红波罗花碱A及其衍生物在制备预防或治疗中枢神经系统疾病药物中的应用

摘要

本发明公开了一种红波罗花碱A及其衍生物在制备预防或治疗中枢神经系统疾病药物中的应用。本发明提供的红波罗花碱A可以保护PC12细胞免受谷氨酸损伤，并有效治疗缺血性脑卒中所致脑损伤。本发明以谷氨酸作为损伤剂作用于PC12细胞，实验结果表明红波罗花碱A对谷氨酸所致神经细胞损伤具有一定的修复保护作用。同时，红波罗花碱A能有效控制急性脑卒中的进展，减少梗死面积，改善神经功能缺失，具有显著的神经保护作用。因此，红波罗花碱A及其衍生物作为一种潜在的神经保护剂在中枢神经系统疾病的治疗及药物开发中具有广泛的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体的说，涉及一种红波罗花碱A及其衍生物在制备预防或治疗中枢神经系统疾病药物中的应用。

背景技术

脑卒中(cerebral stroke)是一种常见的脑血管突发事件，包括缺血性和出血性卒中，具有发病率高、死亡率高、致残率高的特点。急性缺血性脑卒中是最常见的脑卒中类型，约占全部脑卒中的60％-80％，临床上表现为一过性或永久性脑功能障碍的症状和体征。目前对急性脑卒中具有确切治疗效果的药物有重组组织型纤溶酶原激活剂(recombinant tissue-plasminogen activator，rt-PA)。Rt-PA也是目前美国食品与药品管理局(FDA)批准治疗急性脑卒中的唯一药品，但也存在着治疗窗窄、并发症频发等缺点。

兴奋性神经毒性即由兴奋性神经递质-谷氨酸受体的过度持续活化而导致的神经元死亡过程。诸多神经科疾病，包括神经退行性疾病、脑卒中、癫痫等均表现有兴奋性氨基酸损伤的病理过程。因此，开发能有效改善兴奋性神经毒性的药物成为预防脑卒中等疾病的研究热点。

谷氨酸是中枢神经系统含量最高、分布最广、作用最强的兴奋性神经递质，参与快速兴奋性突触传递(Y.Zhou·N.C.Danbolt.Glutamate as a neurotransmitter in thehealthy brain.J Neural Transm(2014)121:799–817)。在缺血性脑卒中等疾病中，细胞间隙的谷氨酸浓度升高，谷氨酸受体过度活化，进而对神经元产生兴奋性毒性，使得Ca²⁺大量内流，细胞内Ca²⁺浓度升高，活性氧簇ROS增多，线粒体功能紊乱，最终导致神经元功能紊乱甚至死亡(Timothy>

红波罗花碱A(Delavatine A)是从红波罗花药材提取物的生物碱部位分离得到的一个骨架新颖的异喹啉类生物碱(Zhongyin Zhang,Fan Yang,Jian-Jun Fu,Yun-HengShen,Weiwei Heand Wei-Dong Zhang.Delavatine A,a structurally unusualcyclopenta[de]isoquinoline alkaloid from Incarvillea delavayi.RSC Adv.(2016)6:65885)。红波罗花(Incarvillea delavayi)，是紫葳科(Bignoniaceae)角篙属(Incarvillea L.)植物，多年生无茎草本，根部作为鸡肉参入药。味甘、淡，温。补气益血。主治病后气血不足，头晕神疲，产后少乳，有滋补强壮的作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种红波罗花碱A(Delavatine A)及其衍生物在制备预防或治疗中枢神经系统疾病药物中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明的一个方面提供了一种红波罗花碱A(Delavatine A)及其衍生物在制备预防或治疗中枢神经系统疾病药物中的应用。

所述红波罗花碱A的衍生物包括红波罗花碱A的结构式18位醛基的氧化还原及其取代物(包括甲基及其卤代物)、醛缩合产物、醛氧化产物、氧化后酯代产物；红波罗花碱A的2位碳原子、15位碳原子的手性异构体及其药学上可接受的盐。

所述红波罗花碱A的化学结构如式I所示：

所述红波罗花碱A的手性异构体具有手性(2、15位碳原子为手性碳原子)，它们可以是对映异构体混合物或非对映异构体混合物的形式，或者可以是单个对映异构体或单个非对映异构体形式。如：2、15位可以为S或R或S与R混旋体。

所述药学上可接受的盐是指化合物红波罗花碱A(Delavatine A)及其衍生物与盐酸、草酸、氢溴酸、硫酸、氢氟酸、硝酸、甲酸、磷酸、乙酸、丙酸、丙二酸、草酸盐、琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、苦味酸、甲磺酸、乙磺酸、羟乙磺酸、对甲苯磺酸、苯磺酸、萘磺酸、三氟乙酸或天冬氨酸生成的药学上可接受的盐。

所述预防或治疗中枢神经系统疾病药物是以红波罗花碱A及其衍生物唯一活性成分作为药物，或红波罗花碱A及其衍生物与药学上允许的一种或多种辅料构成的药物组合物作为药物。

所述预防或治疗中枢神经系统疾病药物中，红波罗花碱A及其衍生物的含量为0.1％-99.9％。

所述预防或治疗中枢神经系统疾病药物可以和药剂学上的常规药用辅料制成药物制剂。药剂学上的常规药用辅料如防腐剂、稳定剂、L-氨基酸、填充剂、稀释剂、崩解剂、粘合剂、抗粘着剂、助流剂、润滑剂、包衣、芳香剂、着色剂、甜味剂、栓剂、软膏基质、悬浮剂、增粘剂、硬化剂、pH调节剂、乳化剂、滋润剂、增溶剂、吸附剂、干燥剂、保湿剂、渗透剂等。

所述药物制剂的剂型为片剂、分散片、含片、口崩片、缓释片、胶囊剂、软胶囊剂、滴丸、丸剂、微囊微球制剂、栓剂、软膏剂、喷雾剂、靶向制剂、颗粒剂、注射剂、粉针剂或气雾剂等药学上可接受的剂型。

所述药物制剂的给药方式为口服、非肠道、脑内直接给药、鼻腔脑靶向给药、基因工程法、受体介导转运法给药或其它局部途径给药。

所述中枢神经系统疾病包括神经退行性疾病、脑卒中、癫痫、脑外伤、休克、HIV痴呆、青光眼、多发性硬化症等。兴奋性神经毒性可引起中枢神经系统病变，包括脑卒中等疾病，脑卒中分为出血性和缺血性脑卒中。

所述的神经退行性疾病包括阿尔兹海默症、小脑萎缩症、多发性硬化症、原发性侧索硬化、脊髓性肌萎缩症、帕金森病、亨廷顿氏病、克雅二氏病、牛海绵状脑病、共济失调毛细血管扩张症、肌肉萎缩性侧索硬化症。

所述的脑卒中，具体是指缺血性脑卒中。

所述红波罗花碱A及其衍生物的结构式如下：

所述红波罗花碱A及其衍生物作为活性成份和医学上可接受的载体用作神经保护剂。本发明的红波罗花碱A(Delavatine A)及其衍生物能有效缓解兴奋性神经毒性，具有神经保护作用能有效减轻缺血性脑卒中损伤。

本发明采用CCK-8法、LDH法、相差显微镜观察法、流式细胞术、LIVE/DEAD细胞染色、FRAP检测、Western Blot实验，充分证明了红波罗花碱A(Delavatine A)对谷氨酸损伤的PC12细胞具有较好的保护作用。

本发明中的细胞为高分化的大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞株、PC12细胞株。PC12细胞主要分泌产物为儿茶酚胺类递质，经神经生长因子及其类似物诱导分化成具有交感神经相似的形态和功能。同时，兴奋性神经毒性模型的建立是通过在PC12细胞培养基中添加终浓度为5mM的谷氨酸，细胞间隙过量的谷氨酸使得谷氨酸受体过度活化，Ca²⁺从细胞外大量流入细胞内，线粒体功能紊乱，ROS、NO等大量产生，最终导致细胞死亡。

本发明采用大鼠脑中动脉阻塞模型(MCAO模型)进行神经行为学评分和梗死面积检测，实验结果表明红波罗花碱A(Delavatine A)能显著改善急性缺血性脑损伤，对缺血性脑卒中具有较好的治疗作用。因此，红波罗花碱A(Delavatine A)可以用作制备由谷氨酸引起的兴奋性神经毒性及抗脑缺血、具有神经保护作用的药物。

由于采用上述技术方案，本发明具有以下优点和有益效果：

本发明提供的一种红波罗花碱A(Delavatine A)及其衍生物在制备预防或治疗中枢神经系统疾病药物中的应用，通过体外培养PC12细胞，表明红波罗花碱A(DelavatineA)可通过增加细胞存活率，降低LDH释放、Ca²⁺内流和ROS生成，抑制Caspase-3活性，调控线粒体依赖的细胞凋亡通路，从而保护PC12细胞免受谷氨酸的兴奋性毒性损伤。同时，采用体内MCAO动物实验，表明红波罗花碱A(Delavatine>

本发明提供的一种红波罗花碱A(Delavatine A)及其衍生物在制备预防或治疗中枢神经系统疾病药物中的应用，红波罗花碱A(Delavatine A)及其衍生物可以改善兴奋性神经毒性、缓解缺血性脑卒中。具体地，本发明提供的红波罗花碱A(Delavatine A)可以保护PC12细胞免受谷氨酸损伤，并有效治疗缺血性脑卒中所致脑损伤。本发明以谷氨酸作为损伤剂作用于PC12细胞，实验结果表明红波罗花碱A(Delavatine A)对谷氨酸所致神经细胞损伤具有一定的修复保护作用；可有效缓解谷氨酸引起的细胞凋亡，维持细胞形态，增强细胞活力，降低细胞内LDH的释放，抑制Ca²⁺内流，降低细胞内Ca²⁺的浓度，同时降低活性氧簇ROS的释放，并显著降低促凋亡蛋白PARP的活化，升高抗凋亡蛋白Bcl家族Bcl-2的表达。同时，红波罗花碱A(Delavatine>

附图说明

图1是采用CCK8法检测PC12细胞的存活率的示意图。

图2是采用LDH法考察红波罗花碱A(Delavatine A)的保护率(图2A所示)，并计算其EC₅₀值的示意图(图2B所示)。

图3是采用荧光显微镜观察红波罗花碱A(Delavatine A)对Glu损伤后细胞形态的影响的示意图。

图4是采用流式细胞术考察红波罗花碱A(Delavatine A)对细胞凋亡的影响的示意图。

图5是采用流式检测红波罗花碱A(Delavatine>2+含量的影响的示意图。

图6是采用Western blot检测PC12细胞凋亡蛋白的相对表达水平的示意图。

图7是采用红波罗花碱A(Delavatine A)对脑缺血大鼠的保护作用的示意图。

图8是014与其光学异构体(15R,2S)-红波罗花碱A(Delavatine A)对谷氨酸损伤细胞的保护作用示意图。

图1～8中均采用编号014表示化合物红波罗花碱A(Delavatine A)，###表示相比对照组，t检验时p<0.05；***表示相比Glu损伤组，t检验时p<0.01；**表示相比Glu损伤组，t检验时p<0.05。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。本发明实施例所用试剂除另有注明，均可以从销售公司获得。

本发明实施例中，Tubulin表示微管蛋白，Annexin V-FITC表示异硫氰酸荧光素标记的膜联蛋白-V，PI表示碘化丙啶，cleaved PARP表示被剪切过的死亡底物。

本发明中，图1～8中均采用编号014表示化合物红波罗花碱A(Delavatine A)，###表示相比对照组，t检验时p<0.05；***表示相比Glu损伤组，t检验时p<0.01；**表示相比Glu损伤组，t检验时p<0.05。

实施例1

细胞培养与处理

1、仪器与试剂：

大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞株(PC12)；DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、PBS缓冲液、CO₂细胞培养箱、96孔细胞培养板、细胞培养超净工作台、低温超速离心机、倒置相差显微镜、微量移液器、全自动酶标仪。

2、实验方法：

(1)PC12细胞体外培养

用添加了10％(v/v)胎牛血清、100U/mL青霉素以及100U/mL链霉素的DMEM培养基进行培养，在温度37℃、5％CO₂条件下生长至80％-90％汇合时进行细胞传代。倾倒去除培养器皿内的培养基，用PBS洗涤细胞1次，弃去PBS，根据培养面积加入适量0.1％胰酶溶液消化，37℃放置1min，并在倒置相差显微镜下观察，待到绝大部分细胞变圆并悬浮后弃去胰酶并加入培养基终止消化，吹吸几次以离散成团的细胞，按1:5比例进行细胞传代，传代后的细胞24h后换液一次。

(2)CCK8法检测化合物的细胞毒性

将对数生长期细胞稀释成0.8×10⁵Cells/mL，每孔100μl培养基，接种于96孔板，放入37℃、5％CO₂培养箱中培养24h，向细胞内加入红波罗花碱A(Delavatine>

(3)CCK8法检测细胞活力

将对数生长期细胞稀释成0.8×10⁵Cells/mL，每孔100μl培养基，接种于96孔板，放入37℃、5％CO₂培养箱中培养24h，向细胞内加入红波罗花碱A(Delavatine>

3、实验结果：

如图1所示，图1是采用CCK8法检测PC12细胞的存活率的示意图。用CCK8法检测不同浓度红波罗花碱A(Delavatine A)溶液的细胞毒性，如图1A所示，图1A中，Ctrl为空白组，Glu为谷氨酸组，014为药物组；从图1A中可以看出，0.039-5μM浓度范围的红波罗花碱A(Delavatine A)对PC12细胞没有表现出明显的毒性，10μM以上时表现出一定的细胞毒性。

用CCK8法检测不同浓度红波罗花碱A(Delavatine A)溶液对谷氨酸损伤的PC12细胞的保护作用，如图1B所示，图1B中，Ctrl为空白组，Glu为谷氨酸组，Glu+014为谷氨酸+药物组；从图1B中可以看出，0.25-5μM浓度梯度范围内的红波罗花碱A(Delavatine A)可剂量依赖性地升高谷氨酸损伤后的PC12细胞的存活率。

实施例2

乳酸脱氢酶检测试剂盒检测PC12细胞乳酸脱氢酶(LDH)的释放

1、仪器与试剂：

大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞株(PC12)；DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、PBS缓冲液、CO₂细胞培养箱、96孔细胞培养板、细胞培养超净工作台、低温超速离心机、倒置相差显微镜、微量移液器、乳酸脱氢酶检测试剂盒、全自动酶标仪。

2、实验方法：

(1)PC12细胞体外培养，同实施例1。

(2)检测PC12细胞乳酸脱氢酶(LDH)的释放量。

将对数生长期细胞稀释成0.8×10⁵Cells/mL，每孔100μl培养基，接种于96孔板，放入37℃、5％CO₂培养箱中培养12h，向细胞内加入红波罗花碱A(Delavatine>50值。所有的操作在相同的实验条件下重复三次(n＝3)。

3、实验结果：

用LDH法检测不同浓度红波罗花碱A(Delavatine A)溶液对谷氨酸损伤的PC12细胞LDH释放的缓解作用，如图2所示，图2是采用LDH法考察红波罗花碱A(Delavatine A)的保护率(图2A所示)，并计算其EC₅₀值的示意图(图2B所示)。从图2A中可以看出014在0.001-10μM浓度范围内对谷氨酸损伤PC12细胞的保护率随014浓度升高而升高，最高可达78％，从图2B中可以看出，通过计算得出化合物014对谷氨酸损伤PC12细胞的EC₅₀，综上所述，红波罗花碱A(Delavatine>50值为0.2μM。

实施例3

荧光染色检测细胞损伤

1、仪器与试剂：

大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞株(PC12)；DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、PBS缓冲液、CO₂细胞培养箱、12孔细胞培养板、细胞培养超净工作台、低温超速离心机、微量移液器、倒置相差荧光显微镜、LIVE/DEAD细胞染色试剂盒。

2、实验方法：

(1)PC12细胞体外培养，同实施例1。

(2)荧光染色检测谷氨酸损伤的PC12细胞。

将对数生长期细胞稀释成1×10⁵Cells/mL，每孔1mL培养基，接种于12孔板，放入37℃、5％CO₂培养箱中培养12h，向细胞内加入红波罗花碱A(Delavatine>

3、实验结果：

荧光显微拍照观察不同浓度的化合物作用后细胞的存活与凋亡情况(图3A)，及细胞形态的变化(图3B)，如图3所示，图3是采用荧光显微镜观察红波罗花碱A(Delavatine A)对Glu损伤后细胞形态的影响的示意图，其中，图3A和3B中，每张图从中间一分为二，左半边代表活细胞，右半边代表死细胞。图3A表示荧光显微拍照观察不同浓度的化合物作用后细胞的存活与凋亡情况示意图，图3B表示荧光显微拍照观察不同浓度的化合物作用后细胞形态的变化，图3中，Ctrl表示空白组，Glu表示谷氨酸组，Glu+014 0.25μM表示谷氨酸+0.25μM药物组，Glu+014 0.5μM表示谷氨酸+0.5μM药物组，Glu+014 1μM表示谷氨酸+1μM药物组，Glu+014 2.5μM表示谷氨酸+2.5μM药物组。

由图3可知，与正常对照组相比，Glu损伤后的细胞呈现出明显的胞体皱缩，胞质空泡化，甚至细胞碎片化等细胞凋亡的形态，且荧光染色后可见活细胞明显减少，死细胞明显增多的现象。加入不同浓度的红波罗花碱A(Delavatine A)溶液后，可剂量依赖地减少死亡细胞的数量，保持正常的细胞形态，随化合物浓度升高正常状态活细胞数越高。

实施例4

流式细胞术检测细胞凋亡

1、仪器与试剂：

大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞株(PC12)；DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、PBS缓冲液、CO₂细胞培养箱、6孔细胞培养板、细胞培养超净工作台、低温超速离心机、微量移液器、细胞凋亡试剂盒(FITC>

2、实验方法：

将对数生长期细胞稀释成1.5×10⁵Cells/mL，每孔2mL培养基，接种于6孔板，放入37℃、5％CO₂培养箱中培养12h，向细胞内加入红波罗花碱A(Delavatine>

3、实验结果：

如图4所示，图4是采用流式细胞术考察红波罗花碱A(Delavatine A)对细胞凋亡的影响的示意图。图4A表示双染色细胞分区图，图4B表示凋亡细胞柱状图。图4A中，Ctrl为空白组，Glu为谷氨酸组，Glu+014 0.1μM为谷氨酸+0.1μM药物组，Glu+014 0.5μM为谷氨酸+0.5μM药物组，Glu+014 1μM为谷氨酸+1μM药物组，Glu+014 5μM为谷氨酸+5μM药物组；图4B中，Ctrl为空白组。

在图4A中第一象限为活细胞，第二象限为凋亡早期细胞，第三象限为凋亡晚期细胞，第四象限为死亡细胞，从图4A可以看出谷氨酸损伤后第三象限凋亡细胞明显增多，加入化合物可明显降低第三象限细胞数，从图4B中可以看出0.5-5μM化合物组，凋亡细胞随化合物浓度升高而降低，综上所述，Glu损伤后可显著升高细胞凋亡率，加入红波罗花碱A(Delavatine A)溶液后，在0.5-5μM浓度范围可明显降低由Glu造成的细胞凋亡。

实施例5

红波罗花碱A(Delavatine>2+含量的影响

1、仪器与试剂：

大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞株(PC12)；DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、PBS缓冲液、CO₂细胞培养箱、6孔细胞培养板、细胞培养超净工作台、低温超速离心机、微量移液器、ROS检测试剂盒、Ca²⁺检测试剂盒、流式细胞仪。

2、实验方法：

将对数生长期细胞稀释成1.5×10⁵Cells/mL，每孔2mL培养基，接种于6孔板，放入37℃、5％CO₂培养箱中培养12h，向细胞内加入红波罗花碱A(Delavatine>2+：Ex＝340nm；Em＝510nm)。

3、实验结果：

红波罗花碱A(Delavatine A)可有效缓解谷氨酸损伤后PC12细胞内活性氧(ROS)的生成及Ca²⁺的内流。如图5所示，图5是采用流式检测红波罗花碱A(Delavatine>2+含量的影响的示意图；图5A表示相较于空白组，对照组与药物组PC12细胞内活性氧(ROS)含量所占的百分比图，图5B表示相较于空白组，对照组与药物组PC12细胞内钙离子(Ca²⁺)含量所占的百分比图，图5A和5B中，Glu为谷氨酸组，Ctrl为空白组，Glu+014为谷氨酸+药物组；从图5A中可以看出造模后(谷氨酸损伤后)细胞内ROS产生明显增多，加入化合物可剂量依赖地降低ROS的产生，从图5B中可以看出造模后细胞内Ca²⁺产生明显增多，加入化合物可剂量依赖地降低Ca²⁺的产生。综上所述，从图5中可以看出，谷氨酸作用后，细胞内ROS显著升高，Ca²⁺大量内流，药物作用后可剂量依赖地减少二者细胞内的含量。

实施例6

Western blot检测凋亡相关蛋白表达

1、仪器与试剂：大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞株(PC12)；DMEM培养基；胎牛血清；胰蛋白酶；PBS缓冲液；牛血清白蛋白(BSA)；组织蛋白裂解液；BCA蛋白浓度测定试剂盒；SDS；PVDF膜；抗体：兔抗人Bcl-2单克隆抗体、兔抗人Cleaved PARP单克隆抗体、兔Tubulin多克隆抗体；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔的二抗；乙醇；3％过氧化氢；培养皿；CO₂细胞培养箱；数显恒温搅拌循环水浴锅；细胞培养超净工作台；低温超速离心机；倒置显微镜；微量移液器；SDS-PAGE凝胶电泳及转膜仪；全自动酶标仪；Odyssey双色红外激光成像系统；-80℃超低温冰箱。

2、实验方法：

1)细胞总蛋白的提取：将对数生长期细胞稀释成1.5×10⁵Cells/mL，每孔2mL培养基，接种于6孔板，放入37℃、5％CO₂培养箱中培养12h，向细胞内加入红波罗花碱A(Delavatine>

2)BCA法测定总蛋白浓度：取适量的蛋白标准品，并在96孔板的第一排中按0、1、2、4、8、12、16、20ul加入孔中，每个孔中加入磷酸盐缓冲液(PBS)补足到20ul，最后再在每个孔里面加入BCA工作液：A+B液(A:B＝50:1)200ul，温箱中放置半小时后在酶标仪上完成标准曲线的绘制；取2ul蛋白样品溶液加入96孔板中，同时每孔加入BCA工作液：A+B液(A:B＝50:1)液200ul，37℃振摇半小时后放入酶标仪检测总蛋白的浓度。

3)SDS-PAGE电泳制备：

配分离胶：根据待测目的蛋白的分子量的大小而配置不同浓度的分离胶，反复吹打十余下后把分离胶分别加入安装好的制胶槽内，胶的高度最好离小玻璃板3cm左右，待加完胶后加入超纯水，可以使分离胶平坦外还可以促进分离胶的凝固。30min后观察发现分离胶已经聚合则可以开始制备浓缩胶。

配浓缩胶：去掉分离胶上层封的水，最后用滤纸吸干净，迅速放入刚刚制备的浓缩胶；然后两边同时插入梳子，这样可以减少气泡的混入。放置1.5h至凝胶完全聚合备用。

4)样品上样：将制备好的胶固定到电泳槽里面，倒入足够的电泳液，将梳子拔出，取出处理好的样品，按照样品的顺序依次加样。蛋白上样量为50μg，并加入蛋白上样缓冲液。变性样品点离后上样跑SDS-PAGE胶。

5)垂直电泳：把样品加入梳子所形成的上样孔后，调节电压至80V恒压，时间为30min，待样品电泳至分离胶和浓缩胶的交界处时可以改变电泳条件，改为110V恒压，电泳时间为90min，使样本在分离胶中迅速分离，待所需检测的蛋白分子量的条带分离明显并且溴酚蓝带将达到胶的底部时，停止电泳。

6)转膜：将与分离胶大小一致的PVDF膜在含1×Transfer Buffer中浸泡15min，与分离胶、滤纸和海绵垫一起放入预冷的1×Transfer Buffer中浸泡5min。按照说明安装转膜系统：从负极到正极依次为海绵垫、滤纸、分离胶、PVDF膜、滤纸和海绵垫。转膜夹放入转膜槽中(转膜槽置冰水中)，恒流300mA转膜1.5h。

7)封闭：用BSA封闭液将PVDF膜放置在封闭袋中，放在摇床上匀速摇荡1h。

8)孵育一抗：去除封闭液，PBS清洗5次5min，然后将PVDF膜转移到杂交袋中同时加入已经稀释好的一抗，封口后放到4℃的冰箱过夜。

9)洗一抗：第二天将杂交袋中的一抗回收，取出PVDF膜，放在干净的盛有PBS-T的培养皿中，放置在摇床上，洗膜5次，每次5min。

10)孵育二抗：将洗过的膜再次放入杂交袋中，加入相应的稀释好的二抗，封口后放置在摇床上匀速孵育1h，注意室温不宜过高。

11)洗二抗：用PBST洗5次，每次5分钟。

12)扫膜：将上述处理好的条带放在Odyssey双色红外激光成像仪中，调节曝光时间，成功后可以看到深浅不同的条带。

13)扫描并分析结果：采用图像分析软件进行吸光度分析，以所测得的各指标的吸光度与内参Tubulin吸光度的比值代表定量值。

3、实验结果：

细胞的凋亡与一系列的凋亡相关蛋白表达有关，如Bcl-2家族、Caspase 3、PARP等。PARP在体内是Caspase 3的主要剪切对象，即被剪切的Cleaved PARP。结果如图6所示，图6是采用Western blot检测PC12细胞凋亡蛋白的相对表达水平的示意图，图6A表示Western blot条带图，图6B表示Bcl-2相较于Tubulin的灰度扫描图，图6C表示CleavedPARP相较于Tubulin的灰度扫描图。

图6A中，Glu为谷氨酸组，Bcl-2为抗凋亡蛋白，Cleaved PARP为被剪切的死亡底物，014为药物组；图6B和6C中，Ctrl为空白组，从图6A与图6B可以看出谷氨酸损伤后的PC12细胞模型组(Glu)相较于空白对照组，抗凋亡蛋白Bcl-2表达显著降低，加入化合物014后Bcl-2的表达量随014浓度升高而升高，具有剂量依赖性，从图6A与图6C中可以看出模型组(Glu)相较于空白对照组死亡底物Cleaved PARP蛋白表达显著升高，药物组可剂量依赖地降低Cleaved PARP的表达。综上所述，从图6中可以看出，相比于空白组，谷氨酸组细胞Bcl-2蛋白水平显著降低，Cleaved PARP蛋白水平显著升高；红波罗花碱A(Delavatine A)给药组可通过升高Bcl-2、降低Cleaved PARP蛋白水平来保护PC12细胞免受谷氨酸的兴奋性毒性导致的细胞凋亡。

实施例7

红波罗花碱A(Delavatine A)对脑缺血再灌注大鼠的保护作用

1、仪器与试剂：鱼线(长度为40mm，直径为0.26mm)，手术器材(持针器、弯剪、直剪、眼科镊、缝合针、干棉球、酒精棉球、10％水合氯醛、注射器、碘伏、棉签、记号笔)，自制拉钩(皮筋+曲别针+大头针)。

2、实验方法：

1)实验分组和给药方案：雄性SD大鼠，体重250-300g，随机分为假手术组(Sham)、模型组(MCAO)、药物组(5mg/kg组、10mg/kg组)，每组6只，术前灌胃给药三天。

2)大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型的制备：局灶性脑缺血再灌注模型(middlecerebral artery occlusion/reperfusion，MCAO/R)的制备根据longa提出的可逆性大脑中动脉闭塞(MCAO)线栓法，并根据大鼠脑解剖结构图加以改进制作局灶性脑缺血再灌注模型。SD大鼠称重，10％水合氯醛(350mg/kg)腹腔麻醉，颈部正中切开，分离右侧颈总动脉(common carotid artery，CCA)、颈内动脉(internal carotid artery，ICA)、颈外动脉(external carotid artery，ECA)。结扎CCA近心端、ECA起始端后，在CCA处剪“V”形小口，沿CCA插入线栓(长40mm，直径0.26mm，并于20mm长处标记)，经ICA向颅内插至大脑中动脉分叉处，插入深度为18-20mm，将线与ICA一起结扎，最后缝合皮肤，栓线尾端部分固定于皮肤上。在缺血期间及再灌注后2h保持体温在(37±0.5)℃。再灌注时外拉线使球端回至ECA，拔除插线，结扎ECA即可。假手术组除不插线外，其余步骤同手术组，大脑中动脉栓塞后2h恢复血供。

3)神经功能缺失体征评分：

参考Longa的5分制法进行评分：

0分：无神经功能损伤；

1分：不能完全伸展对侧前肢；

2分：不能伸展对侧前肢；

3分：轻度向对侧转圈；

4分：严重向对侧转圈；

5分：对侧肢体偏瘫；

分值越高，说明动物行为障碍越严重。

4)四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazoliumiides，TTC)法染色：TTC(2,3,5-氯化三苯基四氮唑)是一种脂溶性光敏感的复合物。1894年，首次合成后用来检测种子的生存能力；从1958年开始，可以用来染色后检测哺乳动物组织的缺血性梗塞，是一种呼吸链中吡啶核苷结构酶系统的质子受体，与正常组织中的脱氢酶反应而呈现红色，而缺血的组织内脱氢酶的活性下降，不能进行反应，故不会产生变化而呈现白色。

3、实验结果：

如图7所示，图7是采用红波罗花碱A(Delavatine A)对脑缺血大鼠的保护作用的示意图，图7A表示TTC染色脑组织梗塞体积图，图7B表示数理统计脑组织梗塞体积图，图7C表示大鼠神经行为学评分图。

图7A中，Sham为假手术组，MCAO为模型组，014药物组分为5mg/kg组和10mg/kg组；图7B中，MCAO+014为造模并给药组，从图7A和图7B中可以得出，相较于假手术组(Sham)，模型组(MCAO)大鼠再灌注后脑缺血体积为29.66±2.83％(p<0.001)，5mg/kg和10mg/kg的红波罗花碱A(Delavatine A)均可显著降低MCAO大鼠再灌注后脑缺血体积，脑缺血体积分别减少至21.02±5.46％(p<0.05)和15.58±5.03％(p<0.01)。从图7C中可以看出，5mg/kg和10mg/kg的红波罗花碱A(Delavatine A)均可改善其神经功能缺失体征评分。结果表明，红波罗花碱A(Delavatine A)能有效地保护脑组织免于缺血后坏死，具有良好的神经保护活性。

实施例8

(15R,2S)-红波罗花碱A(Delavatine A)与红波罗花碱A(Delavatine A，014)保护作用效果比较。

1、仪器与试剂：同实施例1

2、实验方法：

(1)PC12细胞体外培养：同实施例1

(2)CCK8法检测细胞活力

将对数生长期细胞稀释成0.8×10⁵Cells/mL，每孔100μl培养基，接种于96孔板，放入37℃、5％CO₂培养箱中培养24h，向细胞内加入红波罗花碱A(Delavatine>

3、实验结果：

如图8所示，图8是014与其光学异构体(15R,2S)-红波罗花碱A(Delavatine A)对谷氨酸损伤细胞的保护作用示意图。用CCK8法检测不同浓度红波罗花碱A(Delavatine A)和(15R,2S)-红波罗花碱A(Delavatine A)溶液对谷氨酸损伤的PC12细胞的保护作用。从图8中可以看出，1.25-5μM浓度梯度范围内的红波罗花碱A(Delavatine A)和(15R,2S)-红波罗花碱A(Delavatine A)对谷氨酸损伤PC12细胞具有相同的保护作用。

本发明提供的一种红波罗花碱A(Delavatine A)及其衍生物在制备预防或治疗中枢神经系统疾病药物中的应用，通过体外培养PC12细胞，表明红波罗花碱A(DelavatineA)可通过增加细胞存活率，降低LDH释放、Ca²⁺内流和ROS生成，抑制Caspase-3活性，调控线粒体依赖的细胞凋亡通路，从而保护PC12细胞免受谷氨酸的兴奋性毒性损伤。同时，采用体内MCAO动物实验，表明红波罗花碱A(Delavatine>

本发明提供的一种红波罗花碱A(Delavatine A)及其衍生物在制备预防或治疗中枢神经系统疾病药物中的应用，红波罗花碱A(Delavatine A)及其衍生物可以改善兴奋性神经毒性、缓解缺血性脑卒中。具体地，本发明提供的红波罗花碱A(Delavatine A)可以保护PC12细胞免受谷氨酸损伤，并有效治疗缺血性脑卒中所致脑损伤。本发明以谷氨酸作为损伤剂作用于PC12细胞，实验结果表明红波罗花碱A(Delavatine A)对谷氨酸所致神经细胞损伤具有一定的修复保护作用；可有效缓解谷氨酸引起的细胞凋亡，维持细胞形态，增强细胞活力，降低细胞内LDH的释放，抑制Ca²⁺内流，降低细胞内Ca²⁺的浓度，同时降低活性氧簇ROS的释放，并显著降低促凋亡蛋白PARP的活化，升高抗凋亡蛋白Bcl家族Bcl-2的表达。同时，红波罗花碱A(Delavatine>

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。