一种电荷驱动自组装壳聚糖基载药纳米粒子的制备方法

摘要

本发明公开了一种电荷驱动自组装壳聚糖基载药纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：（1）通过氨基PEG诱导的谷氨酸苄酯‑N‑羰基环内酸酐，形成PEG和聚谷氨酸苄酯的嵌段共聚物，该嵌段共聚物在碱性条件下水解，去除聚谷氨酸苄酯端的苄基，形成PEG‑PGA嵌段共聚物；（2）壳聚糖基阿霉素前药制备；（4）电荷驱动自组装纳米粒子制备。本发明制备载阿霉素壳聚糖基纳米粒子的策略选用的材料是已经被普遍证明具有较好的生物相容性PEG和PGA材料，形成壳聚糖纳米粒子的策略具有较好的生物相容性和生物医用前景。

说明书

技术领域

本发明属于功能材料制备领域，具体是指电荷驱动自组装壳聚糖基载药纳米粒子的制备方法。

背景技术

壳聚糖（CS）是一种带正点的天然聚合物多糖，具有无毒、可降解、生物相容性好、低免疫原性等特点，可作为生物医用材料。由于其带正点的性质，它可以作为带负电的DNA、RNA以及其他生物大分子递送材料。也有研究指出，壳聚糖具有和透明质酸类似的靶向CD44（肿瘤组织中高表达因子）的功能。 另外，与许多纳米粒子不同，壳聚糖修饰的纳米粒子细胞内吞后，主要分布于细胞核，这更有利于对抗肿瘤药物的递送。因为多数的抗肿瘤药物（如阿霉素、紫杉醇等）均是通过影响DNA的复制，影响肿瘤细胞分裂，从而抑制肿瘤细胞的生长。因而，壳聚糖基纳米粒子在抗肿瘤药物的靶向递送中具有重要的应用前景。

尽管壳聚糖在抗肿瘤药物的递送中具有较好的特性，但是多数的壳聚糖纳米粒子的制备是在乳化或微乳化的环境中用京尼平或戊二醛交联的策略。这种策略带来了有机溶剂和交联剂（戊二醛或京尼平）在纳米粒子中残留的风险。戊二醛具有较大的生物毒性，容易带来健康风险，不适合在生物材料中大量应用。尽管京尼平被认为是一种比较安全的交联，但大量残留，也容易带来健康风险。

发明内容

本发明第一个目的是提供一种电荷驱动自组装壳聚糖基载药纳米粒子的制备方法，该方法利用电荷相互作用，在水系的溶剂体系中自组装形成纳米粒子，不适用交联剂，降低了溶剂残留风险。

为实现本发明的第一个目的，其技术方案是包括以下步骤：

（1）通过氨基PEG诱导的谷氨酸苄酯-N-羰基环内酸酐，形成PEG和聚谷氨酸苄酯的嵌段共聚物，该嵌段共聚物在碱性条件下水解，去除聚谷氨酸苄酯端的苄基，形成PEG-PGA嵌段共聚物；

（2）称取阿霉素盐酸溶液和多肽各1mmol溶于50ml的氮氮二甲基甲酰胺，加入N，N-二异丙基乙胺2mmol，磁力搅拌，加入HATU溶液，室温避光搅拌，然后将反应置于-20℃条件下使反应停止，透析袋内透析，产物冷冻干燥，得到阿霉素多肽衍生物（DOX-PEP-NH-Fmoc）；

（3）将步骤2合成产物加入20%哌啶、室温搅拌5min，迅速置于冷却液中，加丁二酸酐，待颜色变化后放置于室温反应10 min，乙醚沉淀， 1离心10min，去除DOX-PEP-NH-Fmoc产物的Fmoc保护基团，调节PH值至6.95，并用透析袋内透析去除小分子副产物，冷冻干燥，制备得到DOX-PEP-CONH-CH₂-CH₂-COOH；称取DOX-PEP-CONH-CH₂-CH₂-COOH溶于DMF中，超声5min，加入1-乙基-3，3-二甲基-氨丙基碳化二亚胺（EDC）和4-二甲氨基吡啶(DMAP),震荡混匀，超声10min，将混合溶液在磁力搅拌下逐渐滴加到含壳聚糖的2-(N-吗啡啉）乙磺酸溶液中，常温过夜反应，用透析袋透析，干燥得到壳聚糖-多肽-阿霉素衍生物（DOX-PEP-CS）；

（4）电荷驱动自组装壳聚糖基载药纳米粒子制备：

将步骤（3）所制备的DOX-PEP-CS溶于2-(N-吗啡啉）乙磺酸缓冲液 ，2-(N-吗啡啉）乙磺酸缓冲液的pH 5.0，在剧烈搅拌下加入步骤（1）的PEG-PGA嵌段共聚物，即可得到形成载阿霉素壳聚糖基纳米粒子。

进一步设置是所述步骤（1）为：取谷氨酸苄酯-N-羰基环内酸酐 1.2克溶于20 mL无水氮氮二甲基甲酰胺中，并与氨基PEG混合在氮气保护下反应温度38℃反应48小时，透析得到PEG和聚谷氨酸苄酯的嵌段共聚物，并在NaOH的作用下去除苄基，形成PEG-PGA嵌段共聚物。

进一步设置是所述的步骤（4）的PEG-PGA嵌段共聚物的加入量与DOX-PEP-CS的质量比为质量比为（0.25:1-1.5:1）。

本发明的创新机理是：

我本申请发明人合成了一段含聚乙二醇和聚谷氨酸（PEG-PGA）的嵌段共聚物。由于多肽具有两性解离的性质，其在pH大于或小于等电点的溶液环境中会发生电荷转换。当溶液pH值小于其等电点时候呈正点，溶液pH值大于等电点时候带负点。聚谷氨酸片段的等电点小于3，因此其在pH值大于5的情况下带负点。基于此，本申请发明人利用电荷相互作用，使壳聚糖和PEG-PGA在缓冲液中自组装形成纳米粒子的策略。通过调控嵌段共聚物的含量，可以便捷调整纳米粒子的大小和电位，实现壳聚糖基纳米粒子的可控自组装。这种策略在水系环境中自组装形成纳米粒子，不使用交联剂和微乳化的溶剂体系，降低了有机试剂使用和交联剂残留的风险。这种体系不同于已报道的利用PEG和聚丙烯酰胺基甲基丙磺酸盐阴离子（PAMPs）的策略，这种聚阴离子体系，生物相容性较差，可能存在较大的健康风险。我们制备壳聚糖纳米粒子的策略选用的材料是已经被普遍证明具有较好的生物相容性PEG和PGA材料，形成壳聚糖纳米粒子的策略具有较好的生物相容性和生物医用前景。

本发明的优点是：

（1）壳聚糖是链状多糖，制备壳聚糖纳米粒子需要在微乳化的溶剂体系中形成纳米粒子，容易造成有机溶剂和交联剂残留的风险。本发明利用电荷相互作用，在水系的溶剂体系中自组装形成纳米粒子，不使用交联剂，降低了溶剂残留风险。

（2）本发明制备载阿霉素壳聚糖基纳米粒子的大小和电位可控。

（3）本发明制备载阿霉素壳聚糖基纳米粒子的策略选用的材料是已经被普遍证明具有较好的生物相容性PEG和PGA材料，形成壳聚糖纳米粒子的策略具有较好的生物相容性和生物医用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，根据这些附图获得其他的附图仍属于本发明的范畴。

图1 本发明的制备工艺路线图；

图2本发明所制备的PEG-PGA的嵌段共聚物分子结构表征图；

图3本发明所制备的纳米粒子的粒径和电位与PEG-PGA嵌段共聚物的浓度之间的关系图；

图4 不同浓度的PEG-PGA嵌段共聚物粒径和电位测定代表性图；

图5 本发明所制备的纳米粒子形貌观察图；

图6 载药阿霉素（DOX）纳米粒子抑制肿瘤细胞活性的测试图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。

本发明实施例中所涉及的物料的英文简称的中文说明：

MES 表示 2-(N-吗啡啉）乙磺酸；

HATU是一种医药中间体，同时是一种常用的多肽缩合试剂，应用在羧基与氨基合成肽键的反应之中。其系统命名为2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯；

PEG 表示聚乙二醇；

PGA表示聚谷氨酸；

PEG-PGA表示聚乙二醇和聚谷氨酸的嵌段共聚物；

Dox•HCl表示阿霉素盐酸溶液；

PEP表示多肽；

DMF表示氮氮二甲基甲酰胺；

DIPEA表示N，N-二异丙基乙胺；

DOX-PEP-NH-Fmoc表示 阿霉素多肽衍生物；

DOX-PEP-CONH-CH₂-CH₂-COOH表示羧基末端阿霉素多肽衍生物；

CS表示壳聚糖；

EDC表示1-乙基-3，3-二甲基-氨丙基碳化二亚胺；

DMAP表示4-二甲氨基吡啶；

实施例1

本发明实施例包括以下步骤：

（1）PEG-PGA 两性解离共聚物制备：

通过氨基PEG诱导的谷氨酸苄酯-N-羰基环内酸酐，形成PEG和聚谷氨酸苄酯的嵌段共聚物，该共聚物在碱性条件下水解，去除聚谷氨酸苄酯端的苄基，形成PEG-PGA的嵌段共聚物。合成示例如下：取谷氨酸苄酯-N-羰基环内酸酐 1.2克溶于20 mL干氮氮二甲基甲酰胺中，并与氨基PEG混合在氮气保护下反应38度反应48小时。透析得到PEG和聚谷氨酸苄酯的嵌段共聚物，并在NaOH的作用下去除苄基，形成PEG-PGA嵌段共聚物。参见图2所述，可确认PEG-PGA嵌段共聚物已经成功合成，其分子结构式为：

。

（2）壳聚糖基阿霉素前药制备

称取阿霉素盐酸溶液（Dox•HCl）和多肽（PEP） 1mmol溶于50ml的DMF，加入N，N-二异丙基乙胺（DIPEA）2mmol，磁力搅拌，加入HATU溶液，室温避光搅拌，然后将反应置于-20℃条件下使反应停止，透析袋内透析，产物冷冻干燥，得到DOX-PEP-NH-Fmoc产物； 加入20% 哌啶室温搅拌5min，迅速置于冷却液中，加丁二酸酐，待颜色变化后放置于室温反应10 min，乙醚沉淀， 1离心10min，去除DOX-PEP-NH-Fmoc产物的Fmoc保护基团，调节PH值至6.95，并用透析袋内透析去除小分子副产物，冷冻干燥，制备得到DOX-PEP-CONH-CH₂-CH₂-COOH；称取DOX-PEP-CONH-CH₂-CH₂-COOH溶于DMF中，超声5min，加入EDC和DMAP,震荡混匀，超声10min，将混合溶液在磁力搅拌下逐渐滴加到含CS的MES溶液中，常温过夜反应，用透析袋透析，干燥称量得到DOX-PEP-CS。

（3）电荷驱动自组装壳聚糖基载药纳米粒子制备：

将壳聚糖基前药溶于MES缓冲液 （pH 5.0），在剧烈搅拌下加入不同量(0.25:1-1.5:1)的PEG-PGA嵌段共聚物，形成复合纳米粒子，测定粒径、电位、形貌和热力学性质。

由图3 和图4 可知我们可以通过调节共聚物的浓度（0.25-1.5 mg/mL）使粒子大小从920 nm变化到371 nm，zeta电位从52.7 mV变化到41.5 mV。

由图6可知，载DOX后，该纳米粒子能够增加药物对肿瘤细胞的毒性，降低对正常细胞的毒性。

以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。