CREG在治疗非酒精性脂肪肝和2型糖尿病中的应用

摘要

本发明涉及E1A激活基因阻遏子(CREG)蛋白的用途，具体涉及CREG蛋白或其活性片段在制备用于预防和/或治疗脂肪肝及2型糖尿病的药物中的用途。本发明还涉及表达CREG蛋白或其活性片段的重组载体或重组细胞在制备用于预防和/或治疗脂肪肝及2型糖尿病的药物中的用途。本发明还涉及相关试剂盒，诸如用于脂肪肝及2型糖尿病预测和/或治疗效果、预后的评估的试剂盒。

说明书

技术领域

本发明属于CREG基因的医药用途，尤其是涉及E1A基因激活阻遏子(Cellularrepressor of E1A-stimulated genes，CREG)在治疗非酒精性脂肪肝疾病及2型糖尿病中的应用，具体涉及CREG制剂在制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝(特别是非酒精性脂肪肝疾病)和/或2型糖尿病的相关药物中的应用。

背景技术

脂肪肝，作为一种肝脏的病理性代谢状态，是指由于各种原因引起的肝细胞内脂肪堆积过多的病变。脂肪肝一般由多种疾病诱发，是众多肝脏疾病对肝脏细胞产生不良影响的综合表现。临床表现轻者无症状，而中、重者则可危及生命。根据有无过量饮酒史，临床上将脂肪肝分为“酒精性脂肪性肝病(ALD)”和“非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)”两种。NAFLD和ALD的致病因素、自然转归及预后都不相同，因此治疗策略也有所差异。NAFLD已成为欧美发达国家和我国富裕地区第一大慢性肝病，在我国，NAFLD的患病人群仅次于乙型肝炎患者。目前不良生活方式带来的NAFLD及其引发的肝硬化乃至肝癌正严重威胁我国各年龄段人群的健康，亦被公认为隐蔽性肝硬化的常见原因。

NAFLD具体是指排除酒精和其它明确的肝脏损伤导致的肝细胞内脂肪堆积的临床病理综合征。除了可直接导致肝硬化及肝细胞癌等， NAFLD还可影响其它慢性肝病的进展，并且参与2型糖尿病和心脑血管病中动脉粥样硬化的发病。NAFLD是近年来对人类健康及医学研究的新挑战。对于NAFLD的治疗目前为基础支持疗法、减肥减重、胰岛素增敏剂、降血脂、肝细胞保护药物等，但是尚缺乏有效的保护药物。

2型糖尿病为非胰岛素依赖型糖尿病。2型糖尿病的病因是遗传、肥胖、高热量饮食、体力活动不足等。2型糖尿病的主要表现为胰岛素敏感性下降。糖尿病目前作为慢性多发性疾病已经成为全球关注的重点公共卫生问题。中国的糖尿病人数已经跃居世界第一。但针对糖尿病的治疗，除胰岛素替代疗法外，还包括双胍类及磺脲类等多种类型不同机制的口服药物。目前尚无治疗糖尿病的基因调节及治疗制剂。

E1A激活基因阻遏子基因(CREG)是在成熟组织细胞中广泛表达的一种小分子量分泌型糖蛋白，具有维持组织和细胞成熟分化的重要生理功能。CREG蛋白由220个氨基酸构成，含有3个甘露糖-6-磷酸(M6P) 糖基化位点，能与M6P受体相互作用。CREG广泛表达于多种类型的机体细胞中，可调节白介素、肿瘤坏死因子等多种细胞因子表达和激活，亦被发现与肥胖导致的炎症活动相关。它是调控糖脂代谢通路和异常炎症反应的关键分子。

发明内容

在一个方面，本发明提供了靶基因CREG用于治疗非酒精性脂肪肝、2型糖尿病的新用途。

在另一个方面，本发明提供了CREG基因用于治疗非酒精性脂肪肝、2型糖尿病的用途，其中针对CREG基因的多个下游靶点进行治疗。

在一个实施方案中，本发明以野生型C57小鼠与CREG肝脏特异性基因敲除小鼠为实验对象，通过高脂饮食诱导的肥胖小鼠模型(diet induced obesity，DIO)研究CREG基因的功能，结果发现与野生型 (WT)小鼠对比，CREG基因敲除(KO)小鼠表现出肥胖，其体重明显高于同种饲料饲养的WT小鼠，并且CREG基因KO小鼠的体重及空腹血糖水平均高于对照组WT小鼠，CREG基因KO小鼠的肝功能明显差于WT小鼠。本发明人进一步通过腹腔注射葡萄糖耐量实验发现，CREG基因KO小鼠对葡萄糖的耐受能力明显减弱。从小鼠肝脏大体外观、肝脏重量及肝脏/体重比以及脂质成分病理染色结果等均说明：HFD组(High fat diet，高脂饮食)的CREG-KO小鼠脂肪肝病变明显严重，脂质蓄积显著增加，血糖水平、糖耐量等指标明显恶化(图5)，而高表达CREG的CREG转基因组(即CREG-TG组) 在HFD条件下肝脏脂肪变性较WT组明显减轻，血糖水平、糖耐量等指标明显改善。上述结果表明CREG基因敲除会加剧脂肪肝、2型糖尿病的发生；而CREG基因过表达则能够改善脂肪肝、2型糖尿病的发生(通过JNK1信号通路发挥作用，图7)。

本发明人的研究证明：在高脂诱导的脂肪肝、2型糖尿病模型中， CREG具有抑制肥胖，降低血糖，减少肝脏脂质蓄积，保护肝功能，特别是改善脂肪肝、2型糖尿病的作用。

在另一方面，本发明涉及CREG蛋白或其活性片段在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗脂肪肝及2型糖尿病。

在又一方面，本发明还涉及编码CREG蛋白或其活性片段的核酸分子及其下游调控靶基因、表达CREG蛋白或其活性片段的重组载体或重组细胞在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗脂肪肝及2型糖尿病。

在本发明的实施方案中，所述重组载体含有编码CREG蛋白或其活性片段的核酸分子。

在另一方面，本发明还涉及检测CREG蛋白或其活性片段表达水平的试剂在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于脂肪肝及2型糖尿病预测和/或治疗效果、预后的评估。

在又一方面，本发明还涉及CREG蛋白或其活性片段用于筛选预防和/或治疗脂肪肝及2型糖尿病的药物的用途。

在本发明的实施方案中，CREG蛋白或其活性片段可以作为靶蛋白用于筛选预防和/或治疗脂肪肝及2型糖尿病的药物；例如促进 CREG蛋白或其活性片段表达上调的试剂可以作为预防和/或治疗脂肪肝及2型糖尿病的药物。

在另一方面，本发明还涉及组合物，其含有CREG蛋白或其活性片段、编码CREG蛋白或其活性片段的核酸分子、表达CREG蛋白或其活性片段的重组载体或重组细胞，以及任选的药学上可接受的载体或赋形剂，所述组合物用于预防和/或治疗脂肪肝及2型糖尿病。

在又一方面，本发明还涉及试剂盒，其含有检测CREG蛋白或其活性片段表达水平的试剂，所述试剂盒用于脂肪肝及2型糖尿病预测和/或治疗效果、预后的评估。

在本发明的实施方案中，所述CREG蛋白为重组CREG蛋白，来源于哺乳动物，特别是来源于人。在本发明的实施方案中，所述 CREG蛋白的GenBank号为NP_003842.1。在本发明的实施方案中，所述CREG基因的GenBank号为NM_003851.2。

在本发明的实施方案中，所述CREG蛋白的活性片段是指具有 CREG蛋白功能的片段，其可以为CREG蛋白的一部分，也可以为 CREG蛋白的氨基酸序列经过缺失、添加或替换后得到的片段；制备或得到CREG蛋白活性片段的方法为本领域所公知，例如该活性片段为包含CREG蛋白与配体或受体结合的部分的片段，或者经过氨基酸的缺失、添加或替换后仍保留CREG蛋白功能的片段。本领域技术人员公知，CREG蛋白上有一些关键的氨基酸和活性密切相关，突变后会影响蛋白的活性，例如，CREG蛋白第136及137位赖氨酸突变为丙氨酸，或者CREG蛋白第141-144位氨基酸缺失突变后，都会影响蛋白的活性和功能(Sacher M,PNAS,2005；102(51):18326-18331)。本领域技术人员可以根据需要避开上述这些可能影响活性的位点，对其它位点进行缺失、添加或替换等改造，使得改造后的CREG蛋白仍具有CREG蛋白的活性或功能。

在本发明的实施方案中，所述预防和/或治疗脂肪肝及2型糖尿病，是指抑制或减缓脂肪肝及2型糖尿病的发生、抑制或减缓脂肪肝及2 型糖尿病相关疾病的发生。

在本发明的实施方案中，所述通过检测CREG蛋白或其活性片段表达水平用于预测和/或评估是指当血液、组织或细胞中的CREG蛋白或其活性片段表达水平低于参考值时，即可以预测脂肪肝及2型糖尿病发生，或者评估其治疗效果或预后。

在本发明的实施方案中，所述哺乳动物例如可以为大鼠、小鼠、犬、小型猪、猴、人等。

在本发明的实施方案中，可以通过本领域公知的方法检测CREG 蛋白或其活性片段的表达水平，例如通过聚合酶链式反应扩增CREG 的mRNA并进行定量反应，或者用蛋白质印迹法(Western Blot)检测 CREG蛋白表达水平。

在本发明的实施方案中，所述蛋白的表达水平是指mRNA的水平或者蛋白的水平。

在本发明的实施方案中，所述上调/下调组织/细胞中蛋白的表达是指提高或降低组织/细胞中蛋白水平或mRNA水平的至少20％、 30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％，或者提高大于 100％。其中所述的上调或下调是与未干预的组织/细胞(例如转染对照载体组的组织/细胞)进行比较。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明发现CREG基因的新功能，即CREG基因具有能够改善脂肪肝、2型糖尿病疾病的作用。

(2)基于CREG在脂肪肝、2型糖尿病疾病防治中的保护作用，其可以用于制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝和/或2型糖尿病的药物。

本领域技术人员知晓的是，本发明的技术方案并不必然同时实现上述效果，只要能够实现任意技术效果或其组合即可。

附图说明

图1是构建CREG条件性敲除小鼠的打靶策略示意图。

图2是CREG转基因过表达的图。

图3的A-D是WT和CREG-KO小鼠的体重、空腹血糖结果图； A为小鼠体重对比柱形图，B为空腹血糖水平对比柱形图；C为体重变化趋势图，D为血糖变化趋势图(*：p＜0.05vsWT-NC组，#：p ＜0.01vs KO-NC组)。

图3的E-H是NTG(转染空载体组)和CREG-TG小鼠的体重、空腹血糖结果图；E为小鼠体重对比柱形图，F为空腹血糖水平对比柱形图；G为体重变化趋势图，H为血糖变化趋势图(*：p＜0.05vs NTG-NC组，#：p＜0.01vs TG-NC组)。

图4的A-B是WT和CREG-KO小鼠通过腹腔注射葡萄糖耐量结果图；A为通过腹腔注射葡萄糖后不同时间点小鼠血糖水平统计图， B为各组小鼠糖耐量曲线下面积(area underthe curve，AUC)比较图(*：p＜0.01vs WT-HFD组)。

图4的C-D是NTG和CREG-TG小鼠通过腹腔注射葡萄糖耐量结果图；C为通过腹腔注射葡萄糖后不同时间点小鼠血糖水平统计图， D为各组小鼠糖耐量曲线下面积(areaunder the curve，AUC)比较图(*：p＜0.01vs NGT-HFD组)。

图5是CREG-KO和WT小鼠的肝脏超声结果图和肝脏体重比例柱形图；A为肝脏超声结果图，B为CREG-KO肝脏体重比例柱形图 (*：p＜0.05vs WT-NC组，#：p＜0.01vs KO-NC组)，C为CREG-TG 肝脏体重比例柱形图(#：p＜0.01vs KO-NC组)

图6是WT、CREG-KO、NTG及CREG-TG的小鼠的HE和油红O染色图。

图7显示的是CREG基因通过调控JNK1信号通路发挥其改善肝脏脂肪变性和2型糖尿病的作用。A为体重变化图，B为肝脏重量/体重变化图，C为血糖变化图，D为HOMA-IR评价图(*：p＜0.05vs WT-HFD组，#：p＜0.01vs CREG-CKO-HFD组)。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

本发明的实验数据均为百分数。两样本率的比较应用卡方检验，统计学处理均应用SPSS 19.0软件包处理。以p<0.05为有统计学差异。

实验动物及饲养

实验动物种属、性别、周龄及来源：C57BL/6(WT)小鼠和CREG-KO 小鼠或CREG转基因高表达(即CREG-TG)小鼠，雄性，8周龄。C57BL/6 小鼠购自北京华阜康生物科技有限公司。

CREG基因敲除(转基因)小鼠

1、CREG条件性敲除小鼠(KO)的构建

1.1基因信息和载体设计

根据基因信息，利用CRISPR Design(网址：http://crispr.mit.edu/) 分别在内含子2和4中各设计一个CRISPR的打靶位点。此外还设计了一个用于同源修复的供体质粒(Donor Vector)，它包括两侧同源臂、中间的外显子3和4、以及两个同向的loxp序列。图1为构建CREG 条件性敲除小鼠的打靶策略。

1.2实验过程

打靶载体的构建：分别将sgRNA1和sgRNA2对应的两条引物融合成双链DNA，然后用T4DNA连接酶连入经过限制性内切酶BsaI处理过的pUC57-sgRNA载体中，可以用于后续的体外转录实验。

1.3供体载体的构建

本实验室构建的条件性敲除骨架载体pBluescript SK(+)-2loxp包含两个同向的loxp序列，并且在两个loxp之间和两侧分别含有多个限制性内切酶的酶切位点，便于克隆选择。CREG条件性敲除的供体载体就是基于该骨架载体构建完成的。

根据引物设计原则，设计如下引物用于扩增供体载体的左右同源臂 (LA和RA)以及中间的外显子部分(M)。然后分三步酶切连接将扩增得到的3个片段分别连入上述骨架载体。

1.4打靶载体的体外转录

CRIPR/Cas9系统包含两个部分：负责切割作用的Cas9蛋白和引导Cas9蛋白定位到靶位点的gRNA。本实验中，这两部分需要分别进行体外转录。对于Cas9蛋白，我们将其表达载体(pST1374-Cas9)用 PmeI进行酶切，纯化后回收线性化质粒作为转录模板，然后使用T7mMESSAGE mMACHINE试剂盒(AM1345，Ambion公司)进行体外转录实验，获得加帽的mRNA产物。并用Poly(A)Tailing试剂盒 (Ambion公司)对上述产物加尾，获得成熟的mRNA产物。而对于 sgRNA，使用MEGAshortscript^TMKit(AM1354，Ambion公司)进行体外转录。将转录得到的Cas9和sgRNA的mRNA使用miRNeasy>

1.5显微注射

挑选3-4只4-5周龄的母鼠于第一日上午11:00腹腔注射PMSG(30IU)，46-48小时后再注射hCG(30IU)，然后与正常SD公鼠交配，次日早晨检查有阴栓者作为供体母鼠。第四日上午9:00用颈椎脱臼法处死供体母鼠，取出受精卵用于显微注射。将3种mRNA和供体质粒混合配置成一定比例的混合液，用显微注射仪(FemtoJet 5247显微注射仪，购自Eppendorf)注射至小鼠受精卵中。再通过胚胎移植，将注射后的受精卵，移植到代孕母鼠体内，怀孕的母鼠一般在21-23天内生产。

1.6首建鼠(Founder)的筛选

取出生一周后的小鼠脚趾或尾部组织，提取基因组。分别对新生小鼠的基因组中两个loxp插入位点进行检测分型。如果发生同源重组，由于基因组中部分序列被供体载体中的loxp置换，与原序列大小有所差异，通过高浓度(3.0％)琼脂糖凝胶电泳分离即可分辨。6只首建鼠均发生了精确的同源重组修复。随机挑选1只上述首建鼠与本实验室保种C57/B6交配，繁殖得到F1代。通过PCR方法筛选杂合子小鼠，再将杂合子之间交配繁殖，应用相同的筛选方法最终获得CREG-floxed纯合小鼠。

引物列表：

2、肝细胞特异性CREG转基因(TG)小鼠的构建

为进一步研究CREG过表达对于肝脏缺血再灌注损伤的影响，我们构建了几株肝细胞特异性CREG转基因小鼠(CREG-TG)。把cDNA 插入白蛋白(Albumin)启动子下游，将构建的载体通过显微注射构造成受精胚胎(C57BL/6J背景)，得到肝细胞特异性CREG转基因小鼠。CREG转基因过表达(TG)示意图见图2中的上图。

通过蛋白质印迹法实验鉴定不同转基因鼠的肝脏中CREG蛋白的表达量：提取不同转基因鼠肝脏组织蛋白，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)进行定量。

肝细胞CREG的表达由白蛋白(ALB)启动子驱动，并通过蛋白质印迹实验验证CREG过表达。为了反映病理生理状态下CREG的改变，我们选择了CREG-TG 10小鼠。蛋白质印迹及定量分析显示， CREG-TG 10小鼠的肝脏组织中CREG表达量与正常组织相比明显增多。CREG转基因过表达检测结果图见图2中的下图。

3、实验动物饲料配方

高脂饲料(HFD)(购自北京华阜康生物科技有限公司，货号 D12942)：热量百分比：蛋白质:20％；碳水化合物:20％；脂肪:60％，总的热量质量比:5.24kcal/g。低脂饲料(NC)即正常饲料(购自北京华阜康生物科技有限公司，货号D12450B)：热量百分比：蛋白质:20％；碳水化合物:70％；脂肪:10％，总的热量质量比:3.85kcal/g。

4、动物饲养及环境条件

所有的实验小鼠均饲养在沈阳军区总医院心血管病研究所动物房。每12小时交替照明，温度24±2℃，湿度40％-70％，小鼠自由饮水进食。

实施例1.小鼠脂肪肝、2型糖尿病模型(diet induced obesity， DIO)制备

(1)动物分组：选用8周龄雄性WT小鼠和前述方法获得的 CREG-KO(或CREG-TG)小鼠，分别给予两种特殊饲料D12942高脂饲料(High fat diet，HFD)和D12450B正常饲料(Normal chow，NC) 饲养，即WT-NC组、KO-NC组、WT-HFD组、KO-HFD组共4个组别(或WT-NC组、TG-NC组、WT-HFD组、TG-HFD组)。

(2)DIO小鼠制备操作流程：

对WT和KO(TG)小鼠进行表型相关分析，以明确CREG基因对脂肪肝、2型糖尿病发挥的作用。选用8周龄，雄性，WT小鼠和 CREG-KO(TG)小鼠，分别给予两种特殊饲料D12942高脂饲料 (Highfat diet，HFD)和D12450B低脂饲料(Normal chow，NC)饲养，即WT-NC组、KO/TG-NC组、WT/TG-HFD组、KO/TG-HFD组共4个组别。每周均详细记录小鼠摄食量、小鼠空腹体重和空腹血糖，每隔4周检测1次。实验第14周，进行腹腔注射葡萄糖实验(IPGTT)，以评价小鼠机体对葡萄糖耐受能力。第16周终末取材，取出小鼠肝脏拍照，然后一部分置于甲醛溶液中固定或O.C.T冰冻切片包埋剂(Tissue Freezing Medium)包埋作病理分析用。

实施例2.小鼠体重、血糖水平测定

(1)小鼠空腹体重、饲料量检测

①禁食：上午8:00将待实验小鼠禁食(不禁水)，下午2:00开始实验操作。

②称重：分别在第0周、4周、8周、12周称重，将一塑料小桶放在动态电子天平上，抓起小鼠，放入称量小桶中，测量体重记录数据。

③饲料量检测：待称重操作完成后，给小鼠加饲料，并在动态电子天平上记录小鼠的饲料量。

(2)小鼠空腹血糖水平检测

将所有待实验的小鼠从上午8:00至下午2:00间禁食(不禁水)，即禁食6小时后开始实验操作。

①血糖仪准备：检查血糖仪(美国强生公司，ONETOUCH)电池，按右侧开关，将试纸正确放入左侧插槽，屏幕显示与血糖试纸条相应代码的数字，随后显示滴血图案，提示血糖仪进入待测状态。

②固定小鼠：右手抓鼠尾，左手持一块毛巾，将毛巾对折，用拇指和食指捏住毛巾对折处，将鼠头部和身体包入手掌内的毛巾，拇指和食指在将鼠尾根部固定。

③剪尾：眼科剪迅速在距鼠尾末端0.1-0.2cm处剪下鼠尾，待血滴自行流出。

④血糖检测：将血糖仪试纸边缘轻触血滴，血液浸入试纸，血糖仪倒计时5秒显示读数。

2型糖尿病损伤严重程度的评估指标主要包括体重、空腹血糖等水平。小鼠的体重、血糖变化结果如图3所示，WT小鼠在给予HFD饲料饲养后，从第4周开始体重明显高于其NC饲料组(见图3C)，给予CREG-KO/TG小鼠12周的HFD饲料和NC饲料饲养后，从第4周开始HFD组的CREG-KO小鼠(KO-HFD)体重明显高于HFD组的 WT小鼠(WT-HFD)体重，一直持续到第12周(见图3C和3G)，高表达CREG的TG-HFD组与NTG-HFD组相比未见明显差别；经空腹血糖检测发现在HFD组的小鼠从第4周、8周、12周的空腹血糖水平明显较相应NC对照组升高，HFD组的CREG-KO小鼠空腹血糖水平也明显高于WT组小鼠空腹血糖水平(见图3B)，而高表达CREG后，TG-HFD组血糖水平比NTG-HFD显著降低(见图3F)。表明CREG 转基因敲除后显著影响了小鼠在HFD饲养状态下的糖代谢稳态，CREG 基因高表达能显著提高小鼠的糖代谢能力，表明CREG基因在高脂诱导引起的2型糖尿病中起到重要作用。

实施例3.小鼠葡萄糖耐量实验(intraperitoneal glucose tolerance test，IPGTT)

实验第12周，进行腹腔注射葡萄糖实验(IPGTT)，以评价小鼠机体对糖耐受的能力。

(1)在测血糖之前，先测量小鼠的空腹体重，根据10μL/g计算葡萄糖的注射体积。

(2)先检测葡萄糖注射前即0分钟时空腹血糖，在检测完毕后迅速经腹腔注射葡萄糖液。

(3)腹腔注射操作方法

①固定小鼠；抓起小鼠，左手的小指和无名指抓小鼠的尾巴，另三手指抓住小鼠的颈部，使小鼠的头部向下，将小鼠腹部充分暴露。

②进针定位及注射：从腹部一侧进针右手持注射器，将尖端与小鼠腹部成45°的夹角，进针，回抽，注射时针头在腹部皮下穿行一小段距离，穿过腹中线后在腹部另一侧进入腹腔，注射完药物后，缓缓拔出针头，并轻微旋转针头，防止漏液。

(4)分别于腹腔注射后15分、30分、60分、120分钟时间点剪尾测小鼠血糖值，并记录血糖数值和检测时间。

进一步通过腹腔注射葡萄糖耐量实验(intraperitoneal glucosetolerancetests，IPGTT)来评估各组小鼠对葡萄糖的处理能力。在实验第12周，通过注射1.0g/kg体重的葡萄糖后，HFD组的WT小鼠和 CREG-KO/TG小鼠血糖水平在15分钟时间点剧增达到峰值，随着时间推移至注射后60分钟，两组小鼠血糖水平稍微下降，但仍处于高于空腹血糖水平(0分钟时血糖)，在2小时时恢复至空腹血糖水平，且CREG-KO小鼠血糖水平从0分钟至2小时一直处于高于WT小鼠的血糖水平，而CREG-TG组血糖曲线的线下面积显著下降(见图4A和图 4C)。上述结果表明CREG基因对维持糖代谢存在较大的调控和影响能力。

实施例4.小鼠胰岛素耐受实验

本实施例的详细操作步骤参考实施例3的小鼠葡萄糖耐受试验。胰岛素用量根据小鼠的年龄和性别来决定，一般理想用量是使葡萄糖水平在注射30min后下降至注射前的40％左右。小鼠胰岛素耐受实验的胰岛素用量一般为0.5-1.2U/kg，胰岛素用生理盐水稀释，用量0.5U/kg，配制浓度0.5U/ml。0.75U/kg，0、15、30、60min测血糖； 0.027U/10g＝2.7U/kg。

上午禁食4小时，正常饮水。下午试验，称体重，标记序号，注射胰岛素前测血糖，胰岛素按体重计算注射量，在15min、30min、45min、 60min分别测血糖，实验完毕，每笼补充上饲料。

胰岛素耐受实验结果如图4B所示。结果表明CREG-KO小鼠存在较强的胰岛素抵抗。图4D显示CREG-TG组胰岛素抵抗显著减轻。

实施例5.小鼠CREG肝脏组织脂质成分测定

(1)终末肝脏组织取材

1)小鼠称重后，迅速脱颈处死。仰卧固定小鼠，用蒸馏水将小鼠胸部及腹部毛发润湿。

2)用一镊子钳夹小鼠腹部正中皮肤，沿腹部正中向头部剪开皮肤至剑突下，向尾端剪开皮肤，逐层暴露皮下筋膜、肌肉等，打开腹腔，充分暴露各脏器。

3)迅速找到并取下小鼠的肝脏，将取下的肝脏标本置于灭菌纱布上，拭干肝脏表面上残留血液，将肝脏置于无菌培养皿中，迅速拍照，称重。

4)冰冻标本：切取部分肝脏，置于有OCT的锡纸模具中包埋，放在干冰上冰冻固定。

(2)肝脏组织冰冻切片处理及病理染色相关实验

肝脏组织的总胆固醇含量变化如图6所示。CREG基因转基因高表达后，肝脏组织总胆固醇含量下降，CREG敲除后，肝脏组织总胆固醇含量显著升高。

上述结果显示：CREG-KO小鼠在HFD诱导下发生的2型糖尿病和脂肪肝病变显著加重。这些结果表明CREG基因高表达对改善2型糖尿病和脂肪肝具有显著的作用。本发明结果说明CREG基因蛋白在脂肪肝、2型糖尿病疾病模型中有着潜在的重要保护作用。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解，根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

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序列表

<110> 中国人民解放军沈阳军区总医院

<120> CREG在治疗非酒精性脂肪肝和2型糖尿病中的应用

<130> IDC160210

<150> 201611254504.1

<151> 2016-12-30

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

catgtctgga tcgatccccg 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cccttgctcc ataccacccc 20

<210> 3

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

agctttgttt aaacgccacc atggctgccc gtgctc 36

<210> 4

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ctagctagct cactgcagcg tgacgttaaa atattc 36

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ccccctgaac ctgaaacata 20

<210> 6

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tcagcgtagc ctctggattt 20