一种高载量大孔径聚合物阳离子交换层析介质及其制备

摘要

本发明公开了属于聚合物层析介质制备及应用技术领域的一种高载量大孔径聚合物阳离子交换层析介质及其制备。该阳离子交换层析介质以聚丙烯酸酯类或聚苯乙烯类微球为基质，微球表面接枝乙烯基功能单体。其制备方法包括：将聚丙烯酸酯类或聚苯乙烯类微球在乙烯基功能单体溶液中进行溶胀处理；向溶胀处理后的微球中加入原子转移自由基聚合催化剂配体体系，进行接枝聚合反应，聚合反应完毕后，除去未反应单体，真空干燥，得到阳离子交换层析介质。制备的阳离子交换层析介质离子交换容量高、蛋白结合载量高、操作流速快，适合生物大分子的快速分离纯化。

说明书

技术领域

本发明属于聚合物层析介质制备及应用技术领域，具体涉及一种高载量大孔径聚合物阳离子交换层析介质及其制备。

背景技术

伴随生物制药技术的飞速发展，生物制药生产规模日益扩大，对其下游的分离纯化提出了新的挑战，发展快速高效的纯化方法是当务之急。其中分离介质是分离纯化技术的核心，目前常用的分离介质多以多糖为基质，该类介质由于本身质地软(耐压小于0.3MPa)、孔径尺寸小(30-50nm)等特点，在高通量的分离纯化应用中受到一定的限制。为了实现高通量的分离，以聚合物为基质的大孔层析介质成为人们不二的选择。大孔聚合物微球具有机械强度高(耐压可达10MPa)、孔径尺寸范围大(20-500nm)，因此可以在更高操作流速下进行分离，大大缩短了操作时间。但随着该类聚合物微球的孔径的增加，其比表面积出现了相应的下降，其比表面积常在10m²/g以下，导致单位体积介质的蛋白载量降低，因此该类大孔介质在实际分离纯化中难以兼顾高流速和高载量，最终无法实现真正的高通量。

为了解决上述问题，通常采用增加材料表面功能基团数量的方法，如公开文献(Journal of Chromatography A,2014，1343，109–118)报道了用含有多个功能基团(氨基)的大分子聚乙烯亚胺(PEI)修饰大孔聚丙烯酸酯类微球，通过氨基和微球表面的环氧基进行偶联反应，然后再采用过量具有双环氧的交联剂对其进行支化，支化完毕后，再采用过量的PEI进行键合，如此，经过3步反应，最终提高了微球表面的功能基数量，改善了介质的蛋白载量。该方法反应步骤多，且由于每步反应难以定量控制，故需要加入过量的反应试剂，造成一定量的浪费，增加了制备成本。因此，开发一种操作简便、能够准确控制材料表面功能基团数量的方法来提升介质的蛋白载量，是生化分离纯化领域中急需的技术。

发明内容

本发明的目的是提出一种高载量大孔径聚合物阳离子交换层析介质及其制备。具体技术方案如下：

一种高载量大孔径聚合物阳离子交换层析介质，以聚丙烯酸酯类或聚苯乙烯类微球为基质，微球表面接枝乙烯基功能单体。

所述聚丙烯酸酯类或聚苯乙烯类微球为聚丙烯酸酯或聚苯乙烯的改性产物、衍生产物或接枝共聚物。

所述聚丙烯酸酯类或聚苯乙烯类微球为甲基丙烯酸缩水甘油酯与二乙烯基苯的共聚微球、甲基丙烯酸缩水甘油酯与乙二醇二甲基丙烯酸酯的共聚微球、苯乙烯与二乙烯基苯的共聚微球、苯乙烯与乙二醇二甲基丙烯酸酯的共聚微球、乙二醇二甲基丙烯酸酯的自聚微球或二乙烯基苯的自聚微球。

所述聚丙烯酸酯类或聚苯乙烯类微球采用原子转移自由基聚合方法制备，所述微球的孔径尺寸为100-3000nm，粒径尺寸为20-200um，比表面积为5-200m²/g，操作压力达10MPa。

所述乙烯基功能单体为丙烯酸、2-丙烯酰氨基-2-甲基-1-丙磺酸、甲基丙烯酸和甲基丙烯磺酸钠中的一种或两种以上。

上述高通量大孔径聚合物阳离子交换层析介质的制备方法，包括如下步骤：

(1)将聚丙烯酸酯类或聚苯乙烯类微球在乙烯基功能单体溶液中进行溶胀处理；

(2)向溶胀处理后的微球中加入由无机卤化物和多齿胺类组成的原子转移自由基聚合催化剂配体体系，搅拌混合，进行接枝聚合反应，聚合反应完毕后，除去未反应单体及其他杂质，真空干燥，得到阳离子交换层析介质。

步骤(1)中所述溶胀处理的操作为：密封条件下，80～120rpm机械搅拌0.5～2h，期间充入高纯氮气进行保护。

步骤(1)中所述乙烯基功能单体为丙烯酸、2-丙烯酰氨基-2-甲基-1-丙磺酸、甲基丙烯酸和甲基丙烯磺酸钠中的一种或两种以上；

所述乙烯基功能单体溶液所用溶剂为二氧六环、甲醇、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺和去离子水中的一种或者两种以上；

所述溶剂的体积用量为所述微球质量的3～10倍，即微球质量：溶剂体积＝1:3～10(g/mL)。

步骤(2)中所述聚合反应的反应温度为30℃～80℃，反应时间为6～24h。

步骤(2)中所述无机卤化物为溴化亚铜、氯化亚铜中的一种或两种，其加入量为聚丙烯酸酯类或聚苯乙烯类微球质量的1/70～1/20倍；所述多齿胺类2,2-联二吡啶、四甲基乙二胺、N,N,N,’N,”N,”’-五甲基二亚乙基三胺和1,1,4,7,10,10’-六甲基三亚乙基四胺中的一种或两种以上，其加入量为无机卤化物质量的3倍。

步骤(2)中通过减压抽滤并用水洗涤来除去未反应单体及其他杂质；所述真空干燥的温度为40℃～60℃，时间为20～28h。

本发明的有益效果为：

(1)本发明为了提升聚丙烯酸酯类或聚苯乙烯类微球材料的蛋白载量，采用原子转移自由基聚合(ATRP)的方法引发乙烯基功能单体在聚丙烯酸酯类或聚苯乙烯类微球表面及内部孔道表面进行接枝聚合；聚丙烯酸酯类或聚苯乙烯类微可以采用原子自由基聚合方法制备，微球表面残留ATRP的引发剂基团(卤代物)，该类基团能够继续引发乙烯类单体进行聚合；接枝后的微球表面的离子交换基团数量增加，离子交换容量提高，增加了大孔微球的蛋白结合载量。聚丙烯酸酯类或聚苯乙烯类微球材料的孔径尺寸范围为100-3000nm，粒径尺寸为20-200um，比表面积范围为5-200m²/g，具有较高的机械强度和流体传质性能；材料表面及内部孔道表面接枝乙烯基功能单体后离子交换容量为1.2-4.0mmol/g，蛋白载量范围为48-234mg/mL介质，具有离子交换容量高、蛋白结合载量高、操作流速快的特点，作为阳离子交换层析介质适合应用于高通量分离纯化生物大分子，应用于色谱分离领域。

(2)采用的乙烯基功能单体为小分子单体，反应位阻小，能够完全扩散至多孔材料的孔道内部，解决了以往大分子位阻导致的材料孔道内部功能基团不均匀的问题；同时ATRP为一种活性/可控聚合方式，能够有效控制材料表面的接枝链长，从而可以准确控制材料表面及内部孔道表面的功能基团数量。

附图说明

图1为大孔径聚合物微球表面接枝共聚反应制备阳离子交换层析介质过程示意图。

图2为实施例1所得的聚合物微球改性前后的电子扫描显微镜照片，其中，A为改性前的微球，B为改性后的微球。

图3为实施例1所制备阳离子交换介质的前沿分析色谱图。

图4为实施例2所制备阳离子交换介质的前沿分析色谱图。

图5为实施例3所制备阳离子交换介质的前沿分析色谱图。

图6为实施例4所制备阳离子交换介质的前沿分析色谱图。

图7为实施例5所制备阳离子交换介质的前沿分析色谱图。

图8为实施例6所制备阳离子交换介质的前沿分析色谱图。

具体实施方式

以下实施例便于更好地理解本发明。

实施例1：高载量大孔径PGMA-EDMA阳离子交换层析介质

大孔聚合物微球表面接枝共聚反应制备阳离子交换层析介质过程示意图如图1。

高载量大孔径PGMA-EDMA阳离子交换层析介质的制备方法，包括如下步骤：

(1)大孔径聚甲基丙烯酸缩水甘油酯-乙二醇二甲基丙烯酸酯(PGMA-EDMA)微球(平均孔径128nm)在丙烯酸溶液中溶胀处理

准确称取PGMA-EDMA微球1.0g放入50mL的三口反应瓶中，然后加入丙烯酸的二甲基亚砜溶液3.0mL，100rpm机械搅拌下溶胀2.0h，溶胀处理期间充入高纯氮气进行保护。

(2)PGMA-EDMA微球表面接枝聚合丙烯酸

称取0.014g CuCl(1/70微球质量)和0.042g 2,2-联二吡啶(Bpy)(3倍CuCl质量)加入到步骤(1)溶胀处理后的微球中，保持温度30℃，在此温度下保持反应6h，反应结束后趁热，用G3砂芯漏斗进行减压抽滤，同时用500mL去离子水进行洗涤至微球无色。接枝后微球表面及孔道表面具有聚丙烯酸长链分子，由于该聚合物侧链带有大量的-COOH基团，因此可以直接用作弱阳离子交换层析介质。图2为本实施例所得的聚合物微球改性前后的电子扫描显微镜照片，其中，A和B分别为改性前后的聚合物微球。图3为本实施例所制备阳离子交换介质的前沿分析色谱图。

重量法测定微球表面聚丙烯酸的接枝量为108mg/g，测定其离子交换容量为1.20mmol/g，溶菌酶吸附载量为180mg/mL介质。

以重量法计算每克微球的接枝聚合的量，计算公式如下：

离子交换容量测定：将1.0g改性后微球装填于内径为10mm的玻璃层析柱中，分如下几步来进行离子交换容量测定：

1)用1.0mol/L的盐酸水溶液20mL进行洗涤，将介质转型为氢型；2)用去离子水洗涤至流出洗涤液为中性；3)准确量取50mL 0.1mol/L的氢氧化钠溶液加入层析柱中，任其自然滴下并收集该碱液；4)加入20mL 1.0mol/L的氯化钠水溶液，任其自然滴下，并收集同4)中的碱液合并；5)向4)中的收集液中加入两滴甲基橙指示剂，用0.1mol/L的盐酸溶液滴定合并收集液，计算介质的离子交换容量。

介质蛋白结合载量的测定：取适量阳离子交换层析介质装入色谱柱中(介质体积为1.0mL)，将装填好的色谱柱连接于液相色谱仪上，色谱条件如下：

样品浓度2mg/mL的溶菌酶溶液；泵头上样；流速1mL/min；流动相A pH＝7.0，50mM磷酸缓冲溶液；流动相B 1mol/L NaCl pH＝7.0 50mM磷酸缓冲溶液；首先以流动相A平衡色谱柱10个柱体积(CV)，然后泵头上样蛋白溶液至100％流穿，再以流动相B对吸附蛋白进行洗脱，记录相应的色谱图并根据流穿曲线计算介质的5％流穿值，得到介质的动态蛋白结合量。

记录5％穿透体积v5％，计算溶菌酶的动态吸附量，公式如下：

F，测试流速，mL/min；C，溶菌酶样品浓度，mg/mL；V，介质体积，mL。

实施例2：高载量大孔径PEDMA阳离子交换层析介质

高载量大孔径PEDMA阳离子交换层析介质的制备方法，包括如下步骤：

(1)大孔PEDMA微球(平均孔径687nm)在2-丙烯酰氨基-2-甲基-1-丙磺酸溶液中溶胀处理

准确称取PEDMA微球1.0g放入50mL的三口反应瓶中，然后加入2-丙烯酰氨基-2-甲基-1-丙磺酸的二甲基甲酰胺溶液5.0mL，100rpm机械搅拌下溶胀1.0h，溶胀处理期间充入高纯氮气进行保护。

(2)PEDMA微球表面接枝聚合2-丙烯酰氨基-2-甲基-1-丙磺酸

称取0.049g CuCl(1/20微球质量)和0.147g四甲基乙二胺(TMEDA)(3倍CuCl质量)加入到步骤(1)溶胀处理后的微球中，保持温度60℃，在此温度下保持反应24h，反应结束后趁热，用G3砂芯漏斗进行减压抽滤，同时用500mL去离子水进行洗涤至微球无色。接枝后微球表面及孔道表面具有聚2-丙烯酰氨基-2-甲基-1-丙磺酸长链分子，由于该聚合物侧链带有大量的磺酸基团，因此可以直接用作强阳离子交换层析介质。图4为本实施例所制备阳离子交换介质的前沿分析色谱图。

重量法测定微球表面聚2-丙烯酰氨基-2-甲基-1-丙磺酸的接枝量为416mg/g，测定其离子交换容量为1.9mmol/g，溶菌酶吸附载量为174mg/mL介质。接枝量、离子交换容量和溶菌酶吸附载量的测定方法同实施例1。

实施例3：高载量大孔径PSt-EDMA阳离子交换层析介质

高载量大孔径PSt-EDMA阳离子交换层析介质的制备方法，包括如下步骤：

(1)大孔PSt-EDMA微球(平均孔径2100nm)在甲基丙烯酸溶液中预处理

准确称取PSt-EDMA微球1.0g放入50mL的三口反应瓶中，然后加入甲基丙烯酸的二氧六环溶液10mL，100rpm机械搅拌下溶胀0.5h，溶胀处理期间充入高纯氮气进行保护。

(2)大孔PSt-EDMA微球表面接枝聚合甲基丙烯酸

称取0.016g CuCl(1/60微球质量)和0.048g N,N,N,’N,”N,”’-五甲基二亚乙基三胺(PMDETA)(3倍CuCl质量)加入到步骤(1)溶胀处理后的微球中，保持温度40℃，在此温度下保持反应10h，反应结束后趁热，用G3砂芯漏斗进行减压抽滤，同时用500mL去离子水进行洗涤至微球无色。图5为本实施例所制备阳离子交换介质的前沿分析色谱图。

接枝后微球表面及孔道表面具有聚甲基丙烯酸长链分子，由于该聚合物侧链带有大量的-COOH基团，因此可以直接用作弱阳离子交换层析介质。重量法测定微球表面聚甲基丙烯酸的接枝量为367mg/g，测定其离子交换容量为4.0mmol/g，溶菌酶吸附载量为228mg/mL介质。接枝量、离子交换容量和溶菌酶吸附载量的测定方法同实施例1。

实施例4：高载量大孔径PSt-DVB阳离子交换层析介质

高载量大孔径PSt-DVB阳离子交换层析介质的制备方法，包括如下步骤：

(1)大孔PSt-DVB微球(平均孔径3010nm)在甲基丙烯酸溶液中预处理

准确称取PSt-DVB微球1.0g放入50mL的三口反应瓶中，然后加入甲基丙烯酸的甲醇溶液10mL，100rpm机械搅拌下溶胀1.0h，溶胀处理期间充入高纯氮气进行保护。

(2)大孔PSt-DVB微球表面接枝聚合甲基丙烯酸

称取0.019g CuCl(1/50微球质量)和0.058g 1,1,4,7,10,10’-六甲基三亚乙基四胺(HMETETA)(3倍CuCl质量)加入到步骤(1)溶胀处理后的微球中，保持温度50℃，在此温度下保持反应15h，反应结束后趁热，用G3砂芯漏斗进行减压抽滤，同时用500mL去离子水进行洗涤至微球无色。接枝后微球表面及孔道表面具有聚甲基丙烯酸长链分子，由于该聚合物侧链带有大量的-COOH基团，因此可以直接用作弱阳离子交换层析介质。图6为本实施例所制备阳离子交换介质的前沿分析色谱图。

重量法测定微球表面聚甲基丙烯酸的接枝量为245mg/g，测定其离子交换容量为2.2mmol/g，溶菌酶吸附载量为48mg/mL介质。接枝量、离子交换容量和溶菌酶吸附载量的测定方法同实施例1。

实施例5：高载量大孔径PDVB阳离子交换层析介质

高载量大孔径PDVB阳离子交换层析介质的制备方法，包括如下步骤：

(1)大孔PDVB微球(平均孔径1203nm)在丙烯酸溶液中预处理

准确称取PDVB微球1.0g放入50mL的三口反应瓶中，然后加入丙烯酸的二甲基亚砜溶液10mL，100rpm机械搅拌下溶胀1.5h，溶胀处理期间充入高纯氮气进行保护。

(2)大孔PDVB微球表面接枝聚合丙烯酸

称取0.019g CuBr(1/50微球质量)和0.058g 1,1,4,7,10,10’-六甲基三亚乙基四胺(HMETETA)(3倍CuBr质量)加入到步骤(1)溶胀处理后的微球中，保持温度30℃，在此温度下保持反应20h，反应结束后趁热，用G3砂芯漏斗进行减压抽滤，同时用500mL去离子水进行洗涤至微球无色。接枝后微球表面及孔道表面具有聚丙烯酸长链分子，由于该聚合物侧链带有大量的-COOH基团，因此可以直接用作弱阳离子交换层析介质。图7为本实施例所制备阳离子交换介质的前沿分析色谱图。

重量法测定微球表面聚甲基丙烯酸的接枝量为256mg/g，测定其离子交换容量为2.9mmol/g，溶菌酶吸附载量为87mg/mL介质。接枝量、离子交换容量和溶菌酶吸附载量的测定方法同实施例1。

实施例6：高载量大孔径PGMA-DVB阳离子交换层析介质

高载量大孔径PGMA-DVB阳离子交换层析介质的制备方法，包括如下步骤：

(1)大孔PGMA-DVB微球(平均孔径978nm)在甲基丙烯磺酸钠溶液中预处理

准确称取PDVB微球1.0g放入50mL的三口反应瓶中，然后加入甲基丙烯磺酸钠的水溶液6mL，100rpm机械搅拌下溶胀0.5h，溶胀处理期间充入高纯氮气进行保护。

(2)大孔PGMA-DVB微球(平均孔径978nm)表面接枝聚合甲基丙烯磺酸钠

称取0.024g CuBr(1/40微球质量)和0.071g 1,1,4,7,10,10’-六甲基三亚乙基四胺(HMETETA)(3倍CuBr质量)加入到步骤(1)溶胀处理后的微球中，保持温度40℃，在此温度下保持反应24h，反应结束后趁热，用G3砂芯漏斗进行减压抽滤，同时用500mL去离子水进行洗涤至微球无色。接枝后微球表面及孔道表面具有聚甲基丙烯磺酸钠长链分子，由于该聚合物侧链带有大量的磺酸钠基团，因此可以直接用作强阳离子交换层析介质。图8为本实施例所制备阳离子交换介质的前沿分析色谱图。

重量法测定微球表面聚甲基丙烯磺酸钠的接枝量为356mg/g，测定其离子交换容量为2.0mmol/g，溶菌酶吸附载量为234mg/g介质。接枝量、离子交换容量和溶菌酶吸附载量的测定方法同实施例1。