一种荧光检测试剂及制备方法及用于皮肤胆固醇的测量系统及方法

摘要

本发明涉及一种荧光检测试剂及制备方法及用于皮肤胆固醇的测量系统及方法，属于医学和光学等领域，将可以和胆固醇结合的毛地黄皂苷上通过化学手段连接上不同的荧光基团，通过配套的检测设备和检测材料，由检测到的荧光信号强弱即可反映皮肤胆固醇的含量，从而实现对与皮肤胆固醇相关疾病如患心血管疾病的风险进行评估，进而达到早期预警和防治的效果，指导人们合理规划自己的饮食与运动习惯，使身体始终处于健康的状态。本发明采用了高灵敏度的荧光检测试剂克服了皮肤胆固醇含量低而难以检测的缺点，实现了皮肤胆固醇的无创、快速、灵敏检测。

说明书

技术领域

本发明属于医学及光学等领域，尤其涉及检测试剂在慢病预测与防治应用领域，特别涉及一种荧光检测试剂及制备方法及用于皮肤胆固醇的测量系统及方法。

背景技术

随着人口老年化的加重与饮食习惯的改变，动脉粥样硬化类疾病的患病比例逐步上升，此类疾病属于慢性疾病范畴，一旦发病后非常难以逆转，而且，由手术治疗带来的痛苦严重影响患者的生活质量，鉴于此，急需要发展一种可以早期预警该类疾病的标志物和检测方法。

研究表明，高胆固醇血症与动脉粥样硬化具有很大的相关性。血浆总胆固醇、高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)含量的测定是预测动脉粥样硬化类疾病广泛的使用方法之一，但是这些测量需要采集长时间空腹人群的血液，以排除食物中胆固醇的影响，而且，抽血为有创，增加了感染风险，检测设备一般比较昂贵，检测时间相对较长，所有这些因素均限制了其广泛应用，从而达不到大面积筛查的作用。

近年来，随着对胆固醇认识的加深，发现皮肤表皮中的胆固醇和动脉粥样硬化的发病密切相关，而且，通过对表皮胆固醇的测量，可对亚临床的动脉粥样硬化进行预测，从而可以实现早期动脉粥样硬化的预警，实现从饮食和生活方式上进行干涉，遏制疾病的继续发展。

皮肤活检可以对皮肤表面胆固醇进行测量，但是鉴于其获取样本比较痛苦、容易感染、所取样本涵盖表皮、真皮甚至皮下脂肪导致测量的并不是单纯的表皮胆固醇等原因，从而限制了其发展。

近年来，一种基于A-C-B试剂的皮肤胆固醇测量方法被广泛应用，该方法中A是可以与胆固醇具有亲和力的试剂，B为酶催化可视化试剂，C为将检测试剂与可视化试剂连接的结合试剂。预先将A-C-B加到测量皮肤表面，一段时间后，A-C-B与皮肤表面的胆固醇结合，再将显色试剂加入到检测皮肤表面，显色试剂在酶的催化下可以生成有色产物，产物的颜色和皮肤表面胆固醇的含量呈正比例关系，再通过光学方法如吸收法、散射法等检测。该方法中涉及到两种试剂，即结合试剂和显色试剂，整个测量过程大概4-5min，检测时间较长；另外，显色试剂加到检测部位后，颜色会随着时间的延长而逐步加深，所以需要严格控制显色试剂的检测时间，超过几秒钟就会导致测量结果差别很大，因此需要对检测的时间把握非常严格；再者，上述A-C-B试剂中涉及到生物大分子(酶)、聚合物和小分子，合成过程比较复杂，对于每一步合成产物的质量难以控制，加以酶活性容易受到温度、PH等环境因素的影响，保存时间相对比较短。

发明内容

本发明技术解决问题：克服现有技术的不足，提供一种荧光检测试剂及制备方法及用于皮肤胆固醇的测量系统及方法，通过一种荧光检测试剂结合荧光光谱信息即可对皮肤胆固醇进行测量，该种荧光检测试剂的引入代替了原来的两种试剂，使得检测时间从原来的4-5min变成了2-3min，进一步缩短了检测时间，提高被检测人的依从性；由于此种检测方法是直接测量检测部位的荧光，克服了原显色试剂需要严格控制显色时间的问题；另外，本检测试剂为小分子化合物，相对于原包含有含生物大分子(酶)、聚合物和小分子的检测试剂，合成过程中每一步中间产物的质量控制简单，在保存过程和检测过程中亦不易受环境因素的影响。

本发明技术解决方案：一种荧光检测试剂，用于皮肤胆固醇荧光测量，所述荧光检测试剂包括洋地黄皂苷和荧光基团，二者之间通过一个10-20个原子的亲水链连接，亲水链一方面提高检测试剂的水溶性；另一方面长亲水链的存在也会使荧光基团的引入而不对洋地黄皂苷本身性质造成影响。

作为一种改进，亲水链的存在一方面可以提高检测试剂的水溶性，利于临床检测；另一方面长亲水链的存在也会使荧光基团的引入而不对洋地黄皂苷本身性质造成影响。

作为进一步改进，所述亲水链为各种长度的多乙二醇长亲水链，用以提高荧光检测试剂的水溶性。

进一步的，所述的10-20个原子的亲水链可以为三缩乙二醇；

更进一步的，所述的亲水链另一端连接一个荧光基团，该荧光基团可被特定波长光激发后产生不同于皮肤本底荧光光谱的荧光光谱；

具体的，所述的荧光基团侧链上必须含有至少一个羧基，用以和长亲水链结合；

具体的，所述的荧光检测试剂的合成包括以下步骤：

(1)将荧光基团(1mmol)和多乙二醇长亲水链(10mmol)在EDCI【1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐,1.5mmol】、DMAP(0.2mmol)(4-二甲氨基吡啶)、Et₃N(三乙胺,1.5mmol)和DCM(二氯甲烷,5ml)存在条件下反应得到中间产物一；

(2)将中间产物一(1mmol)和酸酐(2mmol)在THF(四氢呋喃,2ml)存在条件下回流再得到中间产物二；

(3)将中间产物二(1mmol)和N-羟基丁二酰亚胺(1.5mmol)在EDCI【1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐,1.5mmol】和DCM(二氯甲烷,10ml)存在条件下反应得到中间产物三；

(4)将中间产物三(0.02mmol)和毛地黄皂苷(0.01mmol)在Et₃N(三乙胺,1mmol)和THF(四氢呋喃,1ml)存在条件下反应得到荧光检测试剂。

所述检测材料包括限位垫片、试剂吸取管和试剂移除棒；

所述限位垫片是一面带有固定胶、中间带有检测孔的软片，可以粘贴在皮肤待检测区域，中间的检测孔用以限定检测区域，所述垫片采用聚乙烯发泡材质，内径为7-8mm，外径为18-19mm，厚度为3-4mm；

所述试剂吸取管是用以定量吸取一定体积的检测试剂置于检测孔，一次吸取体积为50-150ul；

所述试剂移除棒是用以将反应后的荧光检测试剂从检测孔移除，棒体为圆柱形，材质为聚丙烯，直径为6-6.5mm，长度为40-50mm；

所述检测设备包括：电源、控制模块、光源、光纤、准直透镜、滤光片、检测池、光谱仪和上位机；

所述电源主要用以为系统供电；

所述控制模块主要用以控制光源的强度；

所述光源可根据荧光检测试剂上连接的荧光基团的激发光选择；(如若荧光检测试剂连接的荧光基团为紫外激发，则所述光源模块可为紫外LED光源，激发带宽可为350-390nm,中心波长可为370nm)；

所述检测池为可适配限位垫片的检测小孔，孔内内置一个探头；

所述光纤总共有两根，集成在所述探头里面，一根与所述光源连接，引导光路至检测部位；另一根与所述光谱仪连接，将激发的荧光信息收集至光谱仪；

所述光谱仪模块用以接受被激发的荧光光谱信息；

所述上位机模块用以接收光谱仪的光谱信息，并对光谱信息进行分析，得出皮肤胆固醇的含量。

荧光检测试剂的皮肤胆固醇荧光测量方法，其特征在于步骤如下：

(1)在进行测量之前，需将待测量部位清理干净，此处采用水洗或异丙醇擦拭的方式进行；

(2)等待检测部位晾干后，贴上限位垫片，将限位垫片置于检测设备一中的检测池16，进行背景荧光测量；

(3)待背景荧光测量完成以后，用所述定量试剂吸取管33吸取荧光检测试剂置于限位垫片32的检测孔，反应1min后用所述试剂移除棒31移除剩余荧光检测试剂；

(4)将粘贴限位垫片的检测部位再置于检测设备1中的检测池16，进行皮肤表面胆固醇荧光测量，测量后，经上位机处理以后即可实时得出皮肤表面胆固醇的含量。

本发明与现有技术相比的优点在于：

(1)通过一种荧光检测试剂结合荧光光谱信息即可对皮肤胆固醇进行测量，该种荧光检测试剂的引入代替了原来的两种试剂，检测步骤变少，从而使得检测时间从原来的4-5min变成了2-3min，进一步缩短了检测时间，提高被检测人的依从性。

(2)由于本发明方法是直接测量检测部位的荧光，克服了原显色试剂需要严格控制显色时间的问题，即使检测时耽误几分钟，仍然不会影响测量值，具体来说，原方法先是将检测试剂加在待测量部位，检测试剂和皮肤表面胆固醇结合，再加入显色试剂，由于检测试剂中含有酶，可催化显色试剂产生颜色，随着时间的延长，显色试剂在酶的催化作用下颜色越来越深，因此，必须控制每人的显色时间一致，才能保证结果的可靠性，在检测过程中，如果操作人员由于某些原因而耽误了检测时间，就会导致测量结果的不准确，本荧光检测试剂由于直接和皮肤表面的胆固醇结合，且完全是靠自身连接的荧光基团被特定波长的激发光激发而产生荧光，在操作过程中，即使操作人员耽误了时间，只要保证该部位不是暴露于此激发光波段下，测量值会保持不变；

(3)本发明的荧光检测试剂为小分子化合物，合成过程中每一步中间产物质量控制简单，得到的产物比较单一，而且，其在保存过程和检测过程中亦不易受环境因素(温度、PH等)的影响，原检测试剂是将生物大分子(如辣根过氧化物酶)、聚合物(如马来酸酐N-乙烯基吡咯烷酮共聚物)和小分子(如洋地黄皂苷)通过逐级反应从而得到检测试剂，所得检测试剂由于含有生物大分子和聚合物，所以纯化比较困难，里面容易混杂多余辣根过氧化物酶，由于最后加入的是过量的显色试剂，所以多余辣根过氧化物酶亦会催化过量的显色试剂使颜色变深，因此会对检测结果造成比较大的影响，再者，由于其中含有酶等物质，所以在检测过程和保存过程中对温度和PH等环境因素也要严格控制，否则亦会对酶的活性造成影响，从而影响检测结果。

附图说明

图1为本发明一种皮肤胆固醇荧光测量系统整体结构示意图；

图2为典型的检测试剂2-1的具体合成方法；

图3为典型的检测试剂2-2的具体合成方法；

图4为典型的检测试剂2-3的具体合成方法；

图5为典型的检测试剂2-4的具体合成方法；

图6为典型的检测试剂2-5的具体合成方法；

图7为典型的检测试剂2-6的具体合成方法；

图8为典型的检测试剂2-7的具体合成方法；

图9为典型的检测试剂2-8的具体合成方法；

图10为典型的检测试剂2-9的具体合成方法；

图11为典型的检测试剂2-10的具体合成方法；

图12为典型的检测试剂2-11的具体合成方法；

图13为典型的检测试剂2-12的具体合成方法；

图14为人皮肤的背景荧光和加入了检测试剂2-1后的皮肤胆固醇荧光；

图15为原检测试剂(A-C-B)和荧光检测试剂检测时间对比表；

图16为原检测试剂(A-C-B)和荧光检测试剂随着时间的变化检测的值的变化；

图17为用检测试剂2-1检测的萃取了不同时间的猪皮表面皮肤胆固醇含量。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清晰，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

如图1所示，本发明的皮肤胆固醇荧光测量系统，包括检测设备1、荧光检测试剂2和检测材料3。

所述检测设备1用以采集结合了荧光检测试剂的皮肤表面胆固醇的荧光信号；所述检测设备1包括电源11、控制模块12、紫外LED光源13、准直透镜14、滤光片15、检测池16、光谱仪17和上位机18，由所述上位机18通过所述控制模块12对所述LED光源13的光强进行控制，经所述准直透镜14和滤光片15到达所述检测池16，激发检测部位和皮肤胆固醇结合的荧光检测试剂的荧光基团产生荧光，产生的荧光通过光纤经所述光谱仪17到达上位机18，进行算法处理分析，从而得到皮肤表面胆固醇的含量。所述LED光源13不限于紫外LED，其可根据所述检测试剂2的荧光基团变化而更换不同LED光源；

所述荧光检测试剂2用以和皮肤表面胆固醇特异性结合，并使结合的皮肤表面胆固醇具有荧光属性，便于后续荧光检测；

作为一种改进，还包括荧光检测试剂2的合成方法，图2-图13即为优选的荧光检测试剂2的具体合成方法。

实施例1：

如图2所示，所述荧光检测试剂2-1的合成包括将7-二乙胺基香豆素-3-羧酸3-1(261mg,1mmol)和三缩乙二醇4-1(1.5g,10mmol)在EDCI【1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐】(288mg,1.5mmol)、DMAP(4-二甲氨基吡啶)(25mg,0.2mmol)、Et₃N(三乙胺)(152mg,1.5mmol)和DCM(二氯甲烷)(5mL)在室温(25℃)条件下反应24h得到产物5-1(338mg,86％)；再将产物5-1(393mg,1mmol)和丁二酸酐6-1(200mg,2mmol)在THF(四氢呋喃)(2mL)存在条件下回流24h得到产物7-1(490mg,99％)；然后将产物7-1(493mg,1mmol)和N-羟基丁二酰亚胺8-1(173mg,1.5mmol)在EDCI【1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐】(288mg,1.5mmol)和DCM(二氯甲烷)(10mL)存在条件下反应得到产物9-1(550mg,93％)，将产物9-1(12mg,0.02mmol)和毛地黄皂苷(12mg,0.01mmol)在Et₃N(三乙胺)(101mg,1mmol)和THF(四氢呋喃)(1mL)存在条件下反应得到荧光检测试剂2-1。

实施例2：

如图3所示，所述荧光检测试剂2-2的合成包括将荧光素3-2(332mg,1mmol)和三缩乙二醇4-1(1.5g,10mmol)在EDCI【1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐】(288mg,1.5mmol)、DMAP(4-二甲氨基吡啶)(25mg,0.2mmol)、Et₃N(三乙胺)(152mg,1.5mmol)和DCM(二氯甲烷)(5mL)在室温(25℃)条件下反应24h得到产物5-2(424mg,88％)；再将产物5-2(482mg,1mmol)和丁二酸酐6-1(200mg,2mmol)在THF(四氢呋喃)(2mL)存在条件下回流24h得到产物7-2(580mg,99％)；然后将产物7-2(582mg,1mmol)和N-羟基丁二酰亚胺8-1(173mg,1.5mmol)在EDCI【1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐】(288mg,1.5mmol)和DCM(二氯甲烷)(10mL)存在条件下反应得到产物9-2(660mg,94％)，将产物9-2(13mg,0.02mmol)和毛地黄皂苷(12mg,0.01mmol)在Et₃N(三乙胺)(101mg,1mmol)和THF(四氢呋喃)(1mL)存在条件下反应得到检测试剂2-2。

实施例3：

如图4所示，所述检测试剂2-3的合成包括将罗丹明3-3(444mg,1mmol)和三缩乙二醇4-1(1.5g,10mmol)在EDCI【1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐】(288mg,1.5mmol)、DMAP(4-二甲氨基吡啶)(25mg,0.2mmol)、Et₃N(三乙胺)(152mg,1.5mmol)和DCM(二氯甲烷)(5mL)存在条件下反应得到产物5-3(490mg,85％)；再将产物5-3(576mg,1mmol)和丁二酸酐6-1(200mg,2mmol)在THF(四氢呋喃)(2mL)存在条件下回流得到产物7-3(672mg,99％)；然后将产物7-3(676mg,1mmol)和N-羟基丁二酰亚胺8-1(173mg,1.5mmol)在EDCI【1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐】(288mg,1.5mmol)和DCM(二氯甲烷)(10mL)存在条件下反应得到产物9-3(735mg,95％)，将产物9-3(16mg,0.02mmol)和毛地黄皂苷(12mg,0.01mmol)在Et₃N(三乙胺)(101mg,1mmol)和THF(四氢呋喃)(1mL)存在条件下反应得到检测试剂2-3。

实施例4：

如图5所示，所述检测试剂2-4的合成包括将化合物3-4(285mg,1mmol)和三缩乙二醇4-1(1.5g,10mmol)在EDCI【1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐】(288mg,1.5mmol)、DMAP(4-二甲氨基吡啶)(25mg,0.2mmol)、Et₃N(三乙胺)(152mg,1.5mmol)和DCM(二氯甲烷)(5mL)存在条件下反应得到产物5-4(367mg,88％)；再将产物5-4(417mg,1mmol)和丁二酸酐6-1(200mg,2mmol)在THF(四氢呋喃)(2mL)存在条件下回流得到产物7-4(513mg,99％)；然后将产物7-4(517mg,1mmol)和N-羟基丁二酰亚胺8-1(173mg,1.5mmol)在EDCI【1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐】(288mg,1.5mmol)和DCM(二氯甲烷)(10mL)存在条件下反应得到产物9-4(565mg,92％)，将产物9-4(13mg,0.02mmol)和毛地黄皂苷(12mg,0.01mmol)在Et₃N(三乙胺)(101mg,1mmol)和THF(四氢呋喃)(1mL)存在条件下反应得到检测试剂2-4。

实施例5：

如图6所示，所述检测试剂2-5的合成包括将化合物3-5(285mg,1mmol)和三缩乙二醇4-1(1.5g,10mmol)在EDCI【1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐】(288mg,1.5mmol)、DMAP(4-二甲氨基吡啶)(25mg,0.2mmol)、Et₃N(三乙胺)(152mg,1.5mmol)和DCM(二氯甲烷)(5mL)存在条件下反应得到产物5-5(363mg,87％)；再将产物5-5(417mg,1mmol)和丁二酸酐6-1(200mg,2mmol)在THF(四氢呋喃)(2mL)存在条件下回流得到产物7-5(513mg,99％)；然后将产物7-5(517mg,1mmol)和N-羟基丁二酰亚胺8-1(173mg,1.5mmol)在EDCI【1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐】(288mg,1.5mmol)和DCM(二氯甲烷)(10mL)存在条件下反应得到产物9-5(571mg,93％)，将产物9-5(13mg,0.02mmol)和毛地黄皂苷(12mg,0.01mmol)在Et₃N(三乙胺)(101mg,1mmol)和THF(四氢呋喃)(1mL)存在条件下反应得到检测试剂2-5。

实施例6：

如图7所示，所述检测试剂2-6的合成包括将化合物3-6(368mg,1mmol)和三缩乙二醇4-1(1.5g,10mmol)在EDCI【1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐】(288mg,1.5mmol)、DMAP(4-二甲氨基吡啶)(25mg,0.2mmol)、Et₃N(三乙胺)(152mg,1.5mmol)和DCM(二氯甲烷)(5mL)存在条件下反应得到产物5-6(445mg,89％)；再将产物5-6(500mg,1mmol)和丁二酸酐6-1(200mg,2mmol)在THF(四氢呋喃)(2mL)存在条件下回流得到产物7-6(593mg,99％)；然后将产物7-6(600mg,1mmol)和N-羟基丁二酰亚胺8-1(173mg,1.5mmol)在EDCI【1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐】(288mg,1.5mmol)和DCM(二氯甲烷)(10mL)存在条件下反应得到产物9-6(641mg,92％)，将产物9-6(14mg,0.02mmol)和毛地黄皂苷(12mg,0.01mmol)在Et₃N(三乙胺)(101mg,1mmol)和THF(四氢呋喃)(1mL)存在条件下反应得到检测试剂2-6。

实施例7：

如图8所示，所述检测试剂2-7的合成包括将7-二乙胺基香豆素-3-羧酸3-1(261mg,1mmol)和六甘醇4-2(2.82g,10mmol)在EDCI【1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐】(288mg,1.5mmol)、DMAP(4-二甲氨基吡啶)(25mg,0.2mmol)、Et₃N(三乙胺)(152mg,1.5mmol)和DCM(二氯甲烷)(5mL)存在条件下反应得到产物5-7(436mg,83％)；再将产物5-7(525mg,1mmol)和丁二酸酐6-1(200mg,2mmol)在THF(四氢呋喃)(2mL)存在条件下回流得到产物7-7(620mg,99％)；然后将产物7-7(625mg,1mmol)和N-羟基丁二酰亚胺8-1(173mg,1.5mmol)在EDCI【1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐】(288mg,1.5mmol)和DCM(二氯甲烷)(10mL)存在条件下反应得到产物9-7(664mg,92％)，将产物9-7(14mg,0.02mmol)和毛地黄皂苷(12mg,0.01mmol)在Et₃N(三乙胺)(101mg,1mmol)和THF(四氢呋喃)(1mL)存在条件下反应得到检测试剂2-7。

实施例8：

如图9所示，所述检测试剂2-8的合成包括将7-二乙胺基香豆素-3-羧酸3-1(261mg,1mmol)和三缩乙二醇4-1(1.5g,10mmol)在EDCI【1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐】(288mg,1.5mmol)、DMAP(4-二甲氨基吡啶)(25mg,0.2mmol)、Et₃N(三乙胺)(152mg,1.5mmol)和DCM(二氯甲烷)(5mL)在室温(25℃)条件下反应24h得到产物5-1(338mg,86％)；再将产物5-1(393mg,1mmol)和戊二酸酐6-2(228mg,2mmol)在THF(四氢呋喃)(2mL)存在条件下回流得到产物7-8(503mg,99％)；然后将产物7-8(507mg,1mmol)和N-羟基丁二酰亚胺8-1(173mg,1.5mmol)在EDCI【1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐】(288mg,1.5mmol)和DCM(二氯甲烷)(10mL)存在条件下反应得到产物9-8(562mg,92％)，将产物9-8(12mg,0.02mmol)和毛地黄皂苷(12mg,0.01mmol)在Et₃N(三乙胺)(101mg,1mmol)和THF(四氢呋喃)(1mL)存在条件下反应得到检测试剂2-8。

实施例9：

如图10所示，所述检测试剂2-9的合成包括将7-二乙胺基香豆素-3-羧酸3-1(261mg,1mmol)和三缩乙二醇4-1(1.5g,10mmol)在EDCI【1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐】(288mg,1.5mmol)、DMAP(4-二甲氨基吡啶)(25mg,0.2mmol)、Et₃N(三乙胺)(152mg,1.5mmol)和DCM(二氯甲烷)(5mL)在室温(25℃)条件下反应24h得到产物5-1(338mg,86％)；再将产物5-1(393mg,1mmol)和丁二酸酐6-1(200mg,2mmol)在THF(四氢呋喃)(2mL)存在条件下回流24h得到产物7-1(490mg,99％)；然后将产物7-1(493mg,1mmol)和N-羟基邻苯二甲酰亚胺8-2(245mg,1.5mmol)在EDCI【1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐】(288mg,1.5mmol)和DCM(二氯甲烷)(10mL)存在条件下反应得到产物9-9(581mg,91％)，将产物9-9(13mg,0.02mmol)和毛地黄皂苷(12mg,0.01mmol)在Et₃N(三乙胺)(101mg,1mmol)和THF(四氢呋喃)(1mL)存在条件下反应得到检测试剂2-9。

实施例10：

如图11所示，所述检测试剂2-10的合成包括将7-二乙胺基香豆素-3-羧酸3-1(261mg,1mmol)和三缩乙二醇4-1(1.5g,10mmol)在EDCI【1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐】(288mg,1.5mmol)、DMAP(4-二甲氨基吡啶)(25mg,0.2mmol)、Et₃N(三乙胺)(152mg,1.5mmol)和DCM(二氯甲烷)(5mL)在室温(25℃)条件下反应24h得到产物5-1(338mg,86％)；再将产物5-1(393mg,1mmol)和丁二酸酐6-1(200mg,2mmol)在THF(四氢呋喃)(2mL)存在条件下回流24h得到产物7-1(490mg,99％)；然后将产物7-1(493mg,1mmol)和4,5,6,7-四氯-N-羟基邻苯二甲酰亚胺8-3(450mg,1.5mmol)在EDCI【1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐】(288mg,1.5mmol)和DCM(二氯甲烷)(10mL)存在条件下反应得到产物9-10(738mg,93％)，将产物9-10(16mg,0.02mmol)和毛地黄皂苷(12mg,0.01mmol)在Et₃N(三乙胺)(101mg,1mmol)和THF(四氢呋喃)(1mL)存在条件下反应得到检测试剂2-10。

实施例11：

如图12所示，所述检测试剂2-11的合成包括将7-二乙胺基香豆素-3-羧酸3-1(261mg,1mmol)和三缩乙二醇4-1(1.5g,10mmol)在EDCI【1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐】(288mg,1.5mmol)、DMAP(4-二甲氨基吡啶)(25mg,0.2mmol)、Et₃N(三乙胺)(152mg,1.5mmol)和DCM(二氯甲烷)(5mL)在室温(25℃)条件下反应24h得到产物5-1(338mg,86％)；再将产物5-1(393mg,1mmol)和丁二酸酐6-1(200mg,2mmol)在THF(四氢呋喃)(2mL)存在条件下回流24h得到产物7-1(490mg,99％)；然后将产物7-1(493mg,1mmol)和1-羟基苯并三唑8-4(203mg,1.5mmol)在EDCI【1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐】(288mg,1.5mmol)和DCM(二氯甲烷)(10mL)存在条件下反应得到产物9-11(580mg,95％)，将产物9-11(12mg,0.02mmol)和毛地黄皂苷(12mg,0.01mmol)在Et₃N(三乙胺)(101mg,1mmol)和THF(四氢呋喃)(1mL)存在条件下反应得到检测试剂2-11。

实施例12：

如图13所示，所述检测试剂2-12的合成包括将7-二乙胺基香豆素-3-羧酸3-1(261mg,1mmol)和三缩乙二醇4-1(1.5g,10mmol)在EDCI【1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐】(288mg,1.5mmol)、DMAP(4-二甲氨基吡啶)(25mg,0.2mmol)、Et₃N(三乙胺)(152mg,1.5mmol)和DCM(二氯甲烷)(5mL)在室温(25℃)条件下反应24h得到产物5-1(338mg,86％)；再将产物5-1(393mg,1mmol)和丁二酸酐6-1(200mg,2mmol)在THF(四氢呋喃)(2mL)存在条件下回流24h得到产物7-1(490mg,99％)；然后将产物7-1(493mg,1mmol)和氯甲酸乙酯8-5(142mg,1.5mmol)在Et₃N(三乙胺)(152mg,1.5mmol)和DCM(二氯甲烷)(10mL)存在条件下反应得到产物9-12(530mg,96％)，将产物9-12(11mg,0.02mmol)和毛地黄皂苷(12mg,0.01mmol)在Et₃N(三乙胺)(101mg,1mmol)和THF(四氢呋喃)(1mL)存在条件下反应得到检测试剂2-12。

所述检测材料3用以限定检测部位、吸取和移除检测试剂；

具体的，所述限位垫片32为圆形，一面可以粘贴在皮肤待检测区域，中间的检测孔用以限定检测区域，作为本发明优选实施例，所述垫片采用聚乙烯发泡材质，内径为7-8mm，外径为18-19mm，厚度为3-4mm，并且可以刚刚置于检测设备中所述检测池16，由于其为圆形的特质，检测部位可以随便旋转而不会导致检测位置的偏移，同时被检测者也能自己调整测试姿势，达到最舒服的状态。

所述试剂吸取管是用以定量吸取一定体积的检测试剂置于检测孔，一次吸取体积为100ul，用于保证每次荧光检测试剂的吸取量一致；所述试剂移除棒是用以将反应后的检测试剂从检测孔移除，棒体为圆柱形，材质为聚丙烯，直径为6-6.5mm，长度为40-50mm；

以荧光检测试剂2-1为例，对检测过程以及检测结果加以说明：在进行本测量之前，需将待测量部位清洗干净；等待检测部位晾干后，贴上限位垫片，将限位垫片置于检测设备1中的检测池16，进行背景荧光测量；待背景荧光测量完成以后，用所述试剂吸取管33吸取荧光检测试剂2-1置于限位垫片32的检测孔，反应1min后用所述试剂移除棒31移除剩余荧光检测试剂；最后，将粘贴限位垫片的检测部位再置于检测设备1中的检测池16，进行皮肤表面胆固醇荧光测量，测量后，经上位机处理以后即可实时得出皮肤表面胆固醇的含量。测量的结果如图14所示，加了检测试剂2-1后的荧光光谱明显区别于皮肤背景的荧光光谱，而且，强度亦明显强于皮肤背景荧光，从理论上验证了其测量的可行性。

另外，依据上述操作步骤，本发明对本荧光试剂的测量时间和原检测试剂的检测时间做了对比，对比结果如图15所示，可以看出，检测时间可由原来的4.4-4.8min缩短至2.2-2.5min，检测效率大大提升，由于减少了被检测者的等待时间，大大提高了被检测者的顺应性。

同时，为了验证本荧光试剂在检测过程中不会随时间的延长而影响测量值，特和A-C-B试剂做了对比试验，实验结果如图16所示，原检测试剂随着测量时间的延长，测量的皮肤胆固醇值会逐步升高，而荧光检测试剂随着时间的延长，其荧光光谱仍然维持在稳定状态，即说明其测量值不会随着测量时间的变化而变化,因此，本荧光检测试剂克服了原检测试剂需要严格控制显色时间的问题，即使检测时耽误几分钟，仍然不会影响测量值，对于操作人员来说，在检测过程中无需时时刻刻关注时间，可降低操作人员的紧张感。

为了进一步验证荧光检测试剂可以区分皮肤表面不同含量的胆固醇，特做了如下实验验证：将同一块猪皮切成相同大小的五块，分别置于胆固醇萃取剂中萃取0min、1min、2min、3min和4min，从而得到不同含量的皮肤表面胆固醇的猪皮样本，再将上述猪皮样本用荧光检测试剂2-1进行表面胆固醇的测量，测量结果如图17所示，随着萃取时间的延长，用检测试剂2-1检测到的皮肤胆固醇含量越来越低，此实验说明，荧光检测试剂可以对不同含量的皮肤胆固醇进行区分。

提供以上实施例仅仅是为了描述本发明的可靠性与可行性，而并非要限制本发明的范围。本发明的范围由所附权利要求限定。不脱离本发明的精神和原理而做出的各种等同替换和修改，均应涵盖在本发明的范围之内。