一种用于检测禽流感病毒H7亚型的免疫胶体金试纸条及其制备方法

摘要

本发明公开一种用于检测禽流感病毒H7亚型的免疫胶体金试纸条及其制备方法，属于动物疾病诊断技术领域。该试纸条由样品垫、喷有抗禽流感病毒H7亚型的单克隆抗体1H11(CCTCC NO：C2017112)胶体金标记的胶体金结合垫，在检测线、质控线分别包被有抗禽流感病毒H7亚型的单克隆抗体6B3(CCTCC NO：C2017204)及山羊抗鼠IgG多克隆抗体的硝酸纤维素膜构成，依次按样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫粘附在PVC底板上。本发明中的检测禽流感病毒H7亚型的免疫胶体金试纸条，主要原理是双抗体夹心检测抗原，具有高度的灵敏性和特异性。与实验室常用的PCR、ELISA检测抗原技术相比，更简便、更快捷，不需要专门的人员和检测设备，可以广泛应用于基层。

说明书

技术领域

本发明属于动物疾病诊断技术领域，特别涉及一种检测禽流感病毒H7亚型的免疫胶体金试纸条及其制备方法。

背景技术

禽流感是由A型流感病毒(Avian influenza virus,AIV)引起的家禽和野生禽类感染的高度接触性传染病，具有传染性强、传播速度快、抗原易变异等特点。根据禽流感病毒的血凝素(hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(neuraminidase,NA)不同的抗原性，将目前已发现的15种特异的HA和9种特异的NA，分别命名为H1-H15，N1-N9，不同的HA和NA之间可形成100多种亚型的禽流感病毒。H7亚型AIV具有9个NA亚型，其中H7N3，H7N7，H7N1等对禽类具有高致病性。在过去的几十年间H7亚型禽流感在澳大利亚，英格兰，德国等国家都有出现。2003年，我国首次在鸡体内分离到H7N2病例，2013年，我国首次报道人感染H7N9亚型禽流感病毒死亡病例。2016-2017冬春交接之际我国出现了第五次H7亚型禽流感爆发高峰，这次疫情比以前更为严重，表现为发病时间早和发病率高，并且病毒出现了耐药性突变和毒力增加的现象。针对H7亚型禽流感疫情现状，2017年6月初农业部办公厅发布在两广地区先行开展H7N9免疫工作，为两广地区及全国高效开展禽流感防控工作提供了坚强的技术保障。鉴于禽流感的爆发给禽类养殖业和人类的健康带来了极大的挑战，建立一种快速直观的病原检测方法，早发现，早剔除，早免疫对养禽业的发展和公共卫生安全将会有极大的促进作用。

免疫胶体金技术(Immune colloidal gold technique)是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术。该技术是在McAb、ELISA等技术基础上发展起来的一种快速而简单的新型诊断技术。其原理以胶体金为示踪标记物，以微孔膜为固相载体，包被已知抗原或抗体，加入待检样品后，经微孔膜的渗透作用使样本中的抗原或抗体与膜上的抗原或抗体结合，再通过与胶体金标记物与之反应形成红色的可见结果。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术存在的问题，提供一种用于检测禽流感病毒H7亚型的免疫胶体金试纸条及其制备方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种用于检测禽流感病毒H7亚型的免疫胶体金试纸条，包括PVC底板，在PVC底板两端分别设有样品垫和吸水垫，所述样品垫提供了待测样品加入的位置；所述PVC底板中部设置有硝酸纤维素膜，所述硝酸纤维素膜与样品垫之间设置有胶体金结合垫，所述硝酸纤维素膜与吸水垫连接，所述胶体金结合垫是由吸附有胶体金标记的抗禽流感病毒H7亚型的单克隆抗体1H11的玻璃纤维素膜组成，所述硝酸纤维素膜上依次设置有包被有抗禽流感病毒H7亚型的单克隆抗体6B3的检测线和包被有山羊抗鼠IgG多克隆抗体的质控线，所述单克隆抗体1H11是由杂交瘤细胞株1H11所分泌的；其中所述单克隆抗体6B3是由杂交瘤细胞株6B3所分泌的，所述杂交瘤细胞株1H11、6B3保藏在武汉大学中国典型培养物保藏中心，其细胞保藏编号依次为：CCTCC NO：C2017112和C2017204，保藏日期分别为2017年7月18日及2017年10月17日。

本发明还提供了所述的一种用于检测禽流感病毒H7亚型的免疫胶体金试纸条的制备方法，具体步骤如下：

1)胶体金的制备；

2)用步骤1)中制备的胶体金标记单克隆抗体1H11，获得胶体金标记的单克隆抗体1H11；

3)胶体金结合垫的制备；

4)将单克隆抗体6B3和山羊抗鼠IgG多克隆抗体分别喷在硝酸纤维素膜检测线和质控线的位置上，烘干备用；

5)处理样品垫：将吸水纸浸泡在PB缓冲液中30min，37℃烘干后裁切成宽1.6cm条状备用；获得处理好的样品垫；上述缓冲液配方为Na₂HPO₄·12H₂O>2PO₄·2H₂O1.56g，注射用水定容至1000mL；将处理好的样品垫、喷有抗禽流感病毒H7亚型的单克隆抗体1H11-胶体金标记的胶体金结合垫、喷有抗禽流感病毒H7亚型的单克隆抗体6B3检测线和山羊抗鼠IgG多抗质控线的硝酸纤维素膜、吸水垫按顺序依次粘贴在硬质PVC底板上，然后裁切成1.6mm的条状备用。

进一步的，所述步骤1)的具体步骤为：向已硅化的瓶中加入100mL注射用水，再加入1ml氯金酸，中火加热至沸腾，一次性加入1.8mL的1.05％柠檬酸三钠溶液后继续加热至溶液颜色为稳定的酒红色，室温下自然冷却，最后用双蒸水定容至100mL，即为胶体金溶液。

进一步的，所述步骤2)的具体步骤为：将上述步骤1)所得的胶体金用0.2mol/L碳酸钾调节pH值到9.0，加入单克隆抗体1H11，每1mL胶体金溶液的单抗标记量为8.0ug，缓慢搅拌45min，得抗禽流感病毒H7亚型的单克隆抗体-胶体金标记物，在搅拌下加入0.5mL5％PEG20000溶液封闭30min。将标记好的胶体金溶液8000rpm离心30min后用10mM pH9.0Tris-HCl重悬。

进一步的，所述步骤3)的具体步骤为：

a)配制金垫处理液：10mM Tris-HCl，0.45％PVP-40，0.45％Tween-20，0.5％SDS-L+SDS-F，3％海藻糖，搅拌混匀后0.22uM滤器过滤；

b)将玻璃纤维素膜浸泡在步骤a)获得的处理液中30min，37℃烘干。将所述步骤2)制备的胶体金标记的抗禽流感病毒H7亚型的单克隆抗体1H11喷涂于处理过的胶体金结合垫上，喷量为10uL/cm，于37℃烘干。

进一步的，所述步骤4)的具体步骤为:

A.配制包被液：0.2M Tris-HCl，1％Tween-20，0.5％X-100，搅拌混匀后0.22uM滤器过滤；

B.将抗禽流感病毒H7亚型的单克隆抗体6B3和山羊抗鼠IgG多克隆抗体分别用所述包被液稀释后，喷涂于硝酸纤维素膜上作为检测线和质控线，其浓度分别为1mg/mL和0.5mg/mL，喷量为1uL/cm,，检测线和质控线的距离是5mm，于37℃烘干备用。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1)本发明得到的禽流感病毒H7亚型单克隆抗体1H11和6B3，经夹心ELISA验证具有良好的检测禽流感病毒H7亚型抗原的效果，该单抗的使用提高了检测结果的特异性和敏感性。

2)本发明从得到的分泌抗禽流感病毒H7亚型单克隆抗体的杂交瘤细胞中，筛选出两株生物特性较好的杂交瘤细胞1H11和6B3，用其制备的腹水纯化后对禽流感病毒H7亚型的血凝抑制HI效价分别达到18log₂、16log₂，ELISA效价高达4×10⁵、3×10⁵。

3)本发明适用于禽流感病毒H7亚型的快速检测，本试纸条灵敏度高，特异性强；

4)本试纸条不需要任何仪器设备，携带方便，检测成本低；

5)本试纸条操作方便，不需要专业人员操作，节省人力；

6)本试纸条保存方便，性质稳定，常温保存12个月和4℃保存的检测结果一致。

附图说明

图1为本发明的一种用于检测禽流感病毒H7亚型的免疫胶体金试纸条的结构示意图；

图2为本发明实施例5敏感性试验示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明中的附图，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：细胞株腹水对禽流感病毒H7亚型的血凝抑制检测

取8周龄以上的雌性BALB/c小鼠，腹腔注射灭菌石蜡0.5ml/只，7天后将本实验室获得的杂交瘤细胞株1H11和6B3扩大培养，收集生长良好的杂交瘤细胞株1000r/min离心10min，弃上清，将细胞沉淀重悬于无血清培养液中，并调整细胞密度，每只小鼠腹腔注射0.5mL细胞悬液(约5×10⁵个细胞/只)。7-10天后小鼠腹部明显膨大，收取腹水。采用间接ELISA方法和HI试验检测腹水效价，结果见表1。采用辛酸-硫酸铵两步沉淀法纯化腹水，4℃条件下10000rpm离心15min，取离心后的上清用为微孔滤膜过滤，去除凝块和脂肪滴。向腹水中加入4倍体积的醋酸钠缓冲液(pH4.5)，随后每毫升腹水加入20μL辛酸，边加边搅拌，30min后4℃10000rpm离心30min，取上清用氢氧化钠溶液调节其pH至7.4。边搅拌边加入小于40％腹水体积的饱和硫酸铵30min后4℃条件下10000rpm离心15min，弃上清。用1/2体积的10mM>

表1：两种腹水HI和ELISA效价检测结果

细胞株HI效价1H112¹⁸1：4096006B32¹⁶1：320000

实施例2：禽流感病毒H7亚型试纸条的制备

(1)胶体金的制备

向已硅化的锥形瓶中加入100mL注射用水，再加入1ml氯金酸，放于微波炉中，中火加热至沸腾，一次性加入1.8mL的1.05％柠檬酸三钠溶液后继续加热至溶液颜色为稳定的酒红色，室温下自然冷却，最后用双蒸水定容至100mL，即为胶体金溶液。

(2)胶体金标记的单克隆抗体1H11的制备

将上述步骤(1)所得的胶体金用0.2mol/L碳酸钾调节pH值到9.0，加入单克隆抗体1H11，每1mL胶体金溶液的单抗标记量为8.0ug，缓慢搅拌45min，得抗禽流感病毒H7亚型的单克隆抗体-胶体金标记物，在搅拌下加入0.5mL5％PEG20000溶液封闭30min。将标记好的胶体金溶液8000rpm离心30min后用10mM pH9.0Tris-HCl重悬。

(3)胶体金结合垫的制备

a)配制金垫处理液：10mM Tris-HCl，0.45％PVP-40，0.45％Tween-20，0.5％SDS-L+SDS-F，3％海藻糖，搅拌混匀后0.22uM滤器过滤；

b)将玻璃纤维素膜浸泡在步骤a)获得的处理液中30min，37℃鼓风干燥箱中烘干。将所述步骤(2)制备的胶体金标记的抗禽流感病毒H7亚型的单克隆抗体1H11喷涂于处理过的胶体金结合垫上，喷量为10uL/cm，于37℃鼓风干燥箱中烘干。

(4)喷涂检测线和质控线

1.配制包被液：0.2M Tris-HCl，1％Tween-20，0.5％X-100，搅拌混匀后0.22uM滤器过滤；

2.将抗禽流感病毒H7亚型的单克隆抗体6B3和山羊抗鼠IgG多克隆抗体分别用所述包被液稀释后，喷涂于硝酸纤维素膜上作为检测线和质控线，其浓度分别为1mg/mL和0.5mg/mL，喷量为1uL/cm,，检测线和质控线的距离是5mm，于37℃鼓风干燥箱中烘干备用。

(5)样品垫的处理

将吸水纸浸泡在PB缓冲液中30min，37℃鼓风干燥箱中烘干后裁切成宽1.6cm条状备用；获得处理好的样品垫；上述缓冲液配方为Na₂HPO₄·12H₂O>2PO₄·2H₂O1.56g，注射用水定容至1000mL。

(6)试纸条的组装

将处理好的样品垫、喷有抗禽流感病毒H7亚型的单克隆抗体1H11-胶体金标记的胶体金结合垫、喷有抗禽流感病毒H7亚型的单克隆抗体6B3检测线和山羊抗鼠IgG多抗质控线的硝酸纤维素膜、吸水垫按顺序依次粘贴在硬质PVC底板上，然后裁切成1.6mm的条状备用。

实施例3：H7亚型禽流感试纸条的应用

1)分泌物拭子样本的采集：将沾有分泌物的棉签拭子放入500μLPBS(含2000单位/mL青霉素、链霉素)中4℃过夜后，10000r/min离心5min，取上清(若需长时间保存可往PBS中加入25％的甘油)。

2)检测：将样品用生理盐水作1:10稀释后取40μL滴在本发明的试纸条上，静置15min后观察结果。同时分别取40μL生理盐水和1：50稀释的阳性抗原滴在试纸条上做阴、阳性对照。其中阳性对照为购自哈尔滨维科生物技术开发公司的禽流感病毒H7亚型血凝抑制试验抗原。

3)结果判定：阳性结果，质控线、检测线均呈现红色条带，说明有禽流感病毒H7亚型的存在。阴性结果：检测结果不出现红色条带，质控线呈现红色条带，说明样本中没有禽流感病毒H7亚型存在。如果检测线和质控线均不出现红色条带或者仅有检测线出现红色条带，则说明产品失效。

实施例4：禽流感病毒H7亚型试纸条的特异性试验

将临床采集到的新城疫病毒阳性样本、腺病毒阳性样本、法氏囊病毒阳性样本、传染性支气管炎病毒阳性样本、生理盐水，购自哈尔滨维科生物技术开发公司的禽流感病毒H5、H7和H9血凝抑制试验抗原分别点膜，进行检测。只有滴加禽流感病毒H7亚型抗原的试纸条质控线和检测线同时呈现红色条带，其它试纸条仅出现红色质控线，说明本发明的试纸条具有良好的特异性。

实施例5：禽流感病毒H7亚型试纸条的敏感性试验

将购自哈尔滨维科生物技术开发公司的血凝抑制价HA在2⁹的抗原，用生理盐水从1:2倍比稀释后，每个试纸条滴加40μL的病毒液，结果显示将抗原稀释至128倍时仍能检测为阳性，说明本发明的试纸条具有良好的敏感性。

稀释度1：21：41：81：161：321：641：1281：256结果+++++++-

实施例6：禽流感病毒H7亚型试纸条的稳定性试验

将本发明的3批试纸条分别放置在37℃恒温培养箱、常温、4℃，每隔1个月取出同时检测10份禽流感病毒H7亚型阳性样本和10份禽流感病毒H7亚型阴性样本。结果显示：在37℃作用10天对本发明的试纸条无破坏作用，证明该试纸条在高温下较为稳定。在室温和4℃放置6个月检测结果仍稳定。

第一个月检测结果：

第三个月检测结果

第六个月检测结果

实施例7：禽流感病毒H7亚型试纸条与HA试验的对比

用禽流感病毒H7亚型抗原检测试纸条和HA试验两种方法同时检测60份鸡的泄殖腔拭子，其中30份为华中农业大学农业微生物学国家重点实验室P3级实验室保存，30份为临床采集的泄殖腔拭子。对比试验结果，计算符合率。阳性符合率为100％，阴性符合率为96.67％，总符合率为98.33％，说明该试纸条与HA试验符合率良好，适合在基层大规模检测中推广应用。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。