一种基于核酸适配体肺转移性骨肉瘤组织免疫荧光试剂盒

摘要

本发明提供一种基于核酸适配体肺转移性骨肉瘤组织免疫荧光试剂盒，该试剂盒包括a)抗原修复液，b)清洗液，c)核酸适配体稀释液，d）封闭液，采用标记Cy5的核酸适配体作为荧光探针，标记石蜡包埋的肺转移性骨肉瘤组织。本发明所提供的核酸适配体能够特异性结合肺转移性骨肉瘤细胞，而不结合其他细胞，其作为一种特异性识别肺转移性骨肉瘤的新型分子探针，对于易出现肺转移的骨肉瘤的早期诊断和治疗具有重要的研究意义。本发明所用的石蜡切片免疫荧光染色无需低温保存即能用于肺转移性骨肉瘤组织的病理的诊断检查，特异性强，敏感性高，操作简单，设备要求简单，定位性能好，于国内推广具有现实意义。

说明书

技术领域

本发明涉及组织免疫荧光技术领域，具体涉及一种基于核酸适配体肺转移性骨肉瘤组织免疫荧光试剂盒。

背景技术

骨肉瘤是一类发病率很高的非血液系统性的恶性结缔组织肿瘤，比较常见于儿童和青少年，尤其是青年男性，骨肉瘤一般是由分化程度比较低的成骨细胞所致，它具有非常高的肺转移特性，该瘤恶性程度甚高，预后极差，可于数月内出现肺部转移。

核酸适配体（aptamer）也称为核酸适体、适配子，是指通过指数富集的配基系统进化（Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，SELEX）技术从随机单链DNA/RNA文库中筛选得到的能够高亲合性和高特异性地与靶标分子结合的单链核酸。经过近三十年的发展，核酸适配体的研究取得了许多突破性的进展，核酸适配体具有与靶标分子结合特异性高、亲和力强，以及生物活性稳定、易于合成和保存等优点，成为生命分析化学研究的新方向。核酸适配体的研究从合成方法的改进到分子的修饰改性，再到各种物质的检测分析以及临床疾病诊断的应用，成为当前的热门研究项目。

组织免疫荧光技术是采用荧光物质标记的亲和素或已知抗体作为探针，与待测组织靶抗原结合，使形成的抗原抗体复合物上带有荧光物质，在激发光照射下，荧光物质发出明亮荧光，以此来检测抗原并通过荧光强度进行量化。由于组织免疫荧光技术特异性强，敏感性高，操作简单，设备要求简单，并且在组织中定位性能好，因此，常应用于临床病理诊断及科学研究。

目前关于将核酸适配体用于肺转移骨肉瘤细胞的诊疗的报道较少，并且治疗骨肉瘤面对着许多挑战，比如骨肉瘤细胞非常容易出现肺转移的情况，因此，急需一种有效的诊疗手段，而核酸适配体就可以为骨肉瘤的诊断提供有效的研究手段。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于核酸适配体肺转移性骨肉瘤组织免疫荧光试剂盒，该试剂盒采用修饰了Cy5的核酸适配体作为荧光探针，标记石蜡包埋的肺转移性骨肉瘤组织；更重要的是，采用该试剂盒能够经济、快速、灵敏、准确地对骨肉瘤组织进行检测。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施：

一种基于核酸适配体肺转移性骨肉瘤组织免疫荧光试剂盒及应用，该试剂盒还包括a)抗原修复液，b)清洗液，c)核酸适配体稀释液，d）封闭液，采用修饰了Cy5的核酸适配体作为荧光探针，标记石蜡包埋的骨肉瘤组织；

所述的抗原修复液为0.005 -0.02M、pH 5.0-7.0柠檬酸钠缓冲液；

所述的清洗液为0.0057-0.0077 M、pH 7.2-7.6 PBS缓冲液；

所述的核酸适配体稀释液为200-300nM Cy5标记的核酸适配体；所述核酸适配体的序列为ATC CAG AGT GAC GCA GCA GGT TGA AAT GAT TAA TCC GCA ATA TTT TAT TGG ACA CGG TGG CTT AGT；

所述的封闭液含有3-5mL binding buffer和10-30% FBS和0.05-0.2mg/mL的鲑鱼精DNA。所述的binding buffer含有0.05-0.2mg/mL tRNA，0.5-2mg/mL BSA，4-6mM MgCl₂，>

在本发明的一个优选方案中，抗原修复液是由0.01M 、pH6.0柠檬酸钠缓冲液配制。

在本发明的一个优选方案中，清洗液是由0.0067M、pH 7.4 PBS配制。

在本发明的一个优选方案中，核酸适配体稀释液是由Cy5标记的核酸适配体（250nM）配制。

在本发明的一个优选方案中，封闭液是由4mL binding buffer，20%FBS和0.1 mg/mL的鲑鱼精DNA配制， binding buffer是由 0.1mg/mL tRNA，1 mg/mL BSA，5 mM MgCl₂，4.5mg/mL葡萄糖和0.0067M、pH>

本发明具有以下优点和效果：

1）所用的核酸适配体能够特异性结合骨肉瘤细胞，而不结合其他细胞，其作为一种特异性识别骨肉瘤的新型分子探针，对于易出现肺转移的骨肉瘤的早期诊断和治疗具有重要的研究意义。

2）与传统的冰冻切片相比，所用的石蜡切片具有组织结构保存好、免疫沉淀物清晰、易于判断结果及免疫荧光淬灭时间长等优点。

3）免疫组织化学技术特异性强，敏感性高，操作简单，设备要求简单，且该技术在组织中定位性能好，与冰冻切片免疫荧光染色相比，所用的石蜡切片免疫荧光染色无需低温保存即能用于骨肉瘤组织的病理的诊断检查，于国内推广具有现实意义。

4）所用的试剂盒克服传统方法中的不足，可准确、快速、经济、灵敏地对骨肉瘤组织进行检测。

附图说明

图1为基于核酸适配体肺转移性骨肉瘤组织免疫荧光试剂盒原理示意图。

图2为肺转移性骨肉瘤组织检测结果，其中A为未结合核酸适配体的结果，B为结合核酸适配体的结果。

图3为正常骨组织检测结果，其中A为未结合核酸适配体的结果，B为结合核酸适配体的结果。

具体实施方式

下面结合实施例及附图进一步说明本发明的技术方案。以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；实验材料，如无特殊说明，均为来自常规生化试剂商店购买所得。

实施例中，核酸适配体是按以下序列合成：ATC CAG AGT GAC GCA GCA GGT TGA AAT GAT TAA TCC GCA ATA TTT TAT TGG ACA CGG TGG CTT AGT。

实施例1

基于核酸适配体的肺转移性骨肉瘤组织免疫荧光试剂盒检测肺转移性骨肉瘤组织

1、组织标本的收集：

手术室进行标本取样，在同一患者的骨肉瘤组织组织处取样，用于Cy5标记的染色切片的制作，所有标本均来源于福建医科大学孟超肝胆医院。

2、组织石蜡切片制作：

参照常规流程，具体步骤包括固定（时间为隔夜），洗脱和脱水（6小时），透明（80min），浸蜡和包埋（4小时），切片，贴片与烤片。

3、核酸适配体针对组织石蜡切片的孵育：

（1）将石蜡切片放入60℃烘箱中烘烤2h，使其表面的蜡受热融化；

（2）脱蜡：将石蜡切片浸入二甲苯中2次，每次15min；

（3）水化：将已脱蜡的切片依次浸入95%乙醇中5min，90%乙醇中1-2min，80%乙醇中1-2min，70%乙醇中1-2min。再用PBS洗涤3次，每次1-3min；

（4）用柠檬酸三钠配制抗原修复液，柠檬酸缓冲液为0.01M、pH为6.0；

（5）抗原修复：将切片浸入抗原修复液中，煮沸加热约20min，室温下自然冷却，分别用灭菌水洗1次，PBS洗3次；

（6）由0.1mg/mL tRNA ，1mg/mL BSA， 5mM MgCl₂，>

（7）使用阻水笔圈划范围，室温下将切片浸入封闭液30min，然后甩掉液体；PBS洗3次，每次1-3min；

（8）取适量的核酸适配体溶于binding buffer中，震荡离心后，于95℃变性5min，然后在冰上复性10min；

（9）加入终浓度为250nM，Cy5标记的核酸适配体，于4℃下避光孵育2h，然后用PBS洗涤三次，每次3-5min；

（10）用DAPI Fluoromount-GTM抗荧光淬灭封片剂（含DAPI）封片。封片后，要2-4h后片子才可以完全干；

（11）在显微镜下进行观察：检测结果如图2所示，未结合核酸适配体的组织无荧光现象，而结合了核酸适配体的骨肉瘤组织具有明显的红色荧光。

实施例2

基于核酸适配体的肺转移性骨肉瘤组织免疫荧光试剂盒检测正常骨组织

1、组织标本的收集：

手术室进行标本取样，在同一患者的正常骨组织组织处取样，用于Cy5标记的染色切片的制作，所有标本均来源于福建医科大学孟超肝胆医院。

2、组织石蜡切片制作：

参照常规流程，具体步骤包括固定（时间为隔夜），洗脱和脱水（6小时），透明（80min），浸蜡和包埋（4小时），切片，贴片与烤片。

3、核酸适配体针对组织石蜡切片的孵育：

（1）将石蜡切片放入60℃烘箱中烘烤2h，使其表面的蜡受热融化；

（2）脱蜡：将石蜡切片浸入二甲苯中2次，每次15min；

（3）水化：将已脱蜡的切片依次浸入95%乙醇中5min，90%乙醇中1-2min，80%乙醇中1-2min，70%乙醇中1-2min。再用PBS洗涤3次，每次1-3min；

（4）用柠檬酸三钠配制抗原修复液，柠檬酸缓冲液为0.01M、pH为6.0；

（5）抗原修复：将切片浸入抗原修复液中，煮沸加热约20min，室温下自然冷却，分别用灭菌水洗1次，PBS洗3次；

（6）由0.1mg/mL tRNA ，1mg/mL BSA， 5mM MgCl₂，>

（7）使用阻水笔圈划范围，室温下将切片浸入封闭液30min，然后甩掉液体；PBS洗3次，每次1-3min；

（8）取适量的核酸适配体溶于binding buffer中，震荡离心后，于95℃变性5min，然后在冰上复性10min；

（9）加入终浓度为250nM，Cy5标记的核酸适配体，于4℃下避光孵育2h，然后用PBS洗涤三次，每次3-5min；

（10）用DAPI Fluoromount-GTM抗荧光淬灭封片剂（含DAPI）封片。封片后，要2-4h后片子才可以完全干；

（11）在显微镜下进行观察：检测结果如图3所示，未结合核酸适配体与结合了核酸适配体的正常骨组织几乎都没有荧光。

结果证明，本发明中基于核酸适配体的肺转移性骨肉瘤组织免疫荧光试剂盒能特异性检测肺转移骨肉瘤组织。

SEQUENCE LISTING

<110> 福州大学

<120> 一种基于核酸适配体肺转移性骨肉瘤组织免疫荧光试剂盒

<130> 1

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

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<212> DNA

<213> 核酸适配体

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cttagt 66