一种凡纳滨对虾高碱度抗逆性状关联基因SNP标记、检测引物及其应用

摘要

本发明公开了一种凡纳滨对虾高碱度抗逆性状关联基因SNP标记、检测引物及其应用。本发明公开的变异位点位于凡纳滨对虾Crustacyanin A基因的编码区，变异位点的碱基为T或C，变异位点的基因型为TT时，凡纳滨对虾在高碱度环境下的存活率明显更低。本发明还公开了用于检测该变异位点的引物组合及其育种应用方法。在凡纳滨对虾高碱度抗逆育种工作中，可利用本发明公开的方法对后备亲本群体进行筛选，及早排除对高碱度环境压力敏感的凡纳滨对虾个体，将有助于整体改善对虾子代在高碱度环境条件中的耐受能力，具有较高的潜在应用价值。

说明书

技术领域

本发明属于水产生物技术及分子育种领域，具体涉及一种凡纳滨对虾高碱度抗逆性状关联基因SNP标记、检测引物及其应用。

背景技术

凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei，俗称南美白对虾)原产于中南美洲太平洋沿岸海域，1988年凡纳滨对虾从美国引进我国，1998年开始规模化养殖，如今已是我国最重要的对虾养殖品种。截止至2016，我国养殖年产量超过160万吨，年产值超过600亿元，种苗年需求量超过5000亿尾，良种繁育对凡纳滨对虾养殖业具有重要意义。

由于凡纳滨对虾具有较强的环境适应性和较高的经济价值，该种对虾已被推广到多种水域进行养殖，其中包括山西、陕北、山东等盐碱地海、淡水水域。根据报道，高碱度环境会降低对虾的免疫能力(Chang-Che Li and Jiann-Chu Chen.The immune response ofwhite shrimp Litopenaeus vannamei and its susceptibility to Vibrioalginolyticus under low and high pH stress.Fish&Shellfish Immunology,2008,25,701-709.)。因此，进行高碱度抗逆性状育种工作能够为凡纳滨对虾的养殖业提供科技支撑。

传统的选育方法完全依赖于表型，存在周期长、效率低、不稳定等不利因素。分子育种，即分子标记辅助选择育种，是指利用DNA分子标记对育种材料进行选择的技术，分子育种方法根据有效的分子标记进行后备亲本选择，繁育出经济性状有利的后代。SNP是Single Nucleotide Polymorphism的缩写，指在基因组上单核苷酸的变异，SNP位点一般为二等位多态性，在人类基因组中出现频率约为1/300碱基。SNP分子标记与RAPD(第一代分子标记)、SSR标记(第二代分子标记)相比，具有遗传稳定、数量多、分布广、信息量高、检测手段多样等优点，是目前应用最广、最新的分子标记。

发明内容

本发明旨在提供一种凡纳滨对虾高碱度抗逆性状关联基因SNP标记、检测引物及其应用，该分子标记可应用于凡纳滨对虾抗逆性状的分子标记辅助选择育种，为高碱度抗性相关的SNP变异位点提供有用信息，有利于提高凡纳滨对虾高碱度环境下的养殖性状。

凡纳滨对虾Crustacyanin A基因的DNA片段序列中，存在一段保守的编码区序列(SEQID-CA，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)，在编码区序列自5’端起的第11位碱基的位置存在SNP变异位点，碱基为T或C，该变异位点的基因型与凡纳滨对虾在高碱度抗逆性状显著相关。SEQID-CA的碱基序列为：5’-TACTGCGTGG(T/C)CGCTGGTATCAG-3’。

因此，本发明的第一个目的是提供一种凡纳滨对虾高碱度抗逆性状关联基因SNP标记，所述的SNP标记位于SEQ ID NO.1所示序列自5’端起第11位碱基处，碱基为T或C。

本发明的第二个目的是提供一种凡纳滨对虾高碱度抗逆性状关联基因SNP标记的检测引物，包括以下引物：

CA-F：5’-GAAGTCTGGAATGCCGTCG-3’(如SEQ ID NO.2所示)；

CA-R：5’-CATCCACTCCAACTACGACTAC-3’(如SEQ ID NO.3所示)。

本发明的第三个目的是提供所述的凡纳滨对虾高碱度抗逆性状关联基因SNP标记在凡纳滨对虾分子标记辅助选择育种中的应用。

本发明的第四个目的是提供一种凡纳滨对虾高碱度抗逆品种的选育方法，包括以下步骤：

a、提取待测凡纳滨对虾基因组DNA；

b、利用所述的检测引物CA-F和CA-R对待测凡纳滨对虾基因组DNA进行PCR扩增；

c、对扩增产物进行测序，确定所述的SNP标记的基因型，选择TC基因型或CC基因型个体作为后备亲本进行凡纳滨对虾高碱度抗逆品种育种。

本发明公开的SNP标记位于凡纳滨对虾Crustacyanin A基因的编码区，变异位点的碱基为T或C，变异位点的基因型为TT时，凡纳滨对虾在高碱度环境下的存活率明显更低。本发明还公开了用于检测该变异位点的引物组合及其育种应用方法。在凡纳滨对虾高碱度抗逆育种工作中，可利用本发明公开的方法对后备亲本群体进行筛选，及早排除对高碱度环境压力敏感的凡纳滨对虾个体，将有助于整体改善对虾子代在高碱度环境条件中的耐受能力，具有较高的潜在应用价值。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明做进一步详细说明，这些实施例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围。

实施例：

以pH 9.6±0.2为应激条件，对642头“正大”与“中科1号”群体杂交来源的后代进行高碱度耐受性实验，将2h内死亡的凡纳滨对虾作为高pH敏感组，将24h后仍然存活的凡纳滨对虾作为高pH耐受组。

在实验过程中，每隔半小时观察1次，及时将死亡个体置于95％酒精中保存。高pH敏感组和高pH耐受组对虾基因组DNA提取方法按照天根海洋动物组织基因组提取试剂盒进行(TIANGEN，天根生化科技有限公司)。

利用本发明公开的检测引物CA-F(5’-GAAGTCTGGAATGCCGTCG-3’，如SEQ ID NO.2所示)和CA-R(5’-CATCCACTCCAACTACGACTAC-3’，如SEQ ID NO.3所示)，对高pH敏感组和高pH耐受组对虾基因组DNA进行PCR检测，反应程序为：95℃预变性4分钟，(95℃变性30秒、52-57℃退火20秒、72℃延伸1分钟)×35个循环，最后72℃延伸10分钟。对PCR结果进行测序，个体的基因型结果如表1所示：

表1不同处理组个体基因型

注：表中敏感代表高pH敏感组，耐受代表高pH耐受组

对表1中的结果进行统计高碱度耐受关联分析，结果如表2所示：

表2 SNP位点的基因型频率及与高碱耐受性的关联分析

由表2可知，TT基因型出现在绝大多数高pH敏感组个体中，说明具有TT基因型的个体在高碱压力环境下抗性较弱。TC或CC基因型出现在绝大多数的高pH耐受组中，说明具有TC/CC基因型的个体在高碱度压力环境下的抗性较强。因此，在高碱度抗性育种过程中，本发明公开的碱基位点的基因型可作为高碱环境抗逆育种的标记，进行耐高碱后备亲本筛选时，应排除含有TT纯合子基因型的个体并尽量挑选含有TC或CC基因型的个体。

序列表

<110> 中国科学院南海海洋研究所

<120> 一种凡纳滨对虾高碱度抗逆性状关联基因SNP标记、检测引物及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)

<400> 1

tactgcgtgg ycgctggtat cag 23

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)

<400> 2

gaagtctgga atgccgtcg 19

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)

<400> 3

catccactcc aactacgact ac 22