一株枯草芽孢杆菌及其在防治牡丹红斑病中的应用

摘要

本发明公开了一株枯草芽孢杆菌及其在防治牡丹红斑病中的应用。该菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株HZ08‑3，是从菏泽湿地河泥中分离获得的，已于2017年9月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.14679。试验结果表明：枯草芽孢杆菌菌株HZ08‑3生物防治制剂防治牡丹红斑病效果显著，防治效果达到75.95％，且牡丹长势良好，无药害产生。

说明书

技术领域

本发明属于植物病害生物防治技术领域。具体而言，本发明涉及一株枯草芽孢杆菌及其在防治牡丹红斑病中的应用，以及采用该芽孢杆菌制备的生物防治制剂。

背景技术

牡丹为我国传统名花，也是世界著名的花卉之一，自古以来被国人誉为花王、国花等，被世界各国誉为中国花。近年来，随着牡丹栽培面积的迅速扩展、品种增多，牡丹病害的发生危害呈上升趋势，其中牡丹红斑病(Cladosporium paeoniae Pass.)是危害牡丹最严重的病害之一,该病也危害芍药。牡丹红斑病由牡丹枝孢霉(Cladosporium paeoniaePass.)引起，主要危害牡丹的叶和绿色茎，叶片正面及茎上的病斑长期保持暗紫红色是该病的主要症状特点，6月中旬至7月下旬为该病发病盛期。病原菌侵染牡丹后，造成牡丹花色衰退、生长受损和丹皮量少质差，造成花农经济损失惨重，病害的爆发和流行严重制约了我国牡丹产业化的发展。

目前生产上常采用化学药剂防治牡丹红斑病。化学防治极易造成农药残留，污染环境，并且化学农药的长期使用，使得病原菌对其产生抗药性，导致防治效果下降甚至失败。

生物防治是利用物种间的拮抗作用来减少病害的发生，对人畜安全、环境兼容性好且病原菌不易产生抗药性，因而具有化学杀菌剂不具有的优势，正逐步成为代替化学杀菌剂的最佳方式。而获得高效拮抗菌是生物防治的基础。枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)是最早被报道用来防治植物病害的菌种。

芽孢杆菌是一类好氧或兼性厌氧的产芽孢革兰氏阳性杆菌的总称，其生理特征丰富多样，在自然界中广泛存在，是土壤和植物体表根际的重要微生物种群，对人畜无毒无害，不污染环境，能产生多种抗菌素和酶，具有广谱抗菌活性。芽孢杆菌突出的特征是能产生内生耐热以及对紫外线、电磁辐射及一些化学药品有很强的抗逆性的芽孢，这有利于生防菌剂的生产和剂型加工，也利于其在环境中的存活、定殖与繁殖。由于芽孢杆菌生长速度快、营养需求简单、能够形成抗逆性较强的芽孢，在产品开发中较非芽孢杆菌具有有效活菌数量高、性能稳定等优势而备受瞩目。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于高效防治牡丹红斑病的新的微生物——枯草芽孢杆菌菌株HZ08-3。本发明的枯草芽孢杆菌菌株具有生长速度快、产量大、抗逆性强，在植物(尤其是牡丹)表面能够快速大量定殖等特点，因此具有良好的应用前景。

本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：本发明所提供的菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株HZ08-3，是从菏泽湿地河泥中分离获得的，已于2017年9月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCC No.14679。其具有以下生物学特性：在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基或LB(Luria-Bertani)培养基上菌落形态为圆形或不规则形，乳白偏黄色，表面粗糙起褶皱，在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上，28℃下培养两天后，镜检，菌体细胞呈杆状，能运动。经革兰氏染色呈阳性(以大肠杆菌为对照)。经芽孢染色后观察芽孢呈椭圆形或柱状。

本发明枯草芽孢杆菌(B.subtilis)菌株HZ08-3的培养方法或繁殖方法包括：

(1)普通培养保存采用LB培养基，配方为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂15～20g，蒸馏水1000mL，pH调至7.1～7.3；

(2)实验室液体培养采用LB液体培养基，配方为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，蒸馏水1000mL，pH调至7.1～7.3；

(3)固体培养基配方：固料和无机盐，所述固料和无机盐的质量比为98.6∶0.4；所述固料按质量比计为稻壳∶玉米粉∶豆粕粉∶麸皮＝50∶25∶20∶5；所述无机盐的组分及重量比为：磷酸二氢钾18％，硫酸镁5％，硫酸铵12％，轻质碳酸钙65％。

(4)大量发酵培养配方：同(3)中固体培养基配方。

本发明还提供一种用于防治牡丹红斑病的生物防治制剂，所述生物防治制剂包括所述的枯草芽孢杆菌(B.subtilis)菌株HZ08-3。

并且，本发明还提供了一种用于防治牡丹红斑病的生物防治方法，所述生物防治方法包括向具有红斑病的牡丹植株施用上述枯草芽孢杆菌(B.subtilis)菌株HZ08-3或者上述生物防治制剂。

本发明也提供了上述枯草芽孢杆菌菌株HZ08-3或者上述生物防治制剂在防治牡丹红斑病中的用途。

本发明所述的生物防治制剂的制备方法包括以下步骤：

(1)制备所述枯草芽孢杆菌菌株HZ08-3的种子液；

(2)将步骤(1)制备的种子液接种到固体培养基中，26～28℃下恒温培养；

(3)将步骤(2)培养的培养物加入无菌水混合，过滤，将滤液接种至大量发酵培养基，在室温26～28℃、相对湿度85％以上的发酵室中进行发酵培养。

在本发明的一个具体实施方案中，所述制备方法包括以下步骤：

(1)将所述枯草芽孢杆菌菌株HZ08-3的孢子移植到LB液体培养基，26～28℃摇床振荡培养3～5d得到种子液；

(2)将步骤(1)制备的种子液按质量比10％的比例接种到固体培养基中，26～28℃下振荡培养3～5d；

(3)将步骤(2)培养的培养物用无菌水按质量比1∶15的比例混合，并用灭菌纱布过滤，将滤液按体积比1∶6的比例接种至发酵培养基，室温26～28℃、相对湿度85％以上的发酵室中发酵培养8～9d。

其中，步骤(1)中的LB液体培养基，配方为胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，蒸馏水1000mL，pH调至7.1～7.3。

步骤(2)中的固体培养基包括固料和无机盐，所述固料和无机盐的质量比为98.6∶0.4；所述固料按质量比计为稻壳∶玉米粉∶豆粕粉∶麸皮＝50∶25∶20∶5；所述无机盐的组分及重量比为：磷酸二氢钾18％，硫酸镁5％，硫酸铵12％，轻质碳酸钙65％。

步骤(3)中的发酵培养基同步骤(2)的固体培养基。

实验表明，本发明的枯草芽孢杆菌菌株具有生长速度快、产量大、抗逆性强，在植物(尤其是牡丹)表面能够快速大量定殖等特点，因此具有良好的应用前景。由该枯草芽孢杆菌制备的生物防治制剂，不仅能够高效的防治牡丹红斑病害，还能有效促进牡丹生长，是一种极具应用前景的生物防治制剂。该微生物制剂可以作为生物农药或生物肥料，防治牡丹红斑病。试验结果表明：枯草芽孢杆菌(B.subtilis)菌株HZ08-3固体发酵培养物防治牡丹红斑病效果显著，防治效果达到75.95％，且牡丹长势良好，无药害产生。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是示例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均在本发明的保护范围内。

实施例1

1、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)HZ08-3的分离与纯化

本发明的枯草芽孢杆菌(B.subtilis)HZ08-3是从河泥中采用稀释平板法和平板划线法分离获得的，分离方法为：

(1)芽孢杆菌的分离

河泥样品于2013年5月21日取自菏泽湿地。称取1g河泥于100mL无菌水中，置于30℃摇床中150rpm震荡10min，然后置于60℃水浴锅中孵育30min，取100μL 10^-2、10^-3、10^-4稀释液涂布于LB培养基平板上，每个梯度涂布三个平行，在30℃培养2d后挑取LB培养基上的不同形态的微生物菌落于LB培养基平板上进行划线，定时观察菌落生长情况。然后采用平板划线法，纯化芽孢杆菌菌株，分别编号保存。

(2)牡丹红斑病高效拮抗枯草芽孢杆菌的筛选

①初筛：采用对峙培养法，制备PDA(Potato Dextrose Agar)平板，用打孔器在芽孢杆菌、牡丹红斑病病原菌边缘取直径为5mm的菌饼，分别移植在平板相对的两侧中央，25℃恒温培养，逐日观察枯草芽孢杆菌对病原菌的抑制作用。

②复筛：将筛选到的具有高效拮抗活性的枯草芽孢杆菌菌株进行复筛，主要是经过耐温性、耐酸碱性、耐药性试验，筛选到耐性较好的芽孢杆菌菌株，进行盆栽防治试验和田间试验，并对筛选得到的菌株HZ08-3进行鉴定。

本发明人通过大量筛选工作得到一株能够高效防治牡丹红斑病的枯草芽孢杆菌(B.subtilis)HZ08-3。实验证明，该枯草芽孢杆菌固体发酵培养物在防治牡丹红斑病中显示出非常高效的防治效果，使得牡丹长势良好。因而，本发明的枯草芽孢杆菌是具有广泛应用前景的枯草芽孢杆菌新菌株，可以用于制备防治牡丹红斑病病害的生物防治制剂。

2、菌株鉴定

(1)微生物学特性：在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基或LB培养基上菌落形态为圆形或不规则形，乳白偏黄色，表面粗糙起褶皱；在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上，28℃下培养两天后，镜检，菌体细胞呈杆状，能运动。经革兰氏染色呈阳性(以大肠杆菌为对照)。经芽孢染色后观察芽孢呈椭圆形或柱状。

(2)分子生物学特性

该菌株的16s rDNA基因序列测定结果如下(SEQ-1)：

GGTTACCTTACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGAACAGATTTGTGGGATTGGCTTAACCTCGCGGTTTCGCTGCCCTTTGTTCTGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGGCCAAAGGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGCCCCCGAAGGGGACGTCCTATCTCTAGGATTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAGGGGCGGAAACCCCCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGTCGCTTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGTTCCCCAGTTTCCAATGACCCTCCCCGGTTGAGCCGGGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCGCCTGCGAGCCCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCGTCAAGGTGCCGCCCTATTTGAACGGCACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGCTTTACGATCCGAAAACCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTTTCCAGTTGGGCTACGCATCGTCGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATGCGCCGCGGGTCCATCTGTAAGTGGTAGCCGAAGCCACCTTTTATGTCTGAACCATGCGGTTCAGACAACCATCCGGTATTAGCCCCGGTTTCCCGGAGTTATCCCAGTCTTACAGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAACATCAGGGAGCAAGCTCCCATCTGTCCGT。

该菌株HZ08-3鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，已于2017年9月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.14679。

实施例2

1、芽孢杆菌菌种发酵过程

LB液体培养基配方为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，蒸馏水1000mL，pH调至7.1～7.3。

固体培养基由固料、无机盐和水组成，所述固料和无机盐的质量比为98.6∶0.4；所述固料按质量比计为稻壳∶玉米粉∶豆粕粉∶麸皮＝50∶25∶20∶5；所述无机盐的组分及重量比为：磷酸二氢钾18％，硫酸镁5％，硫酸铵12％，轻质碳酸钙65％。配制方法：加入适量的水(10-15倍质量)溶解无机盐，得到无机盐溶液；无机盐溶液与固料混合，并加入水最终调整固体培养基的含水量为40-60％，以将固体培养基攥在手中，指缝中有水但不会滴落为宜。

大量发酵培养基同固体培养基。

枯草芽孢杆菌(B.subtilis)菌株HZ08-3大量固体发酵过程：

①菌种种子液培养

将枯草芽孢杆菌菌株(B.subtilis)HZ08-3从试管斜面中挑取少量孢子，移至LB液体培养基中，27℃摇床振荡培养3～5d，此为种子液；

②固体生产菌种的培养

将种子液按10％的比例接种到固体培养基(500mL三角瓶)中，27℃恒温培养3～5d，中间多次振荡；

③大量固体发酵：

将②中固体培养的培养物用无菌水按1∶15比例稀释，并用灭菌纱布过滤，除去粗渣，即为生产菌液，接种比例按1∶6接种于大量发酵培养基。将接种的原料置于发酵室(27℃和相对湿度85％以上)中发酵培养8～9d，活性菌可达到32亿/克。

为了明确枯草芽孢杆菌(B.subtilis)菌株HZ08-3对牡丹红斑病的防治效果，为其推广应用提供依据。我们于2016年3月～7月在山东省菏泽市进行试验，现将试验结果报告如下：1供试材料及方法

1.1供试药剂

按本发明实施例2发酵方法生产的枯草芽孢杆菌(B.subtilis)菌株HZ08-3固体发酵培养物(32亿/g)；50％多菌灵可湿性粉剂(江苏省新沂市中港农药化工有限公司生产，市售)。

1.2试验材料与防治对象

试验材料为牡丹；防治对象为牡丹红斑病(Cladosporium paeoniae Pass.)。

1.3试验地情况

试验地设在山东省菏泽市洪庙牡丹基地。在菏泽地区，牡丹红斑病发病程度应因品种和地块的不同而异，有高达80％以上的牡丹园病害发生率在50％左右，病重园发病率甚至在90％以上。试验土壤类型为潮土，有机质含量为3.63％，pH值为7.0，所有试验小区栽培条件及管理措施一致，施药时牡丹红斑病处于发病初期。

1.4试验设计及安排

本试验共3个处理，分别为枯草芽孢杆菌(B.subtilis)菌株HZ08-3固体发酵培养物15倍液、50％苯菌灵可湿性粉剂600倍液、不施药清水作对照，每个处理4次重复，每个处理60株。于2016年3月11日、5月16日、6月15日和7月10日各喷洒一次，喷药器械为工农—16型喷雾器。

1.5试验调查及计算方法

1.5.1气象条件

第1次施药(3月11日)当日晴，风力3级，最高气温为12℃，最低气温为2℃，相对湿度为80％。第2次施药(5月16日)，当日晴，风力3级，最高气温为28℃，最低气温为15℃，相对湿度为75％；第3次施药(6月15日)当日多云，风力4级，最高气温为28℃，最低气温为18℃，相对湿度为80％；第4次施药(7月10日)当日多云，风力3级，最高气温为32℃，最低气温为23℃，相对湿度为80％。

1.5.2药效及安全性调查

药效调查：最后一次施药后14d进行调查。每个处理调查50株，调查植株茎基部和叶片，调查发病率，记录病情级数并计算病情指数。

安全性调查：于第一次施药后7d和14d观察牡丹的安全性，如有药害发生，详细描述药害症状并按药害程度分级标准确定药害程度。

牡丹红斑病分级标准：

0级：全株茎部、叶片健康，均无病。

1级：茎基部10cm范围内斑点数量在3个以下，上部茎有零星小点，全株1/4以下叶片发病，平均每个复叶上的病斑数在2个以下，病斑不连成片。

2级：茎基部10cm范围内3～5个斑点，上部茎斑点稀疏，1/4～1/2叶片发病，平均每个复叶上有3～5个病斑。

3级：茎基部10cm范围内有6～10个斑点，上部茎斑点较密，1/2～3/4叶片发病，平均每个复叶上有6～10个病斑，斑点密集，1/3以上叶片枯焦。

4级：茎基部10cm范围内有10个以上斑点，上部茎斑点密集，3/4以上叶片发病，平均每个复叶上有10个以上病斑，斑点密集并相连成片，1/2以上叶片枯焦。

1.5.3药效计算方法

防治效果按式(1)、(2)计算：

式中：CK₀——空白对照区施药前病情指数；

CK₁——空白对照区施药后病情指数；

PT_{0————}药剂处理前施药前病情指数；

PT_{1————}药剂处理后施药后病情指数。

1.5.4对牡丹的直接影响

观察药剂对牡丹有无药害，记录药害的类型和程度。此外，也要记录对牡丹长势的影响。

用下列方式记录药害：

(a)如果药害能被测量或计算，要用绝对值表示，例如株高、结实率。

(b)在其他情况下，可以按下列两种方法估计药害程度和频率：

①按照药害分级方法记录每小区的药害程度，以—、+、++、+++、++++表示。

药害分级方法：

—：无药害；

+：轻度药害，不影响植物生长；

++：中度药害，可复原，不会降低植物生物量；

+++：中度药害，影响植物正常生长，对植物生物量造成一定程度的降低；

++++：严重药害，植物生长受阻，植物生物量降低严重。

②将药剂处理区与空白对照区比较，评价其药害百分率。同时，要准确描述植物的药害症状(矮化、褪绿、畸形等)。

2结果

2.1供试药剂对牡丹红斑病的防治效果

供试药剂对牡丹红斑病的防治效果如表1-2所示。表2结果显示，枯草芽孢杆菌(B.subtilis)菌株HZ08-3固体发酵培养物和50％多菌灵可湿性粉剂对牡丹红斑病均具有较好的防治效果，其中前者的防治效果达到75％以上。

从牡丹红斑病田间试验的病情指数来看(表2)，最后一次施药后14d，枯草芽孢杆菌(B.subtilis)HZ08-3防治效果为75.95％，明显高于50％多菌灵可湿性粉剂58.27％的防治效果。

表1三个处理前牡丹红斑病情况

表2三个处理对牡丹红斑病防治效果

2.2牡丹安全性调查

经施药7d和14d观察，各药剂处理区与对照区相比，牡丹生长正常，无药害产生，说明枯草芽孢杆菌固体发酵培养物供试浓度对牡丹安全。

3小结

3.1从病情指数和防治效果来看，枯草芽孢杆菌(B.subtilis)菌株HZ08-3(保藏号CGMCC No.14679)对牡丹红斑病具有较好的防治效果，最后一次施药后14d防治效果达75％以上。

3.2从牡丹长势看，枯草芽孢杆菌(B.subtilis)菌株HZ08-3对牡丹具有促生长效果，没有药害，安全可靠。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东省林业科学研究院

<120> 一株枯草芽孢杆菌及其在防治牡丹红斑病中的应用

<130> 0

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1393

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）菌株HZ08-3的16s rDNA基因序列

<400> 1

ggttacctta ccgacttcgg gtgttacaaa ctctcgtggt gtgacgggcg gtgtgtacaa 60

ggcccgggaa cgtattcacc gcggcatgct gatccgcgat tactagcgat tccagcttca 120

cgcagtcgag ttgcagactg cgatccgaac tgagaacaga tttgtgggat tggcttaacc 180

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ggggcatgat gatttgacgt catccccacc ttcctccggt ttgtcaccgg cagtcacctt 300

agagtgccca actgaatgct ggcaactaag atcaagggtt gcgctcgttg cgggacttaa 360

cccaacatct cacgacacga gctgacgaca accatgcacc acctgtcact ctgcccccga 420

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tctcctcttc tgcactcaag ttccccagtt tccaatgacc ctccccggtt gagccggggg 840

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aggtaccgtc aaggtgccgc cctatttgaa cggcacttgt tcttccctaa caacagagct 1020

ttacgatccg aaaaccttca tcactcacgc ggcgttgctc cgtcagactt tcgtccattg 1080

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