杂交瘤细胞株及基于杂交瘤细胞株的甘胆酸单克隆抗体和检测试剂盒

摘要

本发明涉及检测技术领域，特别涉及杂交瘤细胞株及基于杂交瘤细胞株的甘胆酸单克隆抗体和检测试剂盒。该杂交瘤细胞株的保藏编号为CGMCC No.15292。本发明具有的技术效果为：由本发明杂交瘤细胞株产生的甘胆酸单克隆抗体效价较高，可用于酶联免疫吸附分析法(ELISA)检测甘胆酸，具有样品操作便捷、成本低廉、反应快速、灵敏度高、特异性强等特点。

说明书

技术领域

本发明涉及检测技术领域，特别涉及杂交瘤细胞株及基于杂交瘤细胞株的甘胆酸单克隆抗体和检测试剂盒。

背景技术

甘胆酸是胆酸与甘氨酸结合而成的结合型胆酸之一，由肝细胞合成，同胆汁进入肠道，经门静脉再回肝脏，当肝细胞受损时，肝细胞摄取甘胆酸能力下降，致使血中含量增加。甘胆酸是肝脏分泌到胆汁中最大量的有机酸，进入肠腔帮助脂肪消化吸收，在回肠和结肠大部分被重吸收，经门静脉入肝脏，肝细胞能高效地从门静脉摄取大量的甘胆酸，以致血液中的甘胆酸量小于1.9g/mL。重吸收的甘胆酸又进入吸收循坏，通过这种机制，机体能充分利用这种甘胆酸。一旦肝细胞病变，血中的甘胆酸浓度增高，其中急性肝炎、慢性肝炎轻度升高，肝硬变，肝癌病人显著升高。当肝细胞受损时，肝细胞摄取血清甘胆酸(Cholyglycine，CG)能力下降，致使血中CG含量增高；胆汁郁滞时，肝脏排泄胆酸发生障碍。而返流血液循坏的CG含量增高，也使CG含量升高。因此，甘胆酸是评价肝细胞功能及其肝胆系物质循环功能的敏感指标之一。

另外孕妇在怀孕中后期，由于婴儿的增大，会压迫肝脏，使肝脏排泄胆酸发生障碍而导致甘胆酸偏高，另外由于妊娠期胎盘合成和分泌大量雌性激素和孕激素以及代谢负荷增大，可诱发肝胆系统的变化，使孕妇易患妊娠肝内胆汁淤积症(ICP)，对胎儿产生严重的影响，随ICP患者血清CG增高使羊水污染率、早产率胎儿宫内窘迫率及破宫产率增高，严重者可导致胎儿死亡，因此测定孕妇血清甘胆酸，对及早发现ICP和了解ICP的严重程度有着非常重要的意义，甘胆酸的测定可作为筛查和随访ICP的指标，从而降低围产儿病死率。

目前，体外定量测定甘胆酸主要使用放射免疫分析法(RIA)、化学发光免疫分析法(CLIA)、酶联免疫吸附法(ELISA)等。放射免疫法需要有专业放免设施，普通实验室难以开展，且放免法准确度低，放射性射线还会对操作人员的健康产生极大的危害，国际上已很少使用。化学发光法灵敏度较高，但是测定速度较慢，测试结果的准确度和试剂稳定性较差，而且需要昂贵的专用化学发光检测设备，不利于常规实验室开展，临床应用局限性明显。酶联免疫吸附分析法(ELISA)具有样品操作便捷、成本低廉、反应快速、灵敏度高、特异性强等特点，能更好的运用甘胆酸的检测。但目前市售的甘胆酸单克隆抗体存在效价低的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了杂交瘤细胞株及基于杂交瘤细胞株的甘胆酸单克隆抗体和检测试剂盒。该甘胆酸单克隆抗体效价较高，特异性强，灵敏度高。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种杂交瘤细胞株，保藏编号为CGMCC NO.15292。

本发明还提供了一种甘胆酸单克隆抗体，由本发明杂交瘤细胞株产生。

在本发明中，该甘胆酸单克隆抗体制备方法为：以甘胆酸为免疫原免疫小鼠，将免疫鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞进行融合，采用有限稀释法和间接ELISA筛选技术，获得阳性单克隆杂交瘤细胞株，诱生腹水，经纯化，得到甘胆酸单克隆抗体。

作为优选，骨髓瘤细胞为SP2/0骨髓瘤细胞。

作为优选，小鼠为Balb/C小鼠。

本发明还提供了该甘胆酸单克隆抗体在制备甘胆酸检测试剂盒中的应用。

本发明还提供了一种甘胆酸检测试剂盒，包括本发明提供的甘胆酸单克隆抗体。

作为优选，该甘胆酸检测试剂盒还包括包被抗原。

作为优选，包被抗原为卵清白蛋白与甘胆酸的偶联物。

作为优选，该甘胆酸检测试剂盒还包括甘胆酸标准溶液、包被液、洗涤液、封闭液、酶标二抗、底物显色液和终止液。

作为优选，洗涤液为0.05％PBST。

作为优选，酶标二抗为羊抗鼠酶标抗体。

作为优选，该甘胆酸检测试剂盒还包括固相载体。

在本发明提供的实施例中，固相载体为酶标板。

本发明还提供了一种甘胆酸的间接ELISA检测方法，包括如下步骤：

将卵清白蛋白与甘胆酸偶联物包被于固相载体上，封闭，得到包被有包被抗原的固相载体；

将甘胆酸标准品、甘胆酸单克隆抗体与包被有包被抗原的固相载体共同孵育，加入酶标二抗显色，得到标准曲线；

将待测样品、甘胆酸单克隆抗体与包被有包被抗原的固相载体共同孵育，加入酶标二抗显色，根据标准曲线得到待测样品中甘胆酸的浓度。

本发明提供了杂交瘤细胞株及基于杂交瘤细胞株的甘胆酸单克隆抗体和检测试剂盒。该杂交瘤细胞株的保藏编号为CGMCC NO.15292。本发明具有的技术效果为：由保藏编号为CGMCC NO.15292的杂交瘤细胞株产生的甘胆酸单克隆抗体的效价较高，可用于酶联免疫吸附分析法(ELISA)定性或定量检测甘胆酸含量，具有样品操作便捷、成本低廉、反应快速、灵敏度高、特异性强等特点。

生物保藏说明

分类命名：甘胆酸杂交瘤细胞株，于2018年01月25日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏中心地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.15292。

附图说明

图1为本发明纯化后的甘胆酸单克隆抗体SDS-PAEG电泳图谱，其中1是腹水纯化前1mg/ml的电泳图，2为纯化后稀释为1mg/ml后的电泳图，且纯化后的IgY由两条链组成，分别为55KDa左右处的重链和25KDa左右处的轻链，在2中可见轻链25KDa左右的条带有些模糊，分析是浓度太低造成；

图2为本发明甘胆酸单抗腹水间接ELISA酶标孔光密度值测定结果曲线图；

图3为本发明甘胆酸单抗腹水与甘胆酸标准品竞争ELISA曲线，腹水稀释2000倍，其中K表示×1000。

具体实施方式

本发明公开了杂交瘤细胞株及基于杂交瘤细胞株的甘胆酸单克隆抗体和检测试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

间接ELISA检测方法操作程序：

取96孔酶标板，每孔加入用包被缓冲液稀释的包被浓度的包被抗原卵清白蛋白与甘胆酸偶联物(OVA-CG)浓度为5μg/mL 100μL，4℃包被过夜后，用洗涤液0.05％PBST洗板3次，拍干；

按配好的封闭液每孔250μL，恒温37℃温育1h；洗板3次，拍干；

用PBS特定浓度倍比稀释抗血清，同时设置阴性对照和空白对照各2孔，每孔100μL，37℃温育1h；甩干孔中溶液，PBST洗涤液洗涤3次，拍干；

加入酶标二抗(羊抗鼠酶标抗体，1:5000稀释)，37℃温育1h；甩干孔中溶液，PBST洗涤液洗涤3次，拍干；

每孔加入底物显色液100μL，37℃温育避光显色15min。最后加入终止液50μL终止反应。用酶标仪测OD值(450nm)。

本发明所述的一种检测甘胆酸及衍生物与含量的方法，优先为间接竞争ELISA方法，样品中的甘胆酸免疫抗原可以与包被抗原(OVA-CG)对有限量的抗体发生竞争性结合，根据其吸光度的数值可以从标准曲线上推算出样品中甘胆酸的含量。

本发明提供的杂交瘤细胞株及基于杂交瘤细胞株的甘胆酸单克隆抗体和检测试剂盒中所用试剂或仪器均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1：单克隆抗体制备

(1)动物免疫

免疫原为甘胆酸纯品，直接用PBS溶解，配成浓度1mg/mL。取上述溶液0.5mL与等体积的弗氏完全佐剂乳化，注射到Balb/C小鼠(5只6周龄的Balb/C雌性小鼠，18-22g。)，0.5mL/只，采取皮下多点注射和腹腔注射。初次免疫选用免疫抗原和弗氏完全佐剂乳化，随后用不完全弗氏不完全佐剂进行乳化，每次免疫时间间隔15天。第15日、29日进行加强免疫，免疫剂量同初次免疫。在融合前三天，最后一次进行冲击免疫，使用的是不加佐剂的抗原。在第三次免疫后，小鼠尾部静脉采血，分离的到血清，采用抗原包被的间接ELISA法检测血清的抗体效价。制备单克隆抗体的小鼠是选择最后一次免疫后，取抗体效价最高的Balb/C小鼠。

(2)杂交瘤细胞的制备

SP2/0细胞的复苏和培养：融合前两周将SP2/0细胞复苏。从-80℃的冰箱取出骨髓瘤细胞(SP2/0)冻存管，使其在40℃水浴中2min内快速解冻，1000rmp，离心5min，室温。弃去上清液，用RPMI1640培养基(含10％胎牛血清+1％双抗)将细胞轻轻吹散，再将细胞吸入到细胞培养瓶中，补充适量RPMI1640培养基(含10％胎牛血清+1％双抗)，放入37℃5％CO₂细胞培养箱培养。根据观察细胞的生长状态，更换培养基。为确保所用的SP2/0细胞对HAT选择培养基的敏感性，可在培养液中加入1％8-杂氮鸟嘌呤(100*)。融合前一天将一瓶细胞传代至两瓶，继续培养，使细胞处于对数生长期，活力最好。融合时，倒掉完全培养基，用适量RPMI1640吹散，计数，细胞总数约为1-1.2×10⁷个，并转移至50mL离心管中；1000rpm，5min，离心洗涤2-3次，重悬后备用。

饲养细胞的制备：采取小鼠腹腔的巨噬细胞作为饲养层细胞。细胞融合前一天，取8-10周的Balb/C小鼠，脱颈致死，浸泡在75％酒精中5min，固定于超净工作台的无菌泡沫板上，用无菌剪刀剪开腹部皮肤，暴露腹膜，小心剪开腹膜，用无菌滴管吸取少量RPMI1640培养液吹打小鼠腹腔，另腹腔细胞充分进入培养液，反复吹吸到50mL无菌离心管中，直至吹吸的颜色与RPMI1640颜色一致。将吹吸起来的细胞液离心，1000rpm，5min。弃去上清液，用HAT培养液重悬，细胞计数，调整至1×10⁵个/mL，加入到无菌的96孔板中，每孔100μL，置于37％，5％CO₂细胞培养箱中培养备用。

免疫脾细胞的制备：将效价最高的小鼠冲击免疫三天后，摘除眼球取血，收集血清作为检测抗体时的阳性对照。按住小鼠头部，拉尾处死，浸泡在75％酒精中5min，将小鼠偏向左侧固定在无菌操作台的无菌泡沫板上，用无菌剪刀剪开小鼠的腹部皮肤，沿着切口上下撕开皮肤，可以看到脾脏所在的位置；换另外的无菌剪刀和镊子，剪开腹膜，使小鼠脾脏充分暴露出来，用无菌钉固定皮肤；换剪刀和镊子，镊子轻轻夹住脾脏，用剪刀小心的分离脾脏，尽量的把脾脏周围的结缔组织剔除干净，用8-10mL RPMI1640培养基将脾细胞在无菌培养皿中洗干净，再将脾脏放入另外一个无菌培养皿中，用1mL的无菌注射器针头戳几下，用2mL无菌注射器吸取8-10mL RPMI1640培养基冲洗小鼠脾脏，使脾细胞充分从脾脏中冲洗出来，制成脾细胞悬液，将液体移到另外一个50mL离心管中。计数，大约1×10⁸/小鼠。至超净工作台备用。

骨髓瘤细胞的制备：与SP2/0细胞的复苏和培养过程条件一致，骨髓瘤细胞置于超净工作台备用。

细胞融合：将1×10⁸个脾细胞和1×10⁷个SP2/0细胞混于一支50mL离心管中，补加不完全培养基RPMI1640培养基至20mL，充分混匀，离心，1000rpm，5min。取离心好的脾细胞和SP2/0细胞，去上清(注意保持这个姿势)用滤纸条轻轻粘去管壁上的培养液(保证PEG1450不被稀释)。轻轻敲打，充分混匀。将离心管放到40℃水浴中(用一小烧杯制作水浴)(PEG1450预热)，45秒加入预热至40℃的的1mL>2细胞培养箱培养。

实施例2：杂交瘤细胞筛选及其亚克隆

融合后的每三天换一下HAT培养基半液100μL，切勿吹打。10天后用HT培养基换出全部的HAT培养基，每间隔3天换一下HT全液。培养20天左右，换为一般的完全培养基。

每天观察细胞生长，大约在第10天细胞长满培养孔的1/2，取上清液进行间接ELISA测定，检测是否产生抗体。

制备杂交瘤细胞悬液：轻轻吹散ELISA检测为阳性孔中的杂交瘤细胞，将杂交瘤细胞用移液器吸入到10mL的离心管中，计数，计算，将细胞浓度以完全培养基稀释到200个/mL，取出2mL加入到2mL含有饲养细胞的完全培养基中，杂交瘤细胞的浓度则变为100个/mL；

有限稀释：将上述杂交瘤细胞悬液以每孔100μL加入到96孔细胞培养板的第1、2两行，这两行的杂交瘤细胞的浓度为每孔10个。在剩余细胞悬液中加入等体积的饲养细胞悬液，混匀后加入到第3、4两行，则这两行的杂交瘤细胞的浓度为每孔5个，重复上述步骤，则第5、6两行的浓度为每孔2.5个，第7、8两行的浓度为每孔1.25个。培养3天后，在导倒置显微镜下观察细胞生长状况，并小心吸取培养板上100μL的培养液，再添加完全培养基100μL。利用间接ELISA对孔中上清进行检测，选择效价高的细胞培养孔进行再次克隆化，并尽可能选取单克隆孔。直到连续两次克隆化的单克隆孔检测全为阳性为止。

从抗体的阳性孔中，选择抗体效价高、特异性强、且细胞状态良好的细胞孔，继续进行再克隆，获得单克隆抗体细胞株，大量培养后，分装小管冻存于-80℃冰箱中。并将其保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(China General Microbiological CultureCollection Center,CGMCC)，保藏编号为CGMCC NO.15292。

实施例3：腹水诱生和抗体纯化

腹水的诱生：取Balb/C小鼠5只，在接种杂交瘤细胞前十天左右，每只小鼠腹腔内注射0.5mL弗氏不完全佐剂。同时将单克隆抗体分泌细胞株置于细胞培养瓶中培养至对数期，1000rpm离心5min，取沉淀用1640基础培养基重悬，调整细胞数为1×10⁶个细胞/mL，在上述小鼠腹腔内注射0.5mL杂交瘤细胞，待小鼠腹部明显肿大，行动迟缓，约10-13天后。用酒精棉球消毒腹部皮肤，用5mL注射器抽取腹水，将腹水4℃、1000rpm离心10min，取上清，分装后冻存-20℃冰箱保存备用。

甘胆酸抗体的纯化：辛酸硫酸铵法纯化小鼠腹水抗体。从冰箱取出小鼠腹水，室温融化，双层滤纸过滤；缓慢加入2倍血清体积的0.06mol/L的NaAC(pH4.5)溶液；缓慢滴加正辛酸，沉淀杂蛋白(变性沉淀)，在家的过程中就会发现血清中慢慢有白色物质产生。上清中的IgG在加入正辛酸沉淀完全后含量能够达到90％以上。不同物质加入正辛酸的量也不同：1mL鼠血清加入40μL正辛酸，1mL小鼠腹水中加入33μL正辛酸。滴加完成后，4℃作用1-2小时后，然后4℃下8000-10000rpm离心15min，弃去沉淀，取上清。沉淀加1M的10×PBS，体积为上清的1/10。用1M NaOH快速将pH调回中性，减少对抗体的伤害；4℃下加入1倍体积的饱和硫酸铵(pH＝7.5)，体积为前面的总体积。加完后硫酸铵的浓度为50％。加的过程要慢，不能让局部的盐浓度过高边加边搅拌，冰浴。加到一定程度溶液变浑浊，IgG开始沉淀。加完后在磁力搅拌器上搅拌6h或4℃静置过夜；4℃8000-10000rpm离心15min，弃去上清液，取沉淀溶解于与原腹水体积相同的PBS(0.01M，pH＝7.4)或生理盐水中，加入1/2体积饱和的硫酸铵溶液使得硫酸铵的浓度为33％，放置4℃3h；4℃8000-10000rpm离心15min，弃去上清液，沉淀用PBS(0.01M，pH＝7.4)重悬至原体积；然后置于0.01M PBS中透析，4℃透析2天，期间换水4次以上。透析过的溶液，8000rpm离心30min，除去不溶性沉渣，分装小管1mL-80℃冻存备用。纯化后的单克隆抗体的SDS-PAEG电泳图谱见图1。

实施例4：单克隆抗体的鉴定——间接ELISA方法

间接ELISA检测方法操作程序：取96孔酶标板，每孔加入用包被缓冲液稀释的包被浓度的包被抗原卵清白蛋白与甘胆酸偶联物(OVA-CG)浓度为5ug/mL 100μL，4℃包被过夜后，用洗涤液0.05％PBST洗板3次，拍干；按配好的封闭液每孔250μL，恒温37℃温育1h；洗板3次，拍干；用PBS特定浓度倍比稀释抗血清，同时设置阴性对照和空白对照各2孔，每孔100μL，37℃温育1h；甩干孔中溶液，PBST洗涤液洗涤3次，拍干；加入酶标二抗(羊抗鼠酶标抗体，1:5000稀释)，37℃温育1h；甩干孔中溶液，PBST洗涤液洗涤3次，拍干；每孔加入底物显色液100μL，37℃温育避光显色15min。最后加入终止液50μL终止反应。用酶标仪测OD值(450nm)，结果见图2-3和表1。同时以其他文献所报道的甘胆酸单克隆抗体作为对照。

表1实施例3甘胆酸单抗腹水间接ELISA酶标孔光密度值测定结果

据相关文献报道如下：

①《甘胆酸免疫原、抗甘胆酸特异性抗体及检测试剂》申请号：CN201410047903.5，特异性抗体的效价是1:30000

②《一种甘胆酸免疫检测试剂及其制备和检测方法》申请号：CN20141047767.X，特异性抗体的效价是1:30000

③《一种基于抗甘胆酸特异性抗体的甘胆酸的免疫检测试剂及其制备方法》申请号：201510717368.4，特异性抗体的效价为1:20000和1:30000

可见，本发明制备的甘胆酸单克隆抗体的效价可达1：250000，显著高于目前其他文献所报道的甘胆酸单克隆抗体及甘胆酸衍生物特异性抗体。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。