一种3,4-二氢硫代嘧啶-2-酮共聚物结构的细胞紫外线防护剂及其制备方法与应用

摘要

本发明公开了一种3,4‑二氢硫代嘧啶‑2‑酮共聚物结构的细胞紫外线防护剂及其制备方法与应用。它的制备方法，包括如下步骤：(1)在无水有机溶剂中，将3,4‑二氢硫代嘧啶‑2‑酮类化合物和聚二乙醇甲基丙烯酸酯混合反应，得到组分A；(2)在惰性气氛中，将自由基引发剂与所述组分A混合，得到组分B，然后从所述组分B分离，即得到3,4‑二氢硫代嘧啶‑2‑酮共聚物结构的细胞紫外线防护剂，其结构如式I所示。

说明书

技术领域

本发明涉及一种3,4-二氢硫代嘧啶-2-酮共聚物结构的细胞紫外线防护剂及其制备方法与应用，属于高分子细胞紫外线防护剂领域。

背景技术

太阳光中的紫外线可引发皮肤晒黑，蜕皮，甚至皮肤癌等问题，使用防晒剂无疑是防止紫外线危害最直接有效的方法。目前常用的物理防晒剂通常在纳米尺寸，可经皮吸收渗透进入皮肤到达重要组织，对人体健康产生副作用；小分子化学防晒剂分散性能较差，耐热性以及光稳定性较低，应用于化妆品中抗水耐汗性能且对皮肤有刺激性，引起皮肤过敏。高分子防晒剂在用于化妆品时可避免向皮肤的渗透，增强了防晒的安全性和防晒效率，所以高分子防晒剂有着很好的应用前景。目前的方法主要是以二苯酮类，三嗪类，苯并三唑类等多种小分子防晒剂为单体，接枝到水溶性好，无毒，并已经广泛应用于化妆品中的聚乙二醇、聚乙二醇单甲醚等水溶性高分子骨架上，得到一系列具有水溶性，生物安全性的防晒剂。

发明内容

本发明的目的是提供一种3,4-二氢硫代嘧啶-2-酮共聚物结构的细胞紫外线防护剂及其制备方法与应用，本发明的制备方法分别以不同的3,4-二氢硫代嘧啶-2-酮类化合物和聚二乙醇甲基丙烯酸酯(PEGMA)在自由基引发剂引发下进行自由基聚合，得到水溶性良好的3,4-二氢硫代嘧啶-2-酮类共聚物，该聚合物在细胞实验中体现出良好的细胞安全性和抗紫外损害效果。

本发明提供的一种化合物，其结构式如式I所示：

所述式I中，R₁、R₂为氢原子、碳原子为1-3的烷基、碳原子为1-3的烷氧基和酚羟基中的至少一种；R₃为氢原子和C1-C10的烷基中的至少一种；m为大于20的整数，n为大于20的整数，x为市售乙二醇的重复单元数。

本发明中，所述式I所示的化合物中，m表示3,4-二氢硫代嘧啶-2-酮类化合物的聚合度，设计值大于20，具体可为21～30、21～50或21～100；n表示PEGMA的聚合度，设计值大于20，具体可为21～30、21～50或21～100，m、n的数值具体可根据需要合成的化合物分子量调节，m:n比例具体可为1:1～10；x为市售PEG(乙二醇)的重复单元数，具体数值可为19～20。

本发明还提供了上述化合物的制备方法，包括如下步骤：(1)在无水有机溶剂中，将3,4-二氢硫代嘧啶-2-酮类化合物、聚二乙醇甲基丙烯酸酯和自由基引发剂混合反应，得到组分A；

(2)排除组分A体系中的空气，然后反应得组分B，从所述组分B分离，即得到所述化合物。

上述的制备方法中，所述3,4-二氢硫代嘧啶-2-酮类化合物和所述聚二乙醇甲基丙烯酸酯的摩尔比可为1:0.5～10，具体可为1:1、1:0.5～1、1:1～10或1:0.5～5；

所述步骤(1)中反应的时间可为10～20min；

所述自由基引发剂与所述3,4-二氢硫代嘧啶-2-酮类化合物的摩尔比可为0.01～1：1，具体可为0.04:1、0.01～0.04：1、0.04～1：1或0.01～0.5：1；

所述步骤(2)中反应的温度可为50～100℃，具体可为70℃，通过油浴方式进行，反应的时间可为6～20h，具体可为12h；

通惰性气体鼓泡或进行三次液氮冷冻-抽真空-解冻循环操作排除所述组分A中的空气；

所述惰性气体的鼓泡时间为15～30min，流速可为10～100mL/min，具体可为20mL/min。

上述的制备方法中，所述3,4-二氢硫代嘧啶-2-酮类化合物具体结构如式II所示：

所述式II中，R₁、R₂为氢原子、烷基、烷氧基和酚羟基中的至少一种，R₃为氢原子和C1-C10的烷基中的至少一种；所述式II中R₁、R₂、R₃均与式I一一对应；

所述无水有机溶剂为二氧六环、四氢呋喃、N，N-二甲基苯甲酰和乙腈中的至少一种；

所述聚二乙醇甲基丙烯酸酯的平均分子量为300～2500；所述聚二乙醇甲基丙烯酸酯简称PEGMA，来源于市售产品；

所述惰性气氛为氮气或氩气；

所述自由基引发剂包括偶氮类引发剂和/或过氧化物引发剂；所述偶氮类引发剂选自偶氮二异丁腈(简称AIBN)、偶氮二异庚腈(简称ABVN)，所述过氧化物引发剂选自过氧化二苯甲酰(简称BPO)。

本发明中，制备所述3,4-二氢硫代嘧啶-2-酮类化合物的方法按照如下步骤：

在无水有机溶剂中，将芳香醛、乙酰乙酸基甲基丙烯酸乙酯、原料1与卤化镁和有机酸混合得到组分A，继续反应得到组分B，然后从所述组分B分离，即得到3,4-二氢嘧啶-2-酮类功能单体；

所述原料1的结构式如式III所示，

式III中，R₃为C原子数为1-3的烷基，Y为O或S原子。

本发明中，制备所述3,4-二氢硫代嘧啶-2-酮类化合物方法中，所述芳香醛、所述乙酰乙酸基甲基丙烯酸乙酯和所述原料1的摩尔比可为1：1：1.5～3.0；

本发明中，制备所述3,4-二氢硫代嘧啶-2-酮类化合物方法中，所述卤化镁与所述芳香醛的摩尔比可为0.1～1：1；

所述有机酸与所述卤化镁的摩尔比可为1：1.0～5.0；

得到所述组分B反应的温度可为50～100℃，具体可为100℃或60～100℃，反应时间可为2～10h，具体可为2h、2～5h或2～8h。

分离得到所述3,4-二氢嘧啶-2-酮类功能单体的操作如下：将所述组分B倒入冷水中，依次进行超声洗涤、离心、过滤，然后收集滤渣，将所述滤渣用低极性有机溶剂清洗至少1次，最后冷冻干燥。

本发明中，制备所述3,4-二氢硫代嘧啶-2-酮类化合物方法中，所述超声洗涤的时间可为20～40min；

所述滤渣清洗的次数可为2～3次，具体可为2次。

上述的制备方法中，所述步骤(2)中分离得到所述化合物的操作如下：

将所述组分B滴加到快速搅拌的低极性有机溶剂中，过滤，收集滤渣，用所述无水有机溶剂清洗所述滤渣，然后冷冻干燥，即得。

上述的制备方法中，所述低极性有机溶剂为乙醚、石油醚和正己烷中的至少一种；

所述快速搅拌的速度为500～1000r/min；

所述冷冻干燥的温度为-20～-50℃，真空度为0.1～30Pa。

本发明还提供了一种3,4-二氢硫代嘧啶-2-酮共聚物结构的细胞紫外线防护剂，其为上述式I所示的所述化合物。

本发明所述3,4-二氢硫代嘧啶-2-酮共聚物结构的细胞紫外线防护剂应用于在紫外线防护剂制备中。

本发明进一步提供了一种对细胞进行紫外线防护的测试方法，包括如下步骤：1)将所述3,4-二氢硫代嘧啶-2-酮共聚物结构的细胞紫外线防护剂配置成水溶液，然后与细胞培养基混合，得到水溶液培养基；

2)将细胞分别置于上述步骤1)中配置的水溶液培养基和细胞培养基中培育，然后采用紫外灯照射后，重新换成新的浓度相同的所述水溶液培养基和所述普通培养基中培养；

3)取步骤2)中所述水溶液培养基和所述普通培养基中分别培养的细胞染色，采用激发光激发，然后用荧光显微镜观察细胞染色情况，即能得到对细胞进行紫外线防护的测试情况。

上述的测试方法中，所述3,4-二氢硫代嘧啶-2-酮共聚物结构的细胞紫外线防护剂在所述水溶液培养基中的浓度可为0～20mg/mL，且不为零，具体可为10mg/mL、10～20mg/mL、0～10mg/mL或5～15mg/mL；

所述紫外灯照射的时间可为5～20分钟，具体可为15分钟；

步骤2)中紫外灯照射细胞前后培育的时间均可为12～48h，具体可为24h。

上述的测试方法中，所述细胞可为A-375细胞；所述细胞培养基具体可为DMEM培养基；

上述的测试方法中，步骤3)中采用二乙酸荧光素和/或碘化丙啶的磷酸缓冲液进行染色；所述二乙酸荧光素和/或碘化丙啶的磷酸缓冲液的浓度具体均可为1～10微克/毫升，具体可为3微克/毫升；

当所述二乙酸荧光素染色活细胞时，采用450-490纳米的蓝光激发；

当碘化丙啶的磷酸缓冲液染色死细胞时，采用515-560纳米的绿光激发。

本发明中，所述步骤2)中细胞具体铺入四块96孔板中，然后分为两组，分别加入普通培养基(A)和含聚合物的培养基(B)后放置于培养箱中培育；

本发明中，所述步骤3)中还包括将96孔板中培养基去掉，磷酸缓冲液洗涤三次，然后加入溶有二乙酸荧光素和/或碘化丙啶的磷酸缓冲液加入96孔板中。

本发明所述3，4-二氢硫代嘧啶-2-酮共聚物结构的细胞紫外线防护剂的结构式具体可为如式IV所示的化合物：

其数均分子量M_n＝8.85×10⁴g>-1，重均分子量M_w＝15.40×10⁴g>1，分子量分布系数为1.74。

本发明具有以下优点：

本发明的方法分别以不同的3,4-二氢硫代嘧啶-2-酮类化合物和聚二乙醇甲基丙烯酸酯(PEGMA)在自由基引发剂引发下进行自由基聚合，得到水溶性良好的3,4-二氢硫代嘧啶-2-酮类共聚物，该聚合物在细胞实验中体现出良好的细胞安全性和抗紫外损害效果。

附图说明

图1为本发明3,4-二氢硫代嘧啶-2-酮共聚物的合成路线图；

图2为参考例1中合成的3,4-二氢硫代嘧啶-2-酮化合物的氢核磁谱图(¹H-NMR)；

图3为本发明实施例1中所合成的3,4-二氢硫代嘧啶-2-酮共聚物的氢核磁谱图(¹H-NMR)；

图4为本发明实施例1中所合成的3,4-二氢硫代嘧啶-2-酮共聚物的凝胶渗透色谱(GPC)；

图5为本发明实施例2中A1板的细胞荧光染色照片(无紫外照射)，其中图5(a)为二乙酸荧光素染色的活细胞照片，图5(b)为碘化丙啶磷酸缓冲液染色的死细胞照片；

图6为本发明实施例2中A2板的细胞荧光染色照片(紫外照射后)，其中图6(a)为二乙酸荧光素染色的活细胞照片，图6(b)为碘化丙啶磷酸缓冲液染色的死细胞照片；

图7为本发明实施例2中B1板的细胞荧光染色照片(无紫外照射)，其中图7(a)为二乙酸荧光素染色的活细胞照片，图7(b)为碘化丙啶磷酸缓冲液染色的死细胞照片；

图8为本发明实施例2中B2板的细胞荧光染色照片(紫外照射后)，其中图8(a)为二乙酸荧光素染色的活细胞照片，图8(b)为碘化丙啶磷酸缓冲液染色的死细胞照片。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明。

下述实施例中所使用的氮气均为质量浓度≥99.999％的高纯气体；其它所使用的化学试剂如无特殊说明，均通过常规商业途径获得。

参考例1、制备3,4-二氢硫代嘧啶-2-酮类化合物包括如下步骤：

1)10mL反应瓶中加入1.06g苯甲醛、2.14g乙酰乙酸甲基丙烯酸乙二醇酯(AEMA)和1.35g甲基硫脲、0.02g无水氯化镁和1.5mL醋酸作为溶剂，置于100℃油浴中反应。

2)将步骤1)中反应2h的混合液倒入去离子水中沉淀、过滤得到滤渣，以离子水和乙醚/石油醚(1:4)混合溶剂分别超声洗涤两次，过滤得到白色固体，-50℃冷冻干燥24h，得到3.6g白色粉末状3,4-二氢硫代嘧啶-2-酮类单体(即3,4-二氢硫代嘧啶-2-酮类化合物)，分别进行¹H-NMR表征，其结构如式I所示,其中R₁、R₂均为氢原子R₃为甲基。

由图2可知，所得3,4-二氢硫代嘧啶-2-酮化合物在核磁谱图上与其结构特征峰一一对应，说明产物十分纯净，无其它杂质。

实施例1、3,4-二氢硫代嘧啶-2-酮化合物与PEGMA共聚反应合成3,4-二氢硫代嘧啶-2-酮共聚物

在10mL反应瓶中加入0.42g(1mmol)的3,4-二氢硫代嘧啶-2-酮化合物、0.95g(1mmol)PEGMA(平均分子量为950g>-1)、10.0mg(0.04mmol)偶氮二异庚腈(ABVN)和1.5mLN,N-二甲基甲酰胺(DMF)作为溶剂，加入磁子，搅拌均匀。反应瓶通氮气(流速为20mL/min)，鼓泡15min或进行三次液氮冷冻-抽真空-解冻循环操作，除出体系中的空气。将反应瓶放于70℃的恒温油浴中，反应12h后逐滴加入到快速搅拌(转速为800r/min)的乙醚中沉淀，过滤，收集滤渣，加入乙醚洗涤三次后得聚合物，-50℃冷冻干燥24h后得到1.20g共聚物(即3,4-二氢硫代嘧啶-2-酮共聚物结构的细胞紫外线防护剂)，结构式如式IV所示，进行¹H-NMR和GPC表征。

由图3可知，共聚物的氢核磁谱中包含了3,4-二氢硫代嘧啶-2-酮化合物和PEGMA两种单体的特征峰：化学位移为9.82、7.30-7.00、5.09ppm处的峰分别归属3,4-二氢硫代嘧啶-2-酮化合物中硫代嘧啶酮环中N-H、苯环、硫代嘧啶酮与苯环相连H的峰；化学位移在3.45-3.80和3.30ppm处的峰分别归属于PEGMA中醚键和端甲基，证明了发生了共聚反应。

由图4可知，采用合成得到的聚合物分子量分布呈典型的正态分布，GPC测试结果为：数均分子量M_n＝8.85×10⁴g>-1，重均分子量M_w＝15.40×10⁴g>1，分子量分布系数为1.74。

实施例2、3,4-二氢硫代嘧啶-2-酮共聚物作为细胞用抗紫外线剂的实验

1)将A375细胞密度为每毫升5×10⁵个细胞铺入四个96孔板中，分为A和B两组，命名为A1、A2板和B1和B2板。A1和A2中加入普通市售DMEM培养基，B1和B2板中加入溶有10毫克/毫升本发明实施例1中制备的共聚物的培养基(以市售DMEM培养基为溶剂制备)，全部放置于培养箱中(37摄氏度；5％二氧化碳)培育24小时。

2)24小时后，将A2板和B2板分别在紫外灯下照射15分钟，A1和B1板不照射，将培养基换成新的相同浓度的培养基。继续放入培养箱中培养。24小时后将96孔板中培养基去掉，磷酸缓冲液洗涤三次。

3)在所有板加入溶有3微克/毫升二乙酸荧光素和3微克/毫升碘化丙啶的磷酸缓冲液，分别用450-490纳米的蓝光和515-560纳米的绿光进行激发，在荧光显微镜观察细胞染色情况，A1、A2和B1、B2板的照片分别如图5、6、7、8所示(绿色代表活细胞，红色代表死细胞)。

由上述图5-8中A1和B1可知，未经紫外线照射的情况下，溶有3,4-二氢硫代嘧啶-2-酮共聚物的培养基与普通培养基一样，细胞存好良好，说明该共聚物对细胞无明显毒性；由A1和A2可知，经过紫外线照射，普通培养基培养的细胞经紫外线照射大量凋亡(红色明显增多)；由B1和B2可知，溶有3,4-二氢硫代嘧啶-2-酮共聚物的培养基可以起到良好的细胞防紫外线作用，细胞在紫外线照射后仍然存活较好，证明了本发明3,4-二氢硫代嘧啶-2-酮共聚物结构的细胞紫外线防护剂确实具有良好的细胞抗紫外线效用，可被用于细胞紫外线防护剂。