一种鸡髓样细胞触发受体B2多克隆抗体及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种鸡髓样细胞触发受体B2多克隆抗体及其制备方法和应用，属于动物基因工程领域，其中诱导鸡鸡髓样细胞触发受体B2多克隆抗体产生的抗原多肽由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成，该抗原多肽的编码基因由SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列组成。本发明鸡髓样细胞触发受体B2多克隆抗体特异性强，为鸡髓样细胞触发受体B2在肉鸡组织或细胞中的定量分析及其相关研究提供了重要工具；其次，本发明所用的抗原序列长，易与目标蛋白出现免疫反应，检测灵敏度高。

说明书

技术领域

本发明属于动物基因工程技术领域，具体地说，涉及一种鸡髓样细胞触发受体B2多克隆抗体及其制备方法和应用。

背景技术

髓样细胞触发受体(Triggering receptor expressed on myeloid cells，TREMs)属于免疫球蛋白超家族成员，人等哺乳动物上主要包括TREM-1、TREM-2、TREM-3受体；而在家禽上主要包括TREM-A1、TREM-B1和TREMB2，家禽TREM-B2与哺乳动物TREM-2的蛋白序列同源性最高，故推测其可能具有TREM-2的相似功能。哺乳动物的研究表明，TREMs一般表达于胶质细胞、中性粒细胞、白细胞、巨噬细胞等髓样细胞的膜表面，介导炎症反应的信号通路并对炎症反应有级联放大作用。近年的发现表明，TREM-2不仅可以调节机体的炎症反应，在一些神经疾病(阿尔茨海默病)和脂肪形成的信号传导过程中也起着重要的作用。TREM-2在小鼠肝脏内皮细胞上也有高表达，是脂肪形成的信号通路中重要信号分子。TREM-2的一种罕见变异是晚发型阿尔茨海默病的一个危险因素，其增加发病风险的概率与载脂蛋白相似。此外，TREM2缺失可改变阿尔茨海默病小鼠模型中小胶质细胞的功能。迄今为止尚未见关于家禽TREM-B2功能的研究报道，但推测其与动物免疫功能有关。

哺乳动物TREM2由胞外区含有一个V型Ig超家族结构域、3个假定含有正电荷的赖氨酸残基跨膜序列的N-糖基化位点以及胞内的短尾结构构成。家禽TREM-B2保外有2个V型Ig超家族结构域，其他的功能区与哺乳动物TREM2相同。TREM2的赖氨酸残基与胞内信号适配器蛋白DAP12上的络氨酸残基通过静电在脂质膜相互作用。DAP12的结构是同源二聚体，经由半胱氨酸残基和二硫键之间的短胞外区和包含一个免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)胞内区。激活TREM2后，DAP12酪氨酸残基在ITAM基序下通过酪氨酸(Src)家族激酶发生磷酸化，允许Syk和ZAP70酪氨酸激酶通过C-羧基末端Src同源区(SH2)结构域相结合，从而激活下游包括磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、蛋白激酶C(PKC)、细胞外调节蛋白激酶(ERK)等信号通路以及增加Ca²⁺内流。脂质在调节TREM2功能中起重要作用。迄今为止尚未见关于家禽TREM-B2蛋白受体在胞内信号传导的研究报道。

目前，商业化的TERM抗体仅为人和大小鼠的多抗或单抗，至今尚无针对家禽的TREM抗体。由于鸡TREM-B2蛋白序列与人TREM-2的相似性很低，功能区相似性不超过75％，采用人和大小鼠TREM-2抗体无法识别肉鸡组织和细胞中的TREM-B2表达效果，限制了肉鸡TREM-B2功能的研究。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种鸡髓样细胞触发受体B2(TREM-B2)多克隆抗体及其制备方法和应用。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种用于诱导鸡髓样细胞触发受体B2多克隆抗体的抗原多肽，由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列构成。

本发明还公开了一种上述抗原多肽的编码基因。

进一步地，该编码基因由SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列组成。

本发明还公开了一种含有上述的编码基因的表达载体。

本发明还公开了一种鸡髓样细胞触发受体B2多克隆抗体，所述多克隆抗体的抗原多肽由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成的多肽。

进一步地，所述的抗原多肽的编码基因由SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列组成。

本发明还公开了一种鸡髓样细胞触发受体B2多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：人工合成SEQ ID NO.2核苷酸序列；构建pET-28a原核表达载体，将人工合成鸡TREM-B2基因片段SEQ ID NO.2核苷酸序列克隆到载体上，测序，诱导蛋白表达；超声波破碎诱导表达菌，用Ni-NTA树脂层析柱进行纯化；以纯化的重组pET-28a-TREM-B2表达蛋白免疫新西兰大白兔，五免后第7天进行心脏采血，制备抗血清；利用Protein G亲和层析柱纯化抗血清，得到鸡TREM-B2多克隆抗体。

本发明还公开了一种含有上述的鸡髓样细胞触发受体B2多克隆抗体的检测试剂盒。

本发明还公开了一种上述的鸡髓样细胞触发受体B2多克隆抗体在检测肉鸡组织中TREM-B2表达上的应用。

与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：

1)本发明首次制备了鸡TREM-B2多克隆抗体，为TREM-B2在肉鸡组织或细胞中的定量分析及其相关研究提供了重要工具。

2)本发明所用的抗原序列长，能够区别不同种类TREM蛋白分子，产生的TREM-B2多克隆抗体免疫反应特异性强，检测的灵敏度高、效价高。

当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1是本发明TREM-B2重组蛋白表达后的纯化抗原的电泳图谱；其中，1：蛋白分子量标准(Marker)；2：纯化抗原，Marker分子量(由上向下):116.0KD/66.2KD/45KD/35KD/25KD/18.4KD/14.4KD；

图2是本发明其中一只兔子抗血清的效价测定；

图3是本发明另一只兔子抗血清的效价测定；

图4是本发明鸡TREM-B2纯化抗体的电泳图谱；其中，1：蛋白分子量标准；2：纯化鸡TREM-B2抗体(Marker)；Marker分子量(由上向下):116.0KD/66.2KD/45KD/35KD/25KD/18.4KD/14.4KD；

图5是本发明肉鸡不同组织中TREM-B2表达的图谱；其中，1：十二指肠50μg；2：脾脏50μg；3：肝脏25μg；4：肝脏50μg；5：腹脂25μg；6：腹脂50μg；M：Marker；Marker分子量(由上至下)：180KD/130KD/95KD/72KD/55KD/45KD/35KD/25KD/17KD。

具体实施方式

以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。

实施例1鸡髓样细胞触发受体B2(TREM-B2)基因片段的人工合成

具体程序如下：

(1)通过GenBank上肉鸡TREM-B2序列(NM_001080868.1)推导得到的氨基酸序列与TREM-A1和TREM-B1相比对，找出其功能区域氨基酸序列的差异SEQ ID NO：1和对应的核苷酸序列SEQ ID NO：2，由上海生工生物工程公司人工合成。

(2)将此人工合成片段与pGEM-T载体(美国Promega公司)按照摩尔比2:1的比例连接进行T-A克隆，4℃放置过夜以达到较高的连接产率。取连接产物转化DH5α感受态菌株(北京天根生物技术有限公司)，LB培养基37℃下震荡培养2h，取培养液50μl接种涂布到LB平板，37℃培养箱中倒置培养16h，进行蓝白斑筛选。挑取白色单菌落，在LB含氨苄青霉素(100μg/mL)选择培养基、37℃条件下震荡培养过夜，同时送菌液到上海生工生物工程公司进行测序，其所测序列见SEQ ID No:2,以确定人工合成序列正确。

实施例2鸡髓样细胞触发受体B2(TREM-B2)原核表达载体的构建

按照如下方法进行：

(1)构建含有鸡(第20-125位氨基酸)的原核表达载体：对表达载体pET-28a同时进行EcorI和Hind III双酶切(大连Takara公司)。将双酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，回收表达载体。人工合成的TREM-B2片段和表达载体按摩尔比3﹕1的比例进行连接反应，16℃连接过夜。将连接产物转化BL-21感受态菌株(北京天根生物技术有限公司)，LB培养基(不含卡那霉素)37℃振荡培养2h，取培养液50～100μL接种到含卡那霉素(50μg/mL)(上海生工生物工程公司)LB平板，37℃温箱倒置培养16h以上，进行筛选。挑选的单菌落在LB培养基(含卡那霉素50μg/mL)中37℃振荡培养过夜，用菌液直接进行PCR鉴定。同时送菌液到(上海生工生物工程公司)进行测序分析，筛选出阳性菌。

(2)表达工程菌BL-21构建之后，将pET-28a质粒转化BL21菌株，按质粒说明书进行诱导表达。诱导条件为：诱导剂IPTG(上海生工生物工程公司)终浓度为0.5mM；30℃诱导3h。超声波破碎诱导表达菌，离心，对上清液进行SDS-PAGE蛋白电泳分析。目的蛋白为上清表达，用Ni-NTA层析柱进行纯化。浓度在3.0mg/mL左右，纯度85％左右，大小为27kD左右(见图1)。

实施例3肉鸡髓样细胞触发受体B2(TREM-B2)多克隆抗体的制备

以实施例2中纯化的重组PET-28a-GR免疫两只新西兰大白兔，免疫方法见表1。

表1免疫方法

于五免后第7天及时进行心脏采血，制备抗血清，利用TREM-B2重组蛋白测定抗血清的滴度，结果见图2和图3,两只兔子血清效价超过1:50K。

抗体的纯化：利用10倍亲和柱体积的去离子水冲洗(1mL/min)ProteinG亲和层析柱，再用利用10倍亲和柱体积的1％NaAC冲洗(1mL/min)ProteinG亲和层析柱；然后将抗血清样品过0.22μm滤膜过滤，加入4倍体积的1％NaAC，上样速率为0.5mL/min；利用3.5％冰乙酸冲洗，收集洗脱产物至无蛋白流出；再利用饱和碳酸钠调节洗脱产物pH至中性，在利用10kDa超滤管浓缩至5mL，利用1×PBS透析过夜，第二天换液1次；纯化后的兔抗血清凝胶电泳图谱如图4，兔抗血清的抗体为10mg/ml，纯度为95％。

实施例4利用TREM-B2多克隆抗体测定肉鸡小肠、肝脏、脾脏和脂肪组织中TREM-B2的表达试验

按照如下方法进行：

将常规饲养只21日龄的AA肉鸡静脉注射20mg/kg体重的戊巴比妥溶液，采集肉鸡的肝脏和腹部脂肪组织，液氮速冻后，于-80℃冰箱保存。采用Western Blot技术检测肉鸡十二指肠、脾脏、肝脏和脂肪组织中TREM-B2的表达情况。

具体操作如下：

(1)采用Pierce公司的组织蛋白抽提试剂盒抽提肉鸡肝脏和腹脂重的蛋白质，并经BCA微量蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。配制浓度为15％的分离胶和5％的浓缩胶，上样量为30或50μg/孔。电泳条件：浓缩胶恒压120V，约20min；分离胶150V，通过预染蛋白Marker确定电泳停止时间。电泳完毕后采用湿转法进行转膜。

(2)转膜：取胶后将胶剪成适当大小并浸入转膜buffer中，将PVDF膜浸泡于甲醇1min后转入转膜buffer中，将滤纸也浸入转膜buffer中(PVDF膜和滤纸均剪成与胶相同大小)；用转膜buffer淋洗石墨电极，铺两张滤纸，滴少许转膜buffer；铺上膜，滴少许转膜buffer；铺上胶，再滴少许转膜buffer(注意不要产生气泡)；最后铺两张滤纸，滴少许转膜buffer；盖上电极，电压调至最大，以1.5mA/cm²凝胶体积转膜1.5h(负载电压不宜超过1V/cm²)。

(3)封闭：转膜完成后，将膜在1％酪蛋白-TBST溶液中室温孵育2h，以封闭膜上的非特异性结合位点。

(4)一抗孵育：将封闭过的膜加入1:5000稀释的实例3制备的鸡TREM-B2抗体，室温孵育10min后4℃过夜。

(5)二抗孵育：将一抗孵育完成后的膜利用TBST洗三次，每次5min(水平摇床上震荡)后，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG抗体(1:10000稀释)，室温孵育1h。

(6)显影：二抗孵育完成后利用TBST洗三次，每次5min(水平摇床上震荡)；然后将膜(转单白面)用ECL(Millipore公司)覆盖3-5min，然后再利用胶片扫描，曝光时间为1min；取出胶片，去离子水漂洗后晾干，标定Marker，分析实验结果，如图5所示，根据TREM-B2蛋白的预测分子量(约30kD)，本多克隆抗体能够用于Western blot方法检测肉鸡小肠、肝脏、脾脏和脂肪组织中TREM-B2的表达。

上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 四川农业大学

<120> 一种鸡髓样细胞触发受体B2多克隆抗体及其制备方法和应用

<130> 2018

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 106

<212> PRT

<213> 髓样细胞触发受体(Triggering receptor expressed on myeloid cells，TREMs)

<400> 1

Thr Pro Glu Ala Glu Met Ser Gln Gln Glu Gly Ser Thr Phe Ser Ile

1 5 1015

Gln Cys Pro Tyr Thr Thr Gln Pro Glu Asn Glu Gln Leu Lys Ala Trp

202530

Cys Arg Met Arg Asn Glu Arg Cys Gln Leu Glu Val Leu Thr Leu Asp

354045

Ser Val Gln Tyr Arg Tyr Ser Asp Arg Ala Met Gln Gly His Ile Thr

505560

Ile Lys Asp Tyr Asn Arg Thr Val Ser Ile Thr Met Ser Asp Leu Gln

65707580

Ala Glu Asp Ser Gly Ile Tyr Ser Cys Val Tyr Ser Ser Asn Tyr Val

859095

Pro Leu Lys Thr Ile Ser Leu Asn Val Tyr

100 105

<210> 2

<211> 318

<212> DNA

<213> 髓样细胞触发受体(Triggering receptor expressed on myeloid cells，TREMs)

<400> 2

acaccggaag cagaaatgag ccagcaagaa ggtagcacct ttagcattca gtgtccgtat 60

accacacagc cggaaaatga acagctgaaa gcatggtgtc gtatgcgtaa tgaacgttgt 120

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