一种具有精确连续微米级结构的大分子晶体的高通量制备平台及方法

摘要

本发明属于结晶技术领域，提供一种具有精确连续微米级结构的大分子晶体的高通量制备平台及方法。结晶平台用微原件利用现阶段已经开发的精密加工技术，加工出具有特定微米级表面形状的凸起结构和凹槽结构的结晶平台；通过矩阵式滴加装置，将液滴批量地滴在微原件上，通过控制微元件平台周围温湿度条件，控制液滴形态及蒸发的速率保证目标物系目标晶型的产出。该方法能对所有可结晶物系，尤其是已提取的少量稀有药物提供结晶场所，操作简单，周围环境要求低，药品流失量少，是一种简单环保，可大批量重复的结晶技术。

说明书

技术领域

本发明属于结晶技术领域，尤其是涉及一种具有精确连续微米级结构的大分子晶体的高通量制备平台及方法。

背景技术

结晶分离在无机盐制备，药物合成，生物大分子结构分析等领域都有重要的作用，以常用有机药物，生物大分子为代表的大分子的结晶培养技术是当今制药行业中使用最频繁的技术之一。对于不同药物结晶的快速培养和连续化制备是目前结晶工业研究的热点之一。

常用的大分子结晶培养技术可以利用膜结晶浓度极化浓缩，或液滴气相扩散方法。膜结晶浓缩法是最近比较先进的结晶手段，参考CN 105582810 A公开的尿素结晶方法，利用液膜附近浓度差进行浓缩，获得粗晶并进行纯化的方法，该方法操作简单，晶体粒径分布均匀且产量高；液滴气相扩散是常用的结晶手段，且主要使用在蛋白质结晶培养过程，是大分子晶体主要结晶方式。利用大分子溶液水份扩散浓缩，使大分子达到过饱和状态析出，该方法操作简单，成本低廉，因此被广泛使用。

由于现阶段病理的研究深入，一些大分子药物结构得到了大量的改进革新，并通过结晶技术来满足医药市场的需求。比如CN 201110190143.X广东白云山制药药厂公开了一种铵盐药物结晶配方，CN 2014102810605公开了一种阿利沙坦酯晶型及其制备方法等。只不过由于频繁的药物成分更新，对于大分子的结晶培养提出了高重复性，高通量，高产出的生产要求。对于现阶段的大分子结晶培养方法来说，很难满足大分子药物的结晶需要。传统的结晶工艺很难在研发初期应对不同的大分子药物，开展高通量，宽范围工艺条件的筛选，很大程度上制约了大分子结晶工艺开发效率，推广和应用进程。因此开发一种能够连续生产，可重复性高，且处理量大的高通量大分子结晶培养平台和方法显得尤为重要。

目前，大部分大分子结晶培养过程的专利多集中在以蛋白质为主的生物大分子培养方法上，如CN101161871.B和CN1863946.A，该方法设计大量的蛋白质晶体培养阵列，并附带了晶体采集等功能，在蛋白质结晶过程中使用不同的结晶沉淀剂和密封剂。但是，同样的沉淀剂和密封剂对于非蛋白质类其他大分子药物来说不具有普适性，由于晶体培养的空间过小，不利于大分子药物高通量析出，无法大批量的制备。CN 101522277.B公开了一种培养生物大分子的方法，采用一定的点阵列，利用密封条件下大分子液滴蒸发扩散到缓冲溶液来培养生物大分子，但是该方法培养的大分子晶体不能利用高效的提取手段拿出培养的生物大分子，只适合利用不同的缓冲溶液来培养生物大分子，不满足高通量的要求。

发明内容

本发明的目的在于提供一种大分子晶体结晶的高通量培养和工艺筛选技术，结晶平台用微原件可以利用现阶段已经开发的精密加工技术，诸如高精度 3D打印技术，纳米压印技术，高精度光刻技术等，加工出具有特定微米级表面形状的凸起结构(点阵结构或凹槽的凸起结构均包含在内)，或者加工出具有特定尺寸的凹槽结构的平用微元件平台。通过矩阵式滴加装置，将液滴批量地滴在微原件上，通过控制微元件平台周围温湿度条件，控制液滴形态及蒸发的速率保证目标物系目标晶型的产出。该方法能对所有可结晶物系，尤其是已提取的少量稀有药物提供结晶场所，操作简单，周围环境要求低，药品流失量少，是一种简单环保，可大批量重复的结晶技术。

本发明的结晶工作原理在于：液滴滴在具有规则的凸起或者凹陷结构的平板上相对于普通平面平板具有一定的多样性，可以滴出以下五种液滴的形式：凸起表面液滴，凹陷内部液滴，横跨凸起表面液滴，固定在凸起边角的液滴和固定在凹陷边角的液滴。

一种具有精确连续微米级结构的大分子晶体的高通量制备平台及方法，步骤如下：

步骤一、设计并构造适用于目标结晶体系的结晶平台：

结晶平台包括凸起结构和凹陷结构；

根据实际需求，选择布局形式不同的凸起结构和凹陷结构形成的晶体平台，有两种布局形式；

第一种布局形式为点阵布局，凸起结构位于结晶平台的一侧，按照点阵布局；凹陷结构位于结晶平台的另一侧，按照点阵布局；

第二种布局形式为坑道布局，凸起结构和凹陷结构交替布局，形成坑道式的结晶平台；

根据目标晶体体系的形貌，确定凸起结构和凹陷结构的尺寸，凸起结构或凹陷结构的高度为10μm～500μm；

若是大量晶体的产出，晶体平台设计成坑道形式，方便反溶剂的清洗；若是晶体的筛选，晶体平台设计成点阵形式，提高晶体筛选的可重复性；

所述的结晶平台的材料为对目标结晶体系无反应的材料；

步骤二、将目标结晶体系与溶剂配置均相溶液，置于20～30℃温度条件下备用；对结晶平台进行消毒处理；其中，所述的溶剂为蒸馏水或无水乙醇；

步骤三、在20～30℃温度、30～50％湿度和常压条件下，将步骤二配置的均相溶液添加到精密注样器中，控制精密注样器滴加在结晶平台上；其中，控制精密注样器针头对准晶体平台的凸起结构，控制滴加体积小于0.1μl，滴出凸起表面液滴；控制精密注样器针头对准晶体平台的凹陷结构，控制滴加体积小于 0.1μl，滴出凹陷内部液滴；控制精密注样器针头对准晶体平台的凹陷结构，控制滴加体积大于0.1μl，横跨至少凸起结构，其液滴形态视为横跨凸起表面液滴；

步骤四、在液体完全蒸发出晶之后，采取如下操作手段获取晶体：

(1)选择针尖尖端小于50μm的细针来筛选特定晶型的晶体；

(2)根据结晶物系采用反溶剂冲洗获得所需要的晶体。

与现有的技术相比，本发明的优点在于：

(1)本发明方法操作简单，外界环境控制简单，可选择的结晶物系广泛，对大部分结晶过程尤其是大分子结晶具有一定的可操作性

(2)结晶平台设计灵活，材料选择可以根据结晶物系，灵活选择可使用的加工材料

(3)间歇操作，操作灵活，装置规模放大简单可行，可通过并联、串联等耦合，进一步提升通量。

附图说明

图1为本发明常用的结晶平台设计方案示意图。

图2为液滴滴加在结晶平台的状态示意图。

图3为高通量结晶过程操作示意图。

图4(a)为凸起表面尿酸钠晶体形貌照片。

图4(b)为坑道内洗出尿酸钠晶体形貌照片。

图中：1凸起表面液滴；2凹陷内部液滴；3横跨凸起表面液滴；

4固定在凸起边角的液滴；5固定在凹陷边角的液滴；6注样器控制系统；

7注样器；8微米级规则平台(10微米到500微米)；

9液滴滴加凹槽(反溶剂清洗通道)。

具体实施方式

以下结合附图和上述技术方案，以尿酸钠结晶为例，进一步说明本发明的具体实施方式。

实施例1点阵结晶方案

用3D打印机加工出具有0.5mm*0.5mm，12*12凸起点阵，材料选择商用的光敏树脂，3D打印技术选择白光扫描激光打印技术(DLP技术)，完成上述的结晶平台设计和加工。配置8mM尿酸钠溶液(尿酸+NaOH)，利用注样器分别向凸起，凹陷，横跨凸起，固定在凸起边角和固定在凹陷边角滴加液滴，结晶过程结束之后利用电镜照片观察所结晶的体系，其结晶形貌如图4(a)所示。

实施例2凸起凹陷坑道结晶方案

用上述打印机加工0.5mm深，0.5mm宽的坑道，材料选择商用的光敏树脂。配置8mM尿酸钠溶液(尿酸+NaOH)，利用注样器向凹陷处滴加足以覆盖两侧凸起的液滴，结晶结束之后利用饱和溶液洗出(反溶剂)，观察获得晶体的形貌，其形貌如图4(b)所示。