1，效果见表8。

表8为使用实施例8提供的佐剂后，16周内，各实验组小鼠血清抗狂犬病毒IgG抗体水平。

表8

通过数据分析可以看出，除空白对照组外，各组小鼠免疫后4周、8周、12周、16周，均产生抗狂犬病毒IgG抗体，在第8周时达到峰值，此后逐渐下降。第8、12周，壬二酸佐剂组(2mg)产生抗狂犬病毒IgG抗体高于无佐剂组,具有统计学差异(P<0.05)。

实施例9

本发明提供的含有壬二酸佐剂的疫苗是：用30μL75％乙醇溶解3mg壬二酸后得佐剂，佐剂中按常规加入每单份狂犬病毒抗原(即动物实验中使用的单次注射剂量)，最后加入生理盐水至300μL，混合均匀，得含有壬二酸佐剂的狂犬疫苗。

其中，壬二酸获得方式同实施例1；狂犬病毒抗原为常规的含狂犬病毒抗原0.125IU的市购产品，购自大连汉信生物制药有限公司。

本例所得含有壬二酸佐剂的狂犬疫苗的免疫试验同实施例1，效果见表9。

表9为使用实施例9提供的佐剂后，16周内，各实验组小鼠血清抗狂犬病毒IgG抗体水平。

表9

通过数据分析可以看出，除空白对照组外，各组小鼠免疫后4周、8周、12周、16周，均产生抗狂犬病毒IgG抗体，在第8周时达到峰值，此后逐渐下降。第4周，壬二酸佐剂组(3mg)产生抗狂犬病毒IgG抗体均高于无佐剂组和氢氧化铝佐剂组，具有统计学差异(P<0.05)。第8、12周，壬二酸佐剂组(3mg)产生抗狂犬病毒IgG抗体高于无佐剂组,具有统计学差异(P<0.05)。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。