一株高底物专一性酰基转移酶的珍贵束丝放线菌及其应用

摘要

本发明公开了一株高底物专一性酰基转移酶的珍贵束丝放线菌，为珍贵束丝放线菌(Actinosynnema pretiosum)X4732,已于2018年2月5日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO.60327。本发明采用连续易错PCR方法体外突变酰基转移酶的基因，以酰基转移酶缺失菌株为出发菌，通过接合转移技术建立含有酰基转移酶基因的突变体库，筛选获得正突变株，通过发酵验证、传代培养获得遗传性状稳定的珍贵束丝放线菌X4732。本发明菌株的安丝菌素AP‑3合成水平比原始菌株X47高2.7倍，可应用于工业化发酵生产。

说明书

技术领域

本发明属于微生物育种和生物技术领域，具体涉及一株高活性酶的珍贵束丝放线菌及其应用。

背景技术

安丝菌素(ansamitocin)是由珍贵束丝放线菌(Actinosynnema pretiosum)产生的安莎类抗生素。安丝菌素是一类高效的抗肿瘤药物，研究证实安丝菌素能够通过与微管结合抑制60种肿瘤细胞的增殖，临床试验表明安丝菌素药物对肺腺癌、肺鳞癌和肺肥大细胞癌等均有疗效。由于安丝菌素具有很强的细胞毒性，一般利用抗体的靶向作用将药物分子靶向肿瘤，从而降低临床化疗中药物的非特异性全身毒性。罗氏公司的抗癌药物Trastuzumab-DM1(T-DM1)是第一个成功上市的安丝菌素抗体偶联药物(DM1是安丝菌素的衍生物)，2013年被FDA批准治疗HER2受体阳性的乳腺癌转移和晚期病人。另外，还有多个安丝菌素衍生物的抗体偶联药物正在进行临床试验，比如：SAR-408701由癌胚抗原相关细胞粘附分子5和安丝菌素衍生物DM1组成，用于治疗实体肿瘤；BT-062由靶向CD138的单克隆抗体和安丝菌素衍生物DM1和DM4组成，用于治疗多发性骨髓瘤；SAR3419由人源化抗-CD19单克隆抗体和安丝菌素衍生物DM4组成，用于治疗包括非霍奇金淋巴瘤的B-细胞恶性肿瘤。

珍贵束丝放线菌发酵法生产安丝菌素获得的是一类安丝菌素混合物，主要含有AP-2、AP-3和AP-4组份，AP-2、AP-3和AP-4之间的差异在于C-3位羟基连接的酰基侧链不同，例如AP-2为丙酰基，AP-3为异丁酰基，AP-4为异戊酰基(如图1所示)。其中AP-3组份是用于开发安丝菌素衍生物的中间体，通过化学合成可以将AP-3转化成DM1和DM4等衍生物并用于抗体偶联药物开发，但是一般发酵液中AP-3组份仅占60％左右。此外，安丝菌素AP-3的发酵产量也偏低，严重影响安丝菌素的工业化生产，也为安丝菌素抗体偶联药物的新药开发和临床应用带来阻碍。因此研发安丝菌素AP-3高产菌株具有非常重要的工业价值。

野生型珍贵束丝放线菌的安丝菌素AP-3产量很低，所以现有的珍贵束丝放线菌工业菌株都是通过多轮诱变筛选得到的突变株，但是常规诱变育种技术的效率较低，成为制约安丝菌素AP-3生产技术提高的一个瓶颈。

酰基转移酶是安丝菌素前体添加异丁酰基侧链合成安丝菌素AP-3的关键酶，该酶活性提高时能够提高向安丝菌素添加异丁酰基侧链的催化效率，因此通过对酰基转移酶进行基因改造有望获得安丝菌素AP-3高产菌。但是酰基转移酶不仅具有催化异丁酰基修饰安丝菌素的活性，还能催化其他酰基修饰安丝菌素的活性，目前还不知道这些修饰作用的专一性与那些位点有关。由于基因改造的位点难以选择，目前尚未有关于对酰基转移酶进行基因改造而获得安丝菌素AP-3高产菌的报道。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的第一个目的是提供一株高底物专一性酰基转移酶的珍贵束丝放线菌及其应用。采用定向进化的策略，对克拉维胺酸氨基乙酰化酶进行定向改造，并配合高通量筛选技术获得高底物专一性酰基转移酶，进而得到安丝菌素AP-3高产菌株。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的一个方面涉及一种高底物专一性酰基转移酶，其具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

本发明的另一个方面涉及一种编码SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的基因。

本发明的另一个方面涉及一种编码SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的基因具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

本发明的再一个方面涉及一种重组载体，是将所述编码SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的基因插入到大肠杆菌表达载体中得到的表达含有酰基转移酶基因突变体的重组表达载体。所述大肠杆菌表达载体为pHLY12质粒。

本发明的再一个方面涉及一种重组宿主细胞，是将上述所述重组载体导入宿主细胞中，筛选得到的重组宿主细胞。

所述宿主细胞可为酵母、细菌、藻类或真菌。

优选的，所述宿主细胞为细菌。

进一步，优选的，所述宿主细胞具体为大肠杆菌DH5a。

本发明的再一个方面涉及一种宿主菌，是含有上述编码高底物专一性酰基转移酶的基因的珍贵束丝放线菌。

本发明的再一方面涉及一株高底物专一性酰基转移酶的珍贵束丝放线菌，该菌株具体为珍贵束丝放线菌X4732。已于2018年2月5日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(简称GDMCC，地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所)，保藏编号为GDMCC NO.60327。

本发明的珍贵束丝放线菌(Actinosynnema pretiosum)X4732与出发菌株珍贵束丝放线菌X47相比，酰基转移酶的基因有6个碱基发生改变，其分别为第108位由C变为T，第548位由T变为C，第563位由C变为G，第574位由G变为A，第728位由T变为C，第1044位由G变为A。其中第108位碱基突变引起密码子由TTC变为TTT，是同义突变，氨基酸没有变化，都是苯丙氨酸；第548位碱基突变引起密码子由GTG变为GCG，氨基酸由缬氨酸变为丙氨酸；第563碱基突变引起密码子由CCG变为CGG，氨基酸由脯氨酸变为精氨酸；第574位碱基突变引起密码子由GGG变为AGG，氨基酸由甘氨酸变为精氨酸；第728位碱基突变引起密码子由GTG变为GCG，氨基酸由缬氨酸变为丙氨酸；第1044位碱基突变引起密码子由GGG变为GGA，是同义突变，氨基酸没有变化，都是甘氨酸。

所述珍贵束丝放线菌(Actinosynnema pretiosum)X4732在制备安丝菌素AP-3中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明的第三个目的是提供该珍贵束丝放线菌(Actinosynnema pretiosum)X4732的制备方法，采用连续易错PCR方法体外突变酰基转移酶的基因，以已有的酰基转移酶缺失菌株为出发菌，通过接合转移技术建立含有酰基转移酶基因的突变体库，通过发酵验证、传代培养获得遗传性状稳定的珍贵束丝放线菌(Actinosynnema pretiosum)X4732。

本发明的第四个目的是提供一对用于体外突变克拉维胺酸氨基乙酰化酶基因的易错PCR的引物，其引物序列分别如序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

上游引物ASM19Forward序列：GCCATATGACCCCCGGTCCCGTCCTCCCT(SEQ ID NO.3)；

下游引物ASM19Reverse序列：CGTCTAGATCACCCCGCCGGGTCCGGGGCG(SEQ ID NO.4)。

所述连续易错PCR方法体外突变酰基转移酶的基因的具体方法为：

(1)PCR反应体系：模板DNA 2ul、10×PCR缓冲液5ul、Taq DNA聚合酶1ul、dATP 1～4ul、dTTP 1～4ul、dGTP 1～4ul、dCTP 1～4ul、上游引物2ul、下游引物2ul、25mM MgSO₄>2>

(2)PCR条件：预变性95℃8分钟，变性95℃20秒，退火50～65℃20秒，延伸72℃2分钟，循环30次，终延伸8分钟。

第1次PCR的模板DNA来源于出发菌株珍贵束丝放线菌X47，第2次PCR及后续PCR的模板DNA采用上次PCR产物。

所述含有酰基转移酶基因的突变体库的构建方法，具体步骤如下：

(1)将连续易错PCR产物用NdeI和XbaI进行双酶切，凝胶琼脂糖电泳分离后回收酶切产物，并与同样双酶切的穿梭载体pHLY12进行连接，转化大肠杆菌DH5a，挑取转化子进行鉴定，得重组pHLY12；

(2)采用接合转移技术将重组pHLY12转入珍贵束丝放线菌X47的酰基转移酶基因缺失菌株，得到一系列接合子，即构建得到酰基转移酶基因的突变体库。

筛选正突变株所采用的方法为：采用摇瓶发酵和HPLC检测法，对突变体库中的接合子进行高通量筛选。

本发明的有益效果：

(1)本发明首次采用定向突变的方式筛选得到酰基转移酶基因的突变体，通过连续易错PCR在体外对酰基转移酶基因进行突变，同时通过高通量筛选方法获得安丝菌素AP-3高产菌株X4732，安丝菌素AP-3合成水平比出发菌株X47高2.7倍，可应用于工业化发酵生产，具有重要的经济价值。

(2)本发明的珍贵束丝放线菌工程菌的制备方法，构建酰基转移酶基因突变体的速度快，同时正突变菌株的筛选效率高，符合工业生产菌株的育种需要。

附图说明

图1安丝菌素的化学结构。

图2是X4732与X47的安丝菌素AP-3发酵水平比较。

具体实施方式

结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。

实施例1：连续易错PCR获得含突变碱基的酰基转移酶基因

采用连续易错PCR在体外对酰基转移酶基因进行突变。具体为：

1.易错PCR的引物为：

上游引物ASM19Forward序列：GCCATATGACCCCCGGTCCCGTCCTCCCT；

下游引物ASM19Reverse序列：CGTCTAGATCACCCCGCCGGGTCCGGGGCG。

2.PCR体系：模板DNA 2ul、10×PCR缓冲液5ul、Taq DNA聚合酶1ul、dATP 1～4ul、dTTP 1～4ul、dGTP 1～4ul、dCTP 1～4ul、上游引物2ul、下游引物2ul、25mM MgSO₄>2>

3.PCR条件：预变性95℃8分钟，变性95℃20秒，退火50～65℃20秒，延伸72℃2分钟，循环30次，终延伸8分钟。

第1次PCR模板DNA来源于出发菌株珍贵束丝放线菌X47，第2次PCR及后续PCR的模板DNA采用上次PCR产物。

PCR产物直接送测序，结果显示：当PCR体系中dATP 3ul、dTTP 3ul、dGTP 1ul、dCTP 1ul、上游引物2ul、下游引物2ul、25mM MgSO₄>2>

实施例2：珍贵束丝放线菌酰基转移酶突变体库的构建

将实施例1中的PCR产物用NdeI和XbaI进行双酶切，凝胶琼脂糖电泳分离后回收酶切产物，并连接到穿梭载体pHLY12(pHLY12为现有技术中的常规质粒)，转化大肠杆菌DH5a，挑取转化子提取质粒进行鉴定。

采用接合转移技术将重组pHLY12转入珍贵束丝放线菌X47的酰基转移酶基因缺失菌株(该基因缺失菌株为以菌株X47为出发菌株通过常规基因敲除技术得到)，挑取160株接合子构建酰基转移酶基因的突变体库。然后将160株接合子分别转接到ISP2固体平板上25℃培养14天，保存孢子并分别编号X4701～X47160，进行突变株的摇瓶发酵筛选。

ISP2培养基为常规的市售产品。

实施例3：突变株的摇瓶发酵筛选

将实施例2选出的160株突变株的孢子分别稀释至10⁷个/ml，按5％(V/V)接种于液体培养基中，摇瓶发酵(每250ml三角瓶装50ml液体培养基)，25℃、200rpm振荡培养8天，3000rpm离心10min收集菌体，用3倍体积的乙酸乙酯进行萃取，然后用HPLC法检测安丝菌素AP-3的发酵水平。结果显示14株突变株发酵液中安丝菌素AP-3含量显著高于出发菌株，正突变率达到8.75％，结果如表1。最终获得一株在摇瓶发酵条件下安丝菌素AP-3产量比出发菌株X47高2.4倍的突变菌株，将此突变株命名为X4732。

液体培养基的组成为：液体培养基的组成为：糊精50g/L，玉米浆10g/L，蛋白胨2g/L，无水氯化钙10g/L，碳酸钙5g/L、pH 7.5、0.15MPa灭菌30min。

其中，玉米浆、蛋白胨和糊精均为常规的市售产品。

表1正突变株摇瓶发酵的安丝菌素AP-3产量结果(mg/L发酵液)

实施例4：高产菌株X4732的遗传稳定性考察

将高产菌株X4732的孢子悬液稀释涂布在ISP4固体培养基上25℃培养14天，分离株X4732的单孢菌落并进行扩大培养，连续分离单孢五次，并用摇瓶发酵验证每代X4732孢子的安丝菌素AP-3发酵水平，结果见表2，结果表明高产菌株X4732具有较好的遗传稳定性，满足工业生产的需求。

表2 X4732不同传代次数的安丝菌素AP-3发酵水平(mg/L发酵液)

传代次数重复1重复2重复3平均值起始890.4902.3872.4888.4第一代873.9913.1884.2890.4第二代912.3884.6881.7892.9第三代876.1906.8902.4895.1第四代887.3894.6897.1893.0第五代865.4904.6891.2887.1

实施例5：酰基转移酶突变体的DNA序列测定

提取工程菌X4732的基因组DNA作为模板，ASM19Forward和ASM19Reverse引物进行高保真PCR扩增，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离并回收，与pCR-Blunt载体连接转化大肠杆菌DH5a，挑取阳性克隆进行DNA测序。X4732中酰基转移酶基因序列如序列表中SEQ ID NO.2所示，X47中酰基转移酶基因序列如序列表中SEQ ID NO.5所示。结果显示，X4732中酰基转移酶基因与野生型基因相比有6个碱基发生改变，分别为第108位由C变为T，第548位由T变为C，第563位由C变为G，第574位由G变为A，第728位由T变为C，第1044位由G变为A。第548、563、574和728位碱基突变引起4个氨基酸变化，分别是V183A，P188R、G192R和V243A。X4732中酰基转移酶的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示，X47中酰基转移酶的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.6所示。

珍贵束丝放线菌X4732于2018年2月5日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(简称GDMCC，地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所)，保藏编号为GDMCC NO.60327。

实施例6：发酵培养高产菌株X4732生产安丝菌素AP-3

1.种子液培养：

将菌株X4732的孢子接种到液体种子摇瓶，25℃200rpm振荡培养2天，然后接种到50L种子罐，25℃培养2天获得种子液；同时以出发菌株X47作为对照。

2.发酵培养：

将种子液按5％(体积分数)接种量接种到1m³发酵罐，通气量1.3VVM，搅拌转速250rpm，25℃发酵培养8天，放罐后检测安丝菌素AP-3的发酵水平。

种子培养的液体培养基的组成为：葡萄糖20g/L，可溶性淀粉30g/L，黄豆饼粉10g/L，玉米浆10g/L，蛋白胨5g/L，氯化钠3g/L，碳酸钙5g/L、pH 7.5、0.15MPa灭菌30min。发酵培养的液体培养基的组成为：糊精50g/L，玉米浆10g/L，蛋白胨2g/L，无水氯化钙10g/L，碳酸钙5g/L、pH 7.5、0.15MPa灭菌30min。

其中，黄豆饼粉、玉米浆、蛋白胨和糊精均为常规的市售产品。

3.安丝菌素AP-3含量测定：

采用HPLC法测定发酵液中安丝菌素AP-3的含量，结果为：菌株X4732发酵液中安丝菌素AP-3含量为977mg/L，菌株X47发酵液中安丝菌素AP-3含量为362mg/L，菌株X4732发酵液的安丝菌素AP-3发酵水平比出发菌株X47提高2.7倍(见图2)。

最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然结合对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东省医药生物技术研究中心（山东省病毒研究所）

<120> 一株高底物专一性酰基转移酶的珍贵束丝放线菌及其应用

<130> 2010

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 378

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 1

Met Thr Pro Gly Pro Val Leu Pro Pro Arg Leu Pro Ser Leu Thr Gly

1 5 1015

Ile Arg Ala Pro Leu Ala Leu Leu Val Phe Val Ala His Ala Leu Gly

202530

Ser Ala Arg Phe Phe Ala Asp Glu Ser Val Asn Ser Leu Gly Phe Leu

354045

Leu Pro Tyr Gly Pro Ala Ala Leu Ser Leu Phe Phe Val Leu Ser Gly

505560

Phe Val Leu Val Trp Ser Glu Pro Trp Arg Glu Gly Val Gly Pro Tyr

65707580

Phe Arg Arg Arg Val Val Arg Ile Leu Pro Thr His Val Leu Thr Trp

859095

Ala Ala Val Leu Leu Leu Leu Ala Ala Leu Gly Pro Leu Pro Leu Leu

100 105 110

Gly Pro Leu Pro Glu Val Gly Pro Ala Leu Val Asn Leu Ser Leu Leu

115 120 125

Gln Ser Leu Val Pro Leu Pro Asp Tyr Leu Leu Ser Val Asn Gly Ile

130 135 140

Asn Trp Ser Val Ser Cys Glu Val Val Phe Tyr Leu Leu Leu Pro Leu

145 150 155 160

Leu Ser Arg Pro Leu Leu Arg Val Pro Asp His Arg Leu Trp Ala Cys

165 170 175

Phe Gly Val Leu Ala Ala Ala Val Leu Ala Leu Arg Gly Val Ile Arg

180 185 190

Ala Leu Val Asp Gly Pro Pro Trp Ala Leu Trp Pro Pro Leu Ser Phe

195 200 205

Glu Gln Ala Trp Leu Val Asn Phe Phe Pro Leu Thr Arg Leu Pro Glu

210 215 220

Phe Leu Met Gly Val Val Leu Ala Arg Ile Val Ala Thr Gly Arg Trp

225 230 235 240

Arg Pro Ala Arg Ala Trp Trp Pro Leu Leu Gly Val Ala Ala Val Trp

245 250 255

Ala Leu Leu Pro Val Leu Pro Gln Val Tyr Ala Arg Ser Ala Ile Ala

260 265 270

Ala Val Pro Leu Ala Leu Leu Val Pro Val Ile Ala Val Arg Asp Leu

275 280 285

Glu Gly Arg Arg Ser Val Leu Ser Arg Arg Trp Val Arg Val Ala Gly

290 295 300

Asp Met Ser Tyr Ala Thr Tyr Leu Leu His Trp Pro Leu Leu Ala Val

305 310 315 320

Ala Lys His Val Ala Gly Asp Arg Leu Leu Gly Leu Gly Glu Gly Leu

325 330 335

Leu Leu Val Ala Ala Leu Tyr Ala Leu Thr Gln Gly Leu Ser Leu Leu

340 345 350

Leu His Arg Trp Val Glu Arg Pro Leu Leu Arg Arg Ala His Arg Pro

355 360 365

Arg Arg Ser Pro Ala Pro Asp Pro Ala Gly

370 375

<210> 2

<211> 1137

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

atgacccccg gtcccgtcct ccctcctcgg cttccctccc tcaccggcat ccgcgcgccg 60

ctggccctgc tcgtgttcgt ggcccacgcg ctcggctccg cccggttttt cgccgacgaa 120

tcggtcaact cgctcgggtt cctcctgccc tacgggcccg cggcgctgtc gttgttcttc 180

gtgctcagcg ggttcgtgct ggtgtggtcg gagccgtggc gcgagggcgt gggcccctac 240

ttccgacgcc gggtcgtgcg catcctgccc acccacgtgc tgacgtgggc cgcggtgctg 300

ctgctcctgg cggcgctcgg cccgctgccg ctgctggggc cgctgcccga ggtggggccc 360

gcgctggtca acctgtcgct gctccagtcg ctcgtgccgc tgcccgacta cctgctgtcg 420

gtcaacggca tcaactggtc ggtgtcctgc gaggtggtgt tctacctgct gctgccgctg 480

ctgtcccggc cgctgctgcg ggtgcccgac caccggttgt gggcgtgctt cggcgtgctc 540

gccgcggcgg tgctcgcgct gcggggcgtg atcagggcgc tggtggacgg gccgccgtgg 600

gcgctgtggc cgccgctgtc gttcgagcag gcgtggctgg tgaacttctt cccgctgacc 660

cggttgccgg agttcctgat gggcgtggtg ctcgccagga tcgtggccac cgggcggtgg 720

cggccggcgc gggcgtggtg gccgctgctg ggggtggcgg cggtgtgggc gctgctgccg 780

gtgctgccgc aggtgtacgc gcgcagcgcg atcgcggcgg tcccgctggc gctgctcgtc 840

cccgtcatcg ccgtgcggga cctggagggg cggcggtccg tgctgtcccg gcggtgggtg 900

cgggtcgcgg gggacatgag ctacgcgacc tacctgctgc actggccgct gctcgcggtc 960

gccaagcacg tggcggggga ccggctgctc gggctggggg aggggctgct gctggtggcg 1020

gcgctgtacg cgctcaccca gggactcagc ctgctgctgc accggtgggt ggagcgtccg 1080

ctgctgcggc gcgcccaccg gccgaggcgg tcgcccgccc cggacccggc ggggtga1137

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

gccatatgac ccccggtccc gtcctccct 29

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

cgtctagatc accccgccgg gtccggggcg30

<210> 5

<211> 1137

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

atgacccccg gtcccgtcct ccctcctcgg cttccctccc tcaccggcat ccgcgcgccg 60

ctggccctgc tcgtgttcgt ggcccacgcg ctcggctccg cccggttctt cgccgacgaa 120

tcggtcaact cgctcgggtt cctcctgccc tacgggcccg cggcgctgtc gttgttcttc 180

gtgctcagcg ggttcgtgct ggtgtggtcg gagccgtggc gcgagggcgt gggcccctac 240

ttccgacgcc gggtcgtgcg catcctgccc acccacgtgc tgacgtgggc cgcggtgctg 300

ctgctcctgg cggcgctcgg cccgctgccg ctgctggggc cgctgcccga ggtggggccc 360

gcgctggtca acctgtcgct gctccagtcg ctcgtgccgc tgcccgacta cctgctgtcg 420

gtcaacggca tcaactggtc ggtgtcctgc gaggtggtgt tctacctgct gctgccgctg 480

ctgtcccggc cgctgctgcg ggtgcccgac caccggttgt gggcgtgctt cggcgtgctc 540

gccgcggtgg tgctcgcgct gccgggcgtg atcggggcgc tggtggacgg gccgccgtgg 600

gcgctgtggc cgccgctgtc gttcgagcag gcgtggctgg tgaacttctt cccgctgacc 660

cggttgccgg agttcctgat gggcgtggtg ctcgccagga tcgtggccac cgggcggtgg 720

cggccggtgc gggcgtggtg gccgctgctg ggggtggcgg cggtgtgggc gctgctgccg 780

gtgctgccgc aggtgtacgc gcgcagcgcg atcgcggcgg tcccgctggc gctgctcgtc 840

cccgtcatcg ccgtgcggga cctggagggg cggcggtccg tgctgtcccg gcggtgggtg 900

cgggtcgcgg gggacatgag ctacgcgacc tacctgctgc actggccgct gctcgcggtc 960

gccaagcacg tggcggggga ccggctgctc gggctggggg aggggctgct gctggtggcg 1020

gcgctgtacg cgctcaccca ggggctcagc ctgctgctgc accggtgggt ggagcgtccg 1080

ctgctgcggc gcgcccaccg gccgaggcgg tcgcccgccc cggacccggc ggggtga1137

<210> 6

<211> 378

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 6

Met Thr Pro Gly Pro Val Leu Pro Pro Arg Leu Pro Ser Leu Thr Gly

1 5 1015

Ile Arg Ala Pro Leu Ala Leu Leu Val Phe Val Ala His Ala Leu Gly

202530

Ser Ala Arg Phe Phe Ala Asp Glu Ser Val Asn Ser Leu Gly Phe Leu

354045

Leu Pro Tyr Gly Pro Ala Ala Leu Ser Leu Phe Phe Val Leu Ser Gly

505560

Phe Val Leu Val Trp Ser Glu Pro Trp Arg Glu Gly Val Gly Pro Tyr

65707580

Phe Arg Arg Arg Val Val Arg Ile Leu Pro Thr His Val Leu Thr Trp

859095

Ala Ala Val Leu Leu Leu Leu Ala Ala Leu Gly Pro Leu Pro Leu Leu

100 105 110

Gly Pro Leu Pro Glu Val Gly Pro Ala Leu Val Asn Leu Ser Leu Leu

115 120 125

Gln Ser Leu Val Pro Leu Pro Asp Tyr Leu Leu Ser Val Asn Gly Ile

130 135 140

Asn Trp Ser Val Ser Cys Glu Val Val Phe Tyr Leu Leu Leu Pro Leu

145 150 155 160

Leu Ser Arg Pro Leu Leu Arg Val Pro Asp His Arg Leu Trp Ala Cys

165 170 175

Phe Gly Val Leu Ala Ala Val Val Leu Ala Leu Pro Gly Val Ile Gly

180 185 190

Ala Leu Val Asp Gly Pro Pro Trp Ala Leu Trp Pro Pro Leu Ser Phe

195 200 205

Glu Gln Ala Trp Leu Val Asn Phe Phe Pro Leu Thr Arg Leu Pro Glu

210 215 220

Phe Leu Met Gly Val Val Leu Ala Arg Ile Val Ala Thr Gly Arg Trp

225 230 235 240

Arg Pro Val Arg Ala Trp Trp Pro Leu Leu Gly Val Ala Ala Val Trp

245 250 255

Ala Leu Leu Pro Val Leu Pro Gln Val Tyr Ala Arg Ser Ala Ile Ala

260 265 270

Ala Val Pro Leu Ala Leu Leu Val Pro Val Ile Ala Val Arg Asp Leu

275 280 285

Glu Gly Arg Arg Ser Val Leu Ser Arg Arg Trp Val Arg Val Ala Gly

290 295 300

Asp Met Ser Tyr Ala Thr Tyr Leu Leu His Trp Pro Leu Leu Ala Val

305 310 315 320

Ala Lys His Val Ala Gly Asp Arg Leu Leu Gly Leu Gly Glu Gly Leu

325 330 335

Leu Leu Val Ala Ala Leu Tyr Ala Leu Thr Gln Gly Leu Ser Leu Leu

340 345 350

Leu His Arg Trp Val Glu Arg Pro Leu Leu Arg Arg Ala His Arg Pro

355 360 365

Arg Arg Ser Pro Ala Pro Asp Pro Ala Gly

370 375