一种酶活提高的羧甲基纤维素酶突变体

摘要

本发明公开了一种酶活提高的羧甲基纤维素酶突变体，属于酶工程技术领域。本发明通过定点突变的方式，将羧甲基纤维素酶分子内部将第31位缬氨酸替换为谷氨酸，和/或将第135位甲硫氨酸替换为赖氨酸，显著提高了菌株表达羧甲基纤维素酶的酶活力，改造后的菌株产酶能力显著提高，酶活力提高至83.27U/mL～94.32U/mL，复合突变菌株pET‑22b(+)‑cmc‑V31E/M135K酶活提高最为显著，153.92U/mL，较出发菌株提高了1.71倍，突变体在碱性条件下的pH稳定性也有所提高。

说明书

技术领域

本发明涉及一种酶活提高的羧甲基纤维素酶突变体，属于酶工程技术领域。

背景技术

羧甲基纤维素酶可作为水解酶加入预处理后的木质纤维素材料中，将纤维素酶分解成可发酵的单糖。未来随着生物燃料的商业化生产，酶的需求量将大大增加。然而，现今的商业酶不仅活力低而且价格贵，难以实现工业化应用。所以通过筛选出纤维素酶产量高，具有较高酶活性的纤维素菌株，是降低生物燃料成本的有效手段。现今，大多数的纤维素酶都是从真菌中获得，从真菌中获得的纤维素酶产量高、活性高，并且其作为胞外酶易于分离和提取。

目前报道的多数羧甲基纤维素酶表达量低，易形成包涵体。因此，筛选一种酶活较高并能高效表达的羧甲基纤维素酶对于工业化生产羧甲基纤维素酶，及运用羧甲基纤维素酶调节生物机体健康状况具有重要意义。

发明内容

本发明所要解决的问题是提供一种酶活力提高的羧甲基纤维素酶突变体，所述突变体是对氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的羧甲基纤维素酶的氨基酸序列进行定点突变，和/或将第31位缬氨酸替换为谷氨酸，并将第135位甲硫氨酸替换为赖氨酸，从而提高羧甲基纤维素酶的活性。

本发明的第二个目的是提供表达所述羧甲基纤维素酶突变体的细胞系。

本发明的第三个目的是提供一种重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌是以pET-22b(+)为载体，以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主，表达所述突变体。

本发明的第四个目的是提供一种酶活提高的重组大肠杆菌的构建方法，所述方法是将含有编码所述羧甲基纤维素酶突变体的基因与表达载体连接后转化至大肠杆菌中。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是pET-22b(+)为载体、以E.coli BL21(DE3)为宿主表达所述羧甲基纤维素酶突变体。

本发明的第五个目的是提供一种提高羧甲基纤维素酶活力的方法，将第31位缬氨酸替换为谷氨酸，并将第135位甲硫氨酸替换为赖氨酸。

本发明的第六个目的是提供一种生产羧甲基纤维素酶的方法，是将所述重组大肠杆菌接种至TB培养基中，37℃培养12～30h.

在本发明的一种实施方式中，所述接种量按体积比为1％。

在本发明的一种实施方式中，所述菌体至OD₆₀₀为0.8～1.0时，加入IPTG诱导。

在本发明的一种实施方式中，所述方法还将诱导培养后的发酵液离心，收集菌体，并破壁纯化获得纯酶。

本发明还提供所述羧甲基纤维素酶突变体在食品、化工领域降解纤维素方面的应用。

有益效果：本发明通过定点突变的方式，显著提高了菌株表达羧甲基纤维素酶的酶活力，改造后的菌株产酶能力显著提高，酶活力提高至83.27U/mL～94.32U/mL，复合突变菌株pET-22b(+)-cmc-V31E/M135K酶活提高最为显著，达到153.92U/mL，较出发菌株提高了1.71倍，突变体在碱性条件下的pH稳定性也有所提高，适用于碱环境下分解纤维素材料。

具体实施方式

LB培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L，pH 7.0；

TB培养基：蛋白胨12g/L，酵母膏24g/L，甘油8g/L，17mmol/LKH₂PO₄，72mmol/LK₂HPO₄。

羧甲基纤维素酶酶活测定方法：酶活力及蛋白质浓度的测定羧甲基纤维素酶(CMCase)活性的测定使用3，5-二硝基水杨酸(DNS)法。酶活力单位(U)定义为1min水解底物产生1μmol葡萄糖所需要的酶量。

粗酶液的制备：将发酵液6000～9000rpm离心，收集菌体后，用0.1M、pH 6～7的磷酸盐缓冲液洗涤菌体2～3次，并超声破碎5min，离心收集上清液即为粗酶液。

SEQ ID NO.1对应羧甲基纤维素酶的氨基酸序列；SEQ ID NO.2对应密码子优化后的编码羧甲基纤维素酶的基因序列；SEQ ID NO.3对应突变体V31E的氨基酸序列；SEQ IDNO.4对应突变体M135K的氨基酸序列；SEQ ID NO.5对应突变体V31E/M135K的氨基酸序列。

实施例1高效分泌羧甲基纤维素酶菌株构建

以SEQ ID NO.1所示氨基酸为模板，经过密码子优化，合成SEQ ID NO.2所示基因cmc。将基因cmc与载体pET-22b(+)进行连接，连接体系：目的基因cmc 4μL，载体pET-22b(+)1μL，solutionI 5μL，16℃过夜连接。将连接好的重组质粒pET-22b-cmc转化到感受态细胞E.coil JM109中，转化氨苄青霉素LB平板，挑取阳性菌落，接种至LB培养基中，37℃摇床过夜培养后提取质粒，酶切验证正确后，转化子由上海生工进行测序。

实施例2高分泌能力羧甲基纤维素酶生产菌株的验证

将实施例1中测序正确的质粒，转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。挑选转化子接种到LB液体培养基中，37℃，培养12h，转接到TB培养基中，接种量为1％。菌体长到OD₆₀₀1.0时，加入IPTG诱导，并将培养温度降到28℃，培养36h。离心，收集菌体，检测胞内酶活。结果显示，酶活力为56.75U/mL。

实施例3高酶活突变体的获得

利用定点突变试剂盒(TaKaRa)，设计引物，以已构建的pET-22b-cmc为模版，进行PCR，将羧甲基纤维素酶第31位缬氨酸突变为谷氨酸，命名为V31E，将第135位甲硫氨酸突变为赖氨酸，命名为M135K。采用胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度。转化子由上海生工进行测序，转化子命名为pET-22b(+)-cmc-V31E、pET-22b(+)-cmc-M135K。

以测序正确的菌株pET-22b(+)-cmc-V31E的质粒为模版，对羧甲基纤维素酶分子第135位的甲硫氨酸进行复合突变，突变为赖氨酸，命名为V31E/M135K，转化子由上海生工进行测序，转化子命名为pET-22b(+)-cmc-V31E/M135K。

实施例4高产羧甲基纤维素酶生产菌株的验证

将实施例3测序正确的质粒，分别转化至E.coilBL21(DE3)，挑选转化子接种到LB液体培养基中，37℃，200～220rpm培养12h，转接到TB培养基中，接种量为1～3％。菌体培养至OD₆₀₀为0.8时，加入0.1mM>

实施例5高产羧甲基纤维素酶突变体pH稳定性的验证

按实施例4的方法制备野生酶(wt)和突变体的粗酶液，将粗酶液以相同的量加入至pH分为为8～10的磷酸盐缓冲液中，静置30min，测定相对酶活(以实施例4条件下测定的酶活为100％)。结果如表1所示。突变体M135K和V31E/M135K在pH 8～9的条件下均具有较高的酶活。

表1不同pH条件处理后的相对酶活

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 淄博职业学院

<120> 一种酶活提高的羧甲基纤维素酶突变体

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<170> PatentIn version 3.3

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<211> 235

<212> PRT

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<212> PRT

<213> 人工序列

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