基于硅藻DNA焦磷酸测序图谱解析的法医学溺死地推断方法

摘要

本发明属于法医学技术领域，具体涉及一种基于硅藻DNA焦磷酸测序图谱解析的法医学溺死地推断方法。本发明通过对溺死者肺组织中硅藻成分与可疑溺死地点水样中硅藻成分的DNA条码基因的焦磷酸测序图谱进行解析和比对，以推断溺死地点。本方法不依赖硅藻DNA条码基因的数据库信息，也不需要对硅藻群中每种硅藻成分进行种属识别和鉴定，而是直接对两硅藻群DNA提取物的DNA条码基因进行焦磷酸测序和图谱解析及比对，通过判断两图谱的一致性，以达到溺死地点识别的目的。本发明方法判断溺死地点准确且效率高。

说明书

技术领域

本发明属于法医学技术领域，具体涉及一种基于硅藻DNA焦磷酸测序图谱解析的法医学溺死地推断方法。

背景技术

硅藻在自然界中广泛存在，使之成为一个重要的生物学指标并被应用于法医学鉴定工作中，硅藻检验被认为是诊断溺死最具信息量的鉴定方式之一。通常认为，溺液中的硅藻可渗透肺泡并进入血液循环，进而扩散至外周组织。法医学家通过在溺死者的肺、肝、肾、骨髓等组织或残留物中显微镜检硅藻，籍以鉴别生前溺死和死后溺尸。而在实际案件中，除了回答是否溺死，还需回答尸体发现地点是否就是溺死发生的地点，并且需要进一步确认准确的溺死发生地点，尤其是发生过尸体转移，或当尸体是在陆地上发现的，或者由于水流等原因将尸体带离溺死实际发生地时。

硅藻的数量及种类会受到水体中所含矿物质、盐度、水体温度、流速等环境理化因素的影响。不同水体、同一水体的不同深度所含的硅藻数量和种类都有可能不同。国内外学者试图通过绘制“硅藻学地图”，即运用一定的技术手段鉴定不同水体、同一水体的不同位置或水层中所含有的硅藻种类及数量，并观察其季节性变化，以此来记录水体中硅藻群的常规图谱、季节性图谱或特异性硅藻图谱。硅藻学地图不仅具有生态学意义，也可以为法庭科学服务。溺死案件中，通过对可疑案发地点水体、土壤等所含硅藻的分类和计数，并且与溺死者组织样本中的硅藻群进行比较，可进一步判断溺水水域。非溺死案件中，通过犯罪现场取的水、土壤、衣物、鞋等样品中或检材上粘附的硅藻群之间的检验和比对，可辅助重建案件经过并还原案件发生过程。传统的硅藻鉴定方法主要依靠形态学方法，通过光学显微镜和电子显微镜观察硅藻形态、细胞壁纹理等对其进行种属鉴定。对于常见硅藻和形态学特征显著的硅藻，显微分类的确行之有效。但是对于一些微小、稀有和形态学特征类似的硅藻，显微分类方法的分类指标有限，无法精确确认硅藻种属。并且，即便是同一种硅藻，在生命周期的不同阶段，其大小和形状也可能不一致。可见，形态学检测方法并不是一种容易掌握的技术手段，它要求从业人员具有丰富的硅藻知识和检测经验。

随着分子生物技术的不断发展。各国学者对硅藻的遗传物质进行了大量的研究，积累了大量的数据并构建了数据库，Hebert等人于2003年提出DNA条码的概念并被广泛地应用于包括藻类在内的植物的分类学研究。硅藻的分子分类广泛采用单系硅藻培养、构建文库、以及Sanger测序为基础的检测体系。但Sanger测序对于测序模板的纯度要求较高，对于混合模板无法达到测序的效果。近年来，国内外学者利用二代测序技术进行环境样本的生物构成分析，但这一技术依赖于对硅藻群中每一种硅藻的精确种属鉴定，而种属鉴定的准确性有赖于硅藻DNA条码基因数据库中所纳入的硅藻种属序列信息的多少。当数据库中的信息不足时，没有被数据库覆盖的硅藻种类则无法鉴定，就会导致大量的分析错误甚至无法进行分析。有效规避数据库序列信息不足的缺点并能够实现溺死地点的推断是目前有待解决的问题。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供一种基于硅藻DNA焦磷酸测序图谱解析的法医学溺死地推断方法，目的是通过对溺死者肺组织中与可疑溺死地点水体样本中的硅藻群DNA条码基因rbcL基因的焦磷酸测序图谱进行解析和比对，以推断溺死地点。

实现本发明目的的技术方案按照以下步骤进行：

(1)提取溺死者肺组织中硅藻群DNA和可疑溺死地点水体样本中硅藻DNA；

(2)针对硅藻DNA条码基因即1，5-二磷酸核酮糖羧化酶大亚基基因rbcL基因(Ribulose-1，5-Bisphosphate Carboxylase/oxygenase Large subunit，rbcL)，设计种属特异性聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)引物，并分别对从溺死者肺组织与可疑溺死地点水体样本中提取的硅藻群DNA的rbcL基因进行PCR扩增，对PCR扩增得到的rbcL基因进行焦磷酸测序，分别获得溺死者肺组织中以及可疑溺死地点水体样本中硅藻rbcL基因的焦磷酸测序图谱；

(3)对焦磷酸测序图谱的峰高值进行解析，通过比对溺死者肺组织中以及对照水体样本的rbcL基因焦磷酸测序结果，推断溺死者肺组织中的硅藻是否来源于该水体样本，从而实现溺死地点的判断。

其中，所述的提取溺死者肺组织中以及可疑溺死地点水体样本中硅藻群DNA是对肺组织样本或水体样本离心沉淀物反复冻融，机械破碎后利用蛋白酶K直接消化，通过吸附柱回收硅藻混合DNA。

所述的硅藻rbcL基因PCR引物序列为：

上游引物rbcL-F(SEQ ID No.1)：5’-GGTAAATTAGAAGGTGATCCTTTA；

下游引物rbcL-R(SEQ ID No.2)：5’-GTRCCACCACCRAATTGTA，5’端标记有生物素，序列中的R代表A或G。

所述的焦磷酸测序引物rbcL-S序列为(SEQ ID No.3)：

5’-CCTTTAATGATTAAAGGTTTCT。

所述的用于焦磷酸测序的碱基分配顺序为(SEQ ID No.4)：

GAGCGACA GTCTGATCA GATAGTGACG TACATGTATACG T，该分配顺序可以最大限度地区分不同种属的硅藻，使得不同藻种所生成的焦磷酸图谱差异性最大化。

所述的对焦磷酸测序图谱的峰高值进行解析具体方法是：用可疑溺死地水体样本DNA的焦磷酸测序信号作为训练集即过完备的数据字典，溺死者肺组织样本硅藻群DNA的焦磷酸测序图谱峰高值直接以一列为一个样本的形式作为检测集；将训练集和检测集分别输入算法，输出结果为贡献系数和相关系数；其中，贡献系数表示字典中每一条条目对溺死者肺组织样本硅藻DNA焦磷酸测序信号贡献大小，相关系数r表示被识别为有贡献的信号叠加后的结果和真实测序情况之间的差异；对溺死者肺组织中硅藻来源贡献系数最大的可疑溺死地，即溺死者肺组织中的硅藻来源，从而实现溺死地点的判断。

与现有技术相比，本发明的特点和有益效果是：

通过对溺死者肺组织中与可疑溺死地点的水样中的硅藻成分的焦磷酸测序图谱进行解析和比对，以推断溺死地点，不依赖DNA条码基因数据库的信息，而是直接进行比对，判断溺死地点准确且效率高。

本发明方法中对溺死者肺组织中硅藻DNA的提取是进行反复冻融，机械破碎组织后利用蛋白酶K直接消化，通过吸附柱回收硅藻混合DNA，对于溺死者肺组织中的硅藻无需进行预分离从而避免了硅藻成分的丢失。

本发明方法中设计的用于焦磷酸测序的碱基分配顺序GAGCGACAGTCTGATCAGATAGTGACG TACATGTATACG T(SEQ ID No.4)，为最大限度地区分不同种属的硅藻，使得不同藻种所生成的焦磷酸图谱各不相同，因此需要综合考虑不同种属硅藻的特有序列(unique nucleotide sequence，UNS)以生成一段碱基分配顺序，使得不同藻种所生成的焦磷酸测序图谱的差异性最大化，进而也就使得不同溺死地点混合焦磷酸测序图谱差异最大化。

本发明方法中焦磷酸图谱解析方法是用可疑溺死地点水体样本硅藻DNA的焦磷酸测序信号作为训练集即过完备的数据字典，溺死者肺组织样本硅藻DNA的焦磷酸测序峰高值直接以一列为一个样本的形式作为检测集；将训练集和检测集分别输入算法，输出结果为贡献系数和相关系数；其中，贡献系数表示字典中每一条条目对溺死者肺组织样本测序信号贡献大小，相关系数r表示被识别为有贡献的信号叠加后的结果和真实测序情况之间的差异；对溺死者肺中硅藻来源贡献系数最大的可疑溺死地，即溺死者肺组织中的硅藻来源，从而实现溺死地点的判断。

附图说明

图1本发明溺死者肺组织样本及可疑溺死地点水体样本硅藻群DNA的焦磷酸测序图谱；

图中的横坐标为焦磷酸测序的碱基分配顺序，纵坐标为峰高值；

其中：a，c为溺死者肺组织样本的rbcL基因焦磷酸测序图谱，b，d，e，f为可疑溺死地点水样的rbcL基因焦磷酸测序图谱。

具体实施方式

以下通过对两例溺死者肺组织中的硅藻成分来源分析的具体实施方式对本发明进行详细的说明。

实施例所用仪器及试剂为：

a.仪器

不锈钢珠(QIAGEN，德国)；

Eppendorf Centrifuge 5427R离心机(Eppendorf，德国)；

TissueLyser II组织破碎仪(QIAGEN，德国)；

MDF-U53V医用超低温冰箱(SANYO，日本)；

TMS-200超级恒温混匀仪(杭州奥盛仪器有限公司，中国)；

Veriti Thermal Cycler PCR仪(Applied Biosystems，美国)；PyrosequencingQ96ID焦磷酸测序仪(Biotage AB，瑞典)；

Vacuum Prep Tool焦磷酸测序样本处理制备平台(Biotage AB，瑞典)；

Q96Plate Low焦磷酸反应板(Biotage AB，瑞典)；

恒温混匀仪(Eppendorf，德国)；

单模块金属浴(Thermo Fisher Scientific，美国)。

b.试剂

血液/细胞/组织基因组提取试剂盒(离心柱型，天根生化科技有限公司，中国)，包括：缓冲液GA，缓冲液GB，缓冲液GD，缓冲液GW，洗脱缓冲液TE，蛋白酶K，吸附柱CB3，收集管(2毫升)；

无水乙醇；

PCR反应试剂：Colorless Master Mix(Promega，美国)，无核酸酶水；

Gold Q96 Reagents(5X96)试剂盒(QIAGEN，德国)，包括：Enzyme Mixture，Substrate Mixture，dATP，dCTP，dGTP，dTTP；

链霉亲和素包被的琼脂糖珠(streptavidin sepharose)，GE医疗集团；

焦磷酸测序用结合缓冲液(binding buffer，1000毫升)：10毫摩尔Tris-Base(1.21克)，2摩尔NaCl(117.00克)，1毫摩尔EDTA(0.29克)，0.1％Tween 20(1毫升)，溶解于800毫升去离子水后以1摩尔盐酸溶液调节pH值至7.6，用去离子水补齐1000毫升；

焦磷酸测序用退火缓冲液(annealing buffer，1000毫升)：20毫摩尔Tris-Base(2.42克)，2毫摩尔四水合乙酸镁(0.43克)，溶解于去离子水后以4摩尔冰乙酸溶液调节pH值至7.6，用去离子水补齐至100毫升；

焦磷酸测序用washing buffer(1000ml)：10毫摩尔Tris-Base(1.2克)溶解于800毫升去离子水后以4摩尔冰乙酸溶液调节pH值至7.6，用去离子水补齐1000毫升；

焦磷酸测序用变性缓冲液0.2摩尔NaOH；

焦磷酸测序用70％乙醇。

实施例1：

本实施例的基于硅藻DNA焦磷酸测序图谱解析的法医学溺死地推断方法按照以下步骤进行：

(1)提取溺死者肺组织样本中硅藻DNA和可疑溺死地点水体样本中硅藻DNA；

取溺死者肺近肺门处组织200毫克，分别放入2毫升离心管中，另取4种可疑溺死地水样2毫升于2毫升离心管中，8000转/分钟离心15分钟，留沉淀，加入灭菌不锈钢珠，组织破碎仪25赫兹破碎5分钟，放入-80℃冷冻30分钟，取出融化，再冷冻，反复冻融3次，最后一次冷冻取出后组织破碎仪25赫兹破碎10分钟，12000转/分钟离心1分钟；

同样的方式提取可疑溺死地点水体样本中硅藻DNA；

利用改良的血液/细胞/组织基因组提取试剂盒(天根生化科技有限公司，中国)提取DNA，将其中消化组织的蛋白酶K的浓度提升至8毫克/毫升，用GA补齐使总消化体积为400微升。混匀仪56℃，1000转/分钟，消化6小时以上，短暂离心，之后按照试剂盒所给的实验步骤进行操作；

(2)针对硅藻DNA条码基因1，5-二磷酸核酮糖羧化酶大亚基基因(Ribulose-1，5-Bisphosphate Carboxylase/oxygenase Large subunit，rbcL)，设计种属特异性聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)引物进行PCR扩增，对PCR扩增得到硅藻rbcL基因进行焦磷酸测序，分别获得溺死者肺组织中以及可疑溺死地点水体样本中硅藻rbcL基因的焦磷酸测序图谱；

PCR扩增：

所述的硅藻rbcL基因PCR引物序列为：

上游引物rbcL-F：5’-GGTAAATTAGAAGGTGATCCTTTA(SEQ ID No.1)；

下游引物rbcL-R：5’-GTRCCACCACCRAATTGTA(SEQ ID No.2)，5’端标记有生物素，序列中的R代表A或G；

PCR扩增总体系50微升包含(GoTaq Colorless Master Mix:2微升；primers：0.2微摩尔；H₂O：21微升；DNA：2微升)；

PCR循环体系：预变性95℃，2分钟；40个循环(95℃，30秒；50℃，30秒；72℃，30秒)；终延伸72℃，5分钟；

焦磷酸测序：

所述的焦磷酸测序引物rbcL-S序列为：5’-CCTTTAATGATTAAAGGTTTCT(SEQ IDNo.3)，每管扩增产物中分别加入47微升结合缓冲液与3微升streptavidin sepharosebeads，取用前充分混匀；

将混合物置于恒温混匀仪上于室温1400转/分钟混匀20分钟以上；此时，开始准备焦磷酸反应板(Q96Plate)，在需要用到的孔中加入45微升退火缓冲液和2微升10微摩尔的测序引物(rbcL-S)；之后用Vacuum Prep Tool模板制备平台将混匀好的扩增产物液相抽去，吸附固相至其带有滤膜的探针表面，将该探针依次经过70％乙醇、0.2摩尔NaOH和清洗缓冲液处理；探针表面的液体完全抽干后，将探针悬停在之前准备好的反应板上方，关闭Vacuum Prep Tool的负压泵后将探针置于反应板中的液面下，稍加研磨使得固相充分混合与反应缓冲液内。将反应板置于金属加热块上以80℃加热2分钟，自然冷却至室温后便可放入焦磷酸测序仪中进行测序反应，并将Gold Q96 Reagents焦磷酸测序试剂中的酶混合物、底物混合物和各种碱基分别放入试剂舱的相应位置；

打开Q96软件，选取SQA模式，以碱基分配顺序(SEQ ID No.4)(GAGCGACAGTCT GATCAGATAGTGACGTACATGTATACGT)新建Entry并保存，新建一个Run进行测序，选取用到的检测孔并将其激活，将刚建好的Entry填到相应的检测孔中，对不同样本进行命名便可开始运行，运行结束后保存表格形式的峰高值数据和图谱形式的焦磷酸测序图；

(3)对焦磷酸测序图谱的峰高值进行解析

本实施例对焦磷酸测序图谱的峰高值进行解析是原理是：从过完备的(over-complete)的数据字典中尽可能少的挑选出一个或多个条目构成一个组合表示待拆解的输入信号。字典的构建需要对测序信号进行标准化，即将字典中样本的所有焦磷酸测序峰高值分别除以跨不同序列恒定出现的第一个相同碱基的峰高值，然后将待拆解样本的焦磷酸峰高值直接以一列为一个样本的形式作为检测集，将训练集和检测集分别输入算法，算法结果以贡献系数和相关系数的形式给出，其中贡献系数表示字典中每一条条目对溺死者肺组织样本测序信号贡献大小，相关系数r表示被识别为有贡献的信号叠加后的结果和真实测序情况之间的差异。

利用已知单一品系硅藻DNA的焦磷酸信号作为训练集，已知成分的混合硅藻DNA焦磷酸图谱作为测试集，来验证训练完成的算法，确定该算法能准确的识别混合硅藻样本中单一硅藻成分。

本实施例中用可疑溺死地水体样本硅藻DNA的焦磷酸测序信号作为训练集即字典，溺死者肺组织样本的焦磷酸测序图谱峰高值直接以一列为一个样本的形式作为检测集，将训练集和检测集分别输入算法。对溺死者肺组织中硅藻来源贡献系数最大的可疑溺死地水样，即溺死者肺中的硅藻来源，从而实现溺死地点的判断。

本实施例中检测了两例溺死者a和c肺组织中的硅藻来源，参见图1，可疑的溺死地分别为b、d、e、f，图1表示溺死者肺组织中硅藻与溺死地水样硅藻成分进行焦磷酸测序后的图谱，图谱中a，c与b，d与分别一致。

算法解析结果参见表3，表中数值为可疑溺死地水体样本硅藻成分对溺死者肺组织中的硅藻成分的贡献值，r为相关系数。溺死地b，溺死地d分别对溺死者a，溺死者c中的硅藻成分贡献值最高，这与已知的溺死地点相一致，也即溺死者肺中的硅藻成分与对应溺死地水样中硅藻成分匹配成功。证明本发明可以成功推断准确的溺死地点。

表3.焦磷酸图谱峰高值解析结果

溺死地b溺死地d溺死地e溺死地fr溺死者a26.41001.860.991溺死者c8.1619.8102.690.996

应当指出的是，上述说明并非是对本发明的限制，本发明也并不仅限于上述举例，本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内所做出的变化、改性、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川大学

霁, 张

<120> 基于硅藻DNA焦磷酸测序图谱解析的法医学溺死地推断方法

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<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

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<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 硅藻rbcL基因PCR上游引物

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ggtaaattag aaggtgatcc ttta 24

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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<223> 硅藻rbcL基因PCR下游引物，5'端标记有生物素，序列中的R代表A或G

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gtrccaccac craattgta 19

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<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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<223> 焦磷酸测序引物rbcL-S序列

<400> 3

cctttaatga ttaaaggttt ct 22

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 用于焦磷酸测序的碱基分配顺序序列

<400> 4

gagcgacagt ctgatcagat agtgacgtac atgtatacgt 40