一种近红外氧杂蒽类荧光染料在血吸虫成虫荧光标记中的应用

摘要

本发明提供了一种近红外氧杂蒽类荧光染料在血吸虫成虫荧光标记中的应用，所述近红外氧杂蒽类荧光染料具有式I所示结构。在本发明中，所述具有式I所示结构的近红外氧杂蒽类荧光染料(NIR‑RB)，其发射峰位于近红外区域，在活体荧光成像中具有良好的光穿透性能。采用本发明提供的NIR‑RB能够对血吸虫成虫进行荧光标记成像；同时，对血吸虫成虫荧光强度进行了定量分析，虫体区域和背景区域的荧光信号信噪比S/N>10，表明NIR‑RB用于血吸虫成虫的荧光成像具有高信噪比。

说明书

技术领域

本发明涉及生物光学标记技术领域，尤其涉及一种近红外氧杂蒽类荧光染料在血吸虫成虫荧光标记中的应用。

背景技术

血吸虫病是一种盛行于热带和亚热带地区、对人民身体健康有严重危害并影响社会经济发展的传染病，被世界卫生组织(WHO)列为极易复现的再现传染病。血吸虫病流行于74个国家和地区，全世界目前约有6.52亿人口受威胁，有1.93亿感染者，有症状病例约1.2亿，其中2000万为严重病例，中国是血吸虫病的主要流行区。

荧光成像能够用于血吸虫研究方面，Andrea等(Schistosoma mansoni:Use of afluorescent indicator to detect nitric oxide and related species in livingparasites.Andrea B.Kohn Jeanne M.Lea Leonid L.Moroz and RobertM.Greenberg.Experimental Parasitology.2006,113,130-133)采用荧光探针检测血吸虫体内一氧化氮的含量，研究结果发现虫体一氧化氮的释放依赖于一氧化氮合酶。SATO等(Functional visualization of the excretory system of adult Schistosomamansoni by the fluorescent marker resorufin.H.SATO,J.R.KUSEL,J.THORNHILL.Parasitology.2002,125,527-535)应用荧光成像的方法观察曼氏血吸虫成虫的排泄系统，其研究结果将有助于了解曼氏血吸虫原肾系的生理功能。

但是，上述研究中均使用传统有机荧光染料，如试卤灵，作为荧光探针对血吸虫成虫进行研究，存在以下缺点：(1)短波长激发与发射存在生物自发背景荧光干扰；(2)大部分的荧光探针光稳定性差，导致不能长时间荧光观察；(3)大部分有机小分子荧光染料亲水性差，限制了其生物应用。同时，血吸虫成虫结构具有以下特征：(1)血吸虫成虫寄生于哺乳动物血管中，体表与宿主血液直接接触，为了逃避宿主的免疫性攻击，体被覆盖了一种与宿主红细胞ab抗原相同的特异性糖类，成虫体表呈现较强的亲水性；(2)血吸虫成虫个体较大，对荧光的穿透性要求较高。由此可知，现有技术中的荧光染料和血吸虫成虫的生理结构特征之间是存在相互矛盾的，从而导致了血吸虫成虫荧光成像过程中荧光染色效果差、背景荧光干扰大和荧光穿透性差等问题。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种近红外氧杂蒽类荧光染料在血吸虫成虫荧光标记中的应用，将本发明提供的近红外氧杂蒽类荧光染料用于血吸虫成虫荧光标记中，荧光染色效果好、背景荧光干扰小且荧光穿透性好。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种近红外氧杂蒽类荧光染料在血吸虫成虫荧光标记中的应用，所述近红外氧杂蒽类荧光染料具有式I所示结构：

优选地，所述应用包括以下步骤：

(1)将具有式I所示结构的近红外氧杂蒽类荧光染料、二甲基亚砜和磷酸缓冲液混合，得到荧光染料溶液；

(2)向所述步骤(1)中荧光染料溶液中加入血吸虫成虫，在15～35℃下孵育5min～6h，得到标记血吸虫成虫；

(3)在激发波长为635nm的条件下，将所述步骤(2)中标记血吸虫成虫的荧光标记情况进行检测，采集650～750nm的荧光信号进行荧光成像。

优选地，所述磷酸缓冲液的pH值为7.0～7.4。

优选地，所述荧光染料溶液的浓度为4～6μmol。

优选地，所述步骤(1)具体为：

将具有式I所示结构的近红外氧杂蒽类荧光染料与二甲基亚砜混合，得到母液；

将所述母液与磷酸缓冲液混合，得到荧光染料溶液。

优选地，所述母液的浓度为0.9～1.1mmol。

优选地，所述步骤(2)中血吸虫成虫的获取方法，包括以下步骤：

将感染血吸虫毛蚴的阳性钉螺放入清水中，在白炽灯下光照1.5～2.5h，逸出血吸虫尾蚴；

将六周龄雌性小鼠剪去腹部体毛，用水湿润所述小鼠的腹部皮肤，将含有45～55条所述血吸虫尾蚴的盖玻片贴于所述小鼠的腹部皮肤上，保持15～25min，使所述血吸虫尾蚴穿透所述小鼠的腹部皮肤进行感染，得到感染小鼠；

将所述感染小鼠饲养6～7周后，采取灌注法于所述感染小鼠的肝门-肠系膜静脉中收集血吸虫，将所述血吸虫在生理盐水中漂洗后在RPMI-1640细胞培养液中培养1.5～2.5h，得到血吸虫成虫。

本发明提供了一种近红外氧杂蒽类荧光染料在血吸虫成虫荧光标记中的应用，所述近红外氧杂蒽类荧光染料具有式I所示结构。在本发明中，所述近红外氧杂蒽类荧光染料(NIR-RB)具有氧杂蒽母体，其发射峰位于近红外区域，在活体荧光成像中具有良好的光穿透性能。采用本发明提供的NIR-RB能够对血吸虫成虫进行荧光标记成像；同时，对血吸虫成虫荧光强度进行了定量分析，虫体区域和背景区域的荧光信号信噪比S/N>10，表明NIR-RB用于血吸虫成虫的荧光成像具有高信噪比。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1为实施例1中制备所述具有式I所示结构的近红外氧杂蒽类荧光染料的流程图；

图2为实施例2中NIR-RB稀释液的紫外吸收光谱图和荧光光谱图；

图3为实施例3中人类宫颈癌细胞的荧光成像图；

图4为实施例4中血吸虫成虫的荧光成像图；

图5为实施例4中血吸虫成虫的荧光成像信噪比值。

具体实施方式

本发明提供了一种近红外氧杂蒽类荧光染料在血吸虫成虫荧光标记中的应用，所述近红外氧杂蒽类荧光染料具有式I所示结构：

在本发明中，所述具有式I所示结构的近红外氧杂蒽类荧光染料(NIR-RB)。在本发明中，所述NIR-RB具有氧杂蒽母体，化学结构稳定、光谱易调节、发光效率高、可修饰位点多，特别是所述近红外氧杂蒽类荧光染料的发射峰位于近红外区域，在活体荧光成像中具有良好的光穿透性能。

本发明对于所述具有式I所示结构的近红外氧杂蒽类荧光染料的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的方法制备得到即可。在本发明的实施例中，具体是按照图1所示流程制备所述具有式I所示结构的近红外氧杂蒽类荧光染料，包括以下步骤：

将2-甲基苯并噁唑5.33g(40mmol)与20mL甲苯混合，然后加入碘乙烷6.86g(44mmol)，在120℃下反应24h；冷却至室温，减压抽滤得到粗提物，用甲苯(10mL×3)洗涤三次，得到化合物2；

将化合物22.89g(1mmol)和N,N-二苯基甲脒1.93g(1mmol)混合，在140℃下进行固相熔融反应0.5h；以二氯甲烷和甲醇的混合溶剂为洗脱剂(所述洗脱剂中二氯甲烷和甲醇的体积比为20:1)对所得粗产物进行柱层析分离，得到化合物3；

将环己酮6.6mL(64mmol)滴加到80mL浓硫酸(质量浓度为95～98％)中，用冰水浴冷却到0℃；剧烈搅拌下分批加入2-(4-(二乙基胺)-2-羟基苯甲酰基)苯甲酸(32mmol，所述-(4-(二乙基胺)-2-羟基苯甲酰基)苯甲酸分10批加入，每批之间间隔1min)，在90℃下反应2h；冷却至室温，将所得反应液倒入装有250g冰的烧杯中搅拌，将7mL质量浓度为70％的高氯酸逐滴加入到烧杯中，析出大量红色固体；减压抽滤除去水，所得固体用300mL冷水洗涤，经冷冻干燥后得到化合物4；

将化合3(1mmol，0.39g)和化合物4(1.05mmol，0.47g)溶解在乙酸酐中(8mL)，在60℃下反应1h；加入100mL水终止反应，析出褐色固体，减压抽滤除去水，经冷冻干燥后，以二氯甲烷和乙醇的混合溶剂为洗脱剂(所述洗脱剂中二氯甲烷和乙醇的体积比为200：1～25：3)对所得粗产物进行柱层析分离，得到具有式I所示结构的近红外氧杂蒽类荧光染料(NIR-RB)。

在本发明中，所述应用优选包括以下步骤：

(1)将具有式I所示结构的近红外氧杂蒽类荧光染料、二甲基亚砜和磷酸缓冲液混合，得到荧光染料溶液；

(2)向所述步骤(1)中荧光染料溶液中加入血吸虫成虫，在15～35℃下孵育5min～6h，得到标记血吸虫成虫；

(3)在激发波长为635nm的条件下，将所述步骤(2)中标记血吸虫成虫的荧光标记情况进行检测，采集650～750nm的荧光信号进行荧光成像。

本发明将具有式I所示结构的近红外氧杂蒽类荧光染料、二甲基亚砜和磷酸缓冲液混合，得到荧光染料溶液。在本发明中，所述磷酸缓冲液的pH值优选为7.0～7.4。本发明对于所述磷酸缓冲液的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的方法配制得到即可。在本发明中，所述荧光染料溶液的浓度优选为4～6μmol，更优选为5μmol。

在本发明中，所述荧光染料溶液的配制方法优选包括以下步骤：

将具有式I所示结构的近红外氧杂蒽类荧光染料与二甲基亚砜混合，得到母液；

将所述母液与磷酸缓冲液混合，得到荧光染料溶液。

在本发明中，所述母液的浓度优选为0.9～1.1mmol，更优选为1mmol。在本发明中，所述磷酸缓冲液起到稀释母液的作用。

得到荧光染料溶液后，本发明向所述荧光染料溶液中加入血吸虫成虫，在15～35℃下孵育5min～6h，得到标记血吸虫成虫。在本发明中，所述血吸虫成虫的获取方法，优选包括以下步骤：

将感染血吸虫毛蚴的阳性钉螺放入清水中，在白炽灯下光照1.5～2.5h，逸出血吸虫尾蚴；

将六周龄雌性小鼠剪去腹部体毛，用水湿润所述小鼠的腹部皮肤，将含有45～55条所述血吸虫尾蚴的盖玻片贴于所述小鼠的腹部皮肤上，保持15～25min，使所述血吸虫尾蚴穿透所述小鼠的腹部皮肤进行感染，得到感染小鼠；

将所述感染小鼠饲养6～7周后，采取灌注法于所述感染小鼠的肝门-肠系膜静脉中收集血吸虫，将所述血吸虫在生理盐水中漂洗后在RPMI-1640细胞培养液中培养1.5～2.5h，得到血吸虫成虫。

本发明对于所述感染血吸虫毛蚴的阳性钉螺的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的感染血吸虫毛蚴的阳性钉螺即可。在本发明的实施例中，所述感染血吸虫毛蚴的阳性钉螺具体是由江苏省血吸虫病防治研究所提供。

本发明优选使所述饲养后的感染小鼠的颈部脱臼致死，依次剖开腹部皮肤和腹膜，然后采取灌注法于所述感染小鼠的肝门-肠系膜静脉中收集血吸虫。

本发明优选将培养后的血吸虫成虫进行镜检筛选，将活性良好的血吸虫成虫用于荧光成像。

在本发明中，孵育所述血吸虫的温度为15～35℃，优选为20～30℃；在本发明的实施例中，具体是在室温下进行所述孵育，即无需额外加热或降温。在本发明中，孵育所述血吸虫的时间为5min～6h，优选为0.5～4h，更优选为1～2h。

得到标记血吸虫成虫后，本发明在激发波长为635nm的条件下，将所述标记血吸虫成虫的荧光标记情况进行检测，采集650～750nm的荧光信号进行荧光成像。在本发明的实施例中，具体是采用OLYMPUS FV1000型激光共聚焦荧光显微镜将所述标记血吸虫成虫的荧光标记情况进行检测。

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

将2-甲基苯并噁唑5.33g(40mmol)与20mL甲苯混合，然后加入碘乙烷6.86g(44mmol)，在120℃下反应24h；冷却至室温，减压抽滤得到粗提物，用甲苯(10mL×3))洗涤三次，得到化合物2，产率为85％。¹H>10H₁₂NO⁺,162.0913,ESI-MS:m/z,162.1。

将化合物22.89g(1mmol)和N,N-二苯基甲脒1.93g(1mmol)混合，在140℃下进行固相熔融反应0.5h；以二氯甲烷和甲醇的混合溶剂为洗脱剂(所述洗脱剂中二氯甲烷和甲醇的体积比为20:1)对所得粗产物进行柱层析分离，得到化合物3，产率为65％。¹H>3)δ11.72(d,J＝14.0Hz,1H),8.64(dd,J＝14.1,12.1Hz,1H),7.61(d,J＝7.9Hz,1H),7.50–7.42(m,5H),7.34(t,J＝7.8Hz,2H),7.17(t,J＝7.3Hz,1H),7.09(d,J＝12.0Hz,1H),4.26–4.15(m,2H),1.53(t,J＝7.3Hz,3H).¹³C>3)δ163.23,149.17,146.62,138.39,130.08,129.74,126.67,126.20,125.98,117.49,111.64,111.02,40.38,13.25；Exact>17H₁₇N₂O⁺,265.1335.ESI-MS:m/z,265.2。

将环己酮6.6mL(64mmol)滴加到80mL浓硫酸(质量浓度为98％)中，用冰水浴冷却到0℃；剧烈搅拌下分批加入2-(4-(二乙基胺)-2-羟基苯甲酰基)苯甲酸(32mmol，所述-(4-(二乙基胺)-2-羟基苯甲酰基)苯甲酸分10批加入，每批之间间隔1min)，在90℃下反应2h；冷却至室温，将所得反应液倒入装有250g冰的烧杯中搅拌，将7mL质量浓度为70％的高氯酸逐滴加入到烧杯中，析出大量红色固体；减压抽滤除去水，所得固体用300mL冷水洗涤，经冷冻干燥后得到化合物4；

将化合3(1mmol，0.39g)和化合物4(1.05mmol，0.47g)溶解在乙酸酐中(8mL)，在60℃下反应1h；加入100mL水终止反应，析出褐色固体，减压抽滤除去水，经冷冻干燥后，以二氯甲烷和乙醇的混合溶剂为洗脱剂(所述洗脱剂中二氯甲烷和乙醇的体积比为200：1～25：3)对所得粗产物进行柱层析分离，得到具有式I所示结构的近红外氧杂蒽类荧光染料(NIR-RB)，产率约为50％。¹H>13C>35H₃₅N₂O₄⁺,547.2591.ESI-MS:m/z,547.2592。

实施例2

将具有式I所示结构的近红外氧杂蒽类荧光染料(NIR-RB)进行紫外吸收光谱和荧光光谱测试，具体如下：

将NIR-RB与乙醇混合，得到1mmol/L的NIR-RB乙醇母液，然后用乙醇稀释，得到10μmol/L的NIR-RB稀释液，将所述NIR-RB稀释液进行紫外吸收光谱和荧光光谱测试，其中，紫外吸收光谱测定的扫描范围为500～850nm；荧光光谱测定的激发波长620nm，发射光谱范围640～850nm。

图2为NIR-RB稀释液的紫外吸收光谱图和荧光光谱图，由图2可知，NIR-RB的发射峰位于650～850nm的近红外区域。

实施例3

对NIR-RB的细胞荧光成像情况进行检测，具体如下：

(1)试剂与材料

二甲基亚砜(AR)购于阿拉丁化学试剂有限公司，RPMI 1640培养液购于赛默飞世尔科技公司，人类宫颈癌细胞(HeLa)购于中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所。

(2)人类宫颈癌细胞荧光成像

将人类宫颈癌细胞培养于含10％胎儿牛血清的RPMI 1640培养液中，在37℃、5％CO₂和95％空气气氛中贴壁生长；在激发波长为635nm的条件下，采用OLYMPUS>

图3为人类宫颈癌细胞的荧光成像图，由图3可知，NIR-RB能够很好地对人类宫颈癌细胞进行荧光标记。

实施例4

采用NIR-RB对血吸虫成虫进行荧光标记成像，具体如下：

(1)试剂与材料

试剂：二甲基亚砜(AR)购于阿拉丁化学试剂有限公司，RPMI 1640培养液购于赛默飞世尔科技公司，磷酸缓冲液(PBS，pH＝7.4)自行配制，感染血吸虫毛蚴的阳性钉螺由江苏省血吸虫病防治研究所提供。

(2)获取血吸虫成虫

将感染血吸虫毛蚴的阳性钉螺放入清水中，在白炽灯下光照2h，逸出血吸虫尾蚴；

将六周龄雌性小鼠剪去腹部体毛，用水湿润所述小鼠的腹部皮肤，将含有50条所述血吸虫尾蚴的盖玻片贴于所述小鼠的腹部皮肤上，保持20min，使所述血吸虫尾蚴穿透所述小鼠的腹部皮肤进行感染，得到感染小鼠；

将所述感染小鼠饲养6周后，颈部脱臼致死，依次剖开腹部皮肤和腹膜，然后采取灌注法于所述感染小鼠的肝门-肠系膜静脉中收集血吸虫；将所述血吸虫在生理盐水中漂洗3次后在RPMI-1640细胞培养液中培养2h，镜检筛选活性良好的血吸虫成虫用于荧光成像。

(3)血吸虫成虫荧光标记成像方法

将NIR-RB与二甲基亚砜混合，得到浓度为1mmol的母液，采用磷酸缓冲液进行稀释，得到荧光染料溶液；

向200μL所述中荧光染料溶液中加入所述血吸虫成虫，在室温下孵育2h，得到标记血吸虫成虫；

在激发波长为635nm的条件下，采用OLYMPUS FV1000型激光共聚焦荧光显微镜将所述标记血吸虫成虫的荧光标记情况进行检测，采集650～750nm的荧光信号进行荧光成像。

(4)荧光标记结果

图4为血吸虫成虫的荧光成像图，由图4可知，NIR-RB能够对血吸虫成虫进行荧光标记成像。同时，我们对血吸虫成虫荧光强度进行了定量分析，结果如图5所示，图5中1-背景区域，2-虫体区域。由图5可知，虫体区域和背景区域的荧光信号信噪比S/N>10，表明NIR-RB用于血吸虫成虫的荧光成像具有高信噪比。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。