金团簇或含金团簇的物质在制备预防和/或治疗青光眼药物中的应用

摘要

本发明公开了一种金团簇或含金团簇的物质在制备预防和/或治疗青光眼药物中的应用。本发明的含金团簇的物质在抑制Aβ聚集的体外实验表现出优异的抑制Aβ聚集效果，在RGC‑5视神经节细胞损伤模型中对改善细胞存活率表现出明显效果，在大鼠青光眼视神经钳夹损伤模型中可显著提升视神经钳夹损伤模型大鼠的闪光视觉诱发电位的N2‑P2振幅，并显著减少视网膜神经节细胞的丢失，对视神经损伤有明显保护作用，并且在动物层面也具有良好的生物相容性。

说明书

技术领域

本发明涉及纳米药物技术领域，特别是涉及金团簇或含金团簇的物质在制备预防和/或治疗青光眼药物中的应用。

背景技术

青光眼是以是视神经损伤、视野缺损及视功能逐渐丧失为特征的一种不可逆性视神经退行性病变。它是仅次于白内障的全世界第二位不可逆性致盲性眼病。据临床分析数据预测，到2020年全球青光眼患者的数量将达7600万，尤其以亚洲和非洲更为突出，而我国到2020年将有2100万青光眼患者。青光眼的发病机制迄今尚未阐明。长期以来，病理性眼内压升高被认为是引起神经损伤以及青光眼的主要因素之一，临床上治疗青光眼的方法也主要是基于降低患者眼压。然而众多的临床数据显示仅靠控制眼压并不能达到治疗青光眼的目的。因为即使眼压控制的很理想，视神经进行性损伤及视网膜神经节细胞(Retinalganglion cells，RGCs)凋亡仍继续加重。因此高眼压可能只是青光眼视神经损伤的早期诱发因素，而仅靠降低眼压难以阻止视神经功能的进一步丧失。鉴于以上原因，增强视神经功能、阻断或减缓视神经细胞凋亡和视神经损伤是治疗青光眼的关键。然而，目前尚无临床药物能有效阻止青光眼相关的视神经损伤。研究发现，多种因素，如氧化应激、机械压力、自身免疫系统异常、血糖水平、炎症因子以及异常蛋白沉淀等均可以导致视神经损伤。其中越来越引起关注的是，β淀粉样蛋白(amyloid-β，Aβ)及Tau蛋白的错误折叠以及在细胞内外的异常聚集及纤维化在视神经退行性病变及RGCs死亡过程中起着至关重要的作用。

Aβ是由淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein，APP)经β-分泌酶和γ-分泌酶水解产生的含39-43个氨基酸残基的蛋白质，是参与神经损伤和神经细胞凋亡的重要因子。研究认为Aβ的神经毒性是多种神经退行性疾病，如阿尔兹海默症(Alzheimer’sdisease，AD)等，形成和发病的共同机制，并且也长期作为相关药物研发的重要靶点。近年研究表明，Aβ神经毒性在眼科领域神经退行性疾病—青光眼中也扮演了至关重要的角色。临床青光眼患者RGCs及房水中Aβ表达明显高于对照组。而在青光眼动物模型中，长期高眼压导致的RGCs细胞凋亡与Amyloid前体蛋白(APP)、Aβ表达升高及Tau蛋白过度磷酸化密切相关。同时，临床数据显示AD患者更易患青光眼以及视力丧失。并且AD转基因动物的视网膜中合成了大量APP并出现Aβ斑块聚集。因此，青光眼与AD可能有类似的Aβ机制。更重要的是，在青光眼动物模型中，处于凋亡期的RGCs细胞与Aβ共表达，采用Aβ抗体或药物阻断Aβ的过度产生，可有效抑制RGCs细胞凋亡和改善视神经损伤。这些研究成果均显示Aβ在青光眼发病过程中扮演重要角色，是基于视神经保护机制治疗青光眼的重要靶点。

大鼠视神经钳夹损伤模型是一个广泛应用的非高眼压青光眼动物模型。它保持了视神经外模完整，模拟青光眼视神经轴浆运输中断和RGCs死亡，接近临床青光眼损伤特征。同时，该模型制作方式规范，操作简单，可造成明确、定量的视神经损伤，并且误差小、重复性好，是国内外公认的较精确的青光眼视神经损伤模型，在研究青光眼视神经损伤及RGCs损害病理机制以及视神经保护药物的筛选中应用广泛。例如，通过该模型已经发现人生皂苷Rg1、地塞米松、银杏、α-硫辛酸具有一定的是神经保护作用，但保护效果未尽如人意。由于Aβ机制在视神经损伤过程中发挥重要作用，因此开发一种能抑制Aβ聚集与纤维化，同时在动物模型中能保护视神经并改善视觉功能的药物，将对青光眼的预防与治疗有重大意义。

金纳米粒子是尺寸为纳米级(金核直径通常为3-100nm)的金颗粒，因其具有独特的光学和电学性质，良好的生物相容性，并易于表面修饰，广泛应用于生物传感器、医学成像和肿瘤检测等生物及医学相关领域。由于其化学惰性和巨大的比表面，以及具有低浓度下穿透血脑屏障的能力，金纳米粒子也作为药物载体用于药物定向输运、药物可控释放等方面的研究。近年来，有研究将金纳米粒子与对纤维化蛋白的聚集有抑制作用的特定配体(如杂多酸、特定序列的多肽等)结合，在抑制蛋白纤维化变性的体外实验中取得一定效果(Y.H.Liao,Y.J.Chang,Y.Yoshiike,Y.C.Chang,Y.R.Chen,Small 2012,8,3631.；Y.D.Alvarez,J.A.Fauerbach,J.V.Pellegrotti,T.M.Jovin,E.A.Jares-Erijman,F.D.Stefani,Nano Letters 2013,13,6156；S.Hsieh,C.W.Chang,H.H.Chou,Colloids andSurfaces B:Biointerfaces,2013,112,525)，但细胞模型的结果表明，金纳米粒子的使用对纤维化蛋白损伤细胞的存活率并无明显作用(N.Gao,H.Sun,K.Dong,J.Ren,X.Qu,Chemistry-A European Journal 2015,21,829)，动物模型层面的实验则未见报道。并且，在这些研究中，金纳米粒子主要作为药物载体使用，而不是起效成分。

金团簇是一种超微金纳米粒子，金核直径小于3nm。其中仅含有数个至数百个金原子，导致金纳米粒子中所具有的金原子的面心立方堆积结构坍塌，能级发生分裂，从而表现出与3nm以上的常规金纳米粒子完全不同的类分子的性质：一方面，由于能级分裂，金团簇不具备常规金纳米粒子所具有的表面等离子体效应及衍生的光学性质，却表现出与半导体量子点相似的优异荧光发射性质；另一方面，金团簇的紫外可见吸收光谱中在520±20nm处的等离子体共振峰消失，而在570nm以上出现一个或多个新的吸收峰，而这类吸收峰在常规金纳米粒子中观察不到，因此紫外可见吸收光谱中等离子体共振吸收峰(520±20nm)的消失和570nm以上新吸收峰的出现是判断金团簇是否制备成功的重要标志(H.F.Qian,M.Z.Zhu,Z.K.Wu,R.C.Jin,Accounts of Chemical Research 2012,45,1470)。金团簇还具有与常规金纳米粒子明显不同的磁学、电学和催化性质，因而在单分子光电、分子催化等领域具有广阔的应用前景。此外，金团簇由于优异的荧光发射性质在生物探针及医学成像领域也已获得应用。例如，Sandeep Verma课题组将嘌呤修饰的金团簇作为绿色荧光探针用于细胞核成像(V.Venkatesh,A.Shukla,S.Sivakumar,S.Verma,ACS Applied Materials&Interfaces 2014,6,2185)，该类文献利用的是金团簇的荧光发射特性，而未涉及其本身的药用活性。

发明内容

本发明目的在于提出金团簇的一种医药用途，具体提供其在制备预防及治疗青光眼的药物中的新应用。为此，

第一方面，提供一种含金团簇的物质在制备预防和/或治疗青光眼药物中的应用。

所述含金团簇的物质包括金团簇及其外部包覆的配体Y。

所述含金团簇的物质为溶液、粉末或絮状物。

所述金团簇的金核直径小于3nm，优选0.5-2.6nm或1.1-2.6nm。

所述配体Y包括但不局限于L(D)-半胱氨酸及其衍生物、含半胱氨酸的寡肽及其衍生物、其它含巯基的化合物中的一种或几种。

所述L(D)-半胱氨酸及其衍生物选自L(D)-半胱氨酸、N-异丁酰基-L(D)-半胱氨酸(L(D)-NIBC)或N-乙酰基-L(D)-半胱氨酸(L(D)-NAC)。

所述含半胱氨酸的寡肽及其衍生物选自L-精氨酸-L-半胱氨酸(RC)、L-半胱氨酸-L-精氨酸(CR)、L-半胱氨酸-L-组氨酸二肽(CH)、L-组氨酸-L-半胱氨酸二肽(HC)、L-谷胱甘肽(GSH)、L-赖氨酸-L-半胱氨酸-L-脯氨酸三肽(KCP)、L-脯氨酸-L-半胱氨酸-L-精氨酸三肽(PCR)、甘氨酸-L-半胱氨酸-L-精氨酸三肽(GCR)、甘氨酸-L-丝氨酸-L-半胱氨酸-L-精氨酸四肽(GSCR)或甘氨酸-L-半胱氨酸-L-丝氨酸-L-精氨酸四肽(GCSR)。

所述其它含巯基的化合物选自1-[(2S)-2-甲基-3-巯基-1-氧代丙基]-L-脯氨酸(Cap)、巯基乙酸、巯基乙醇、苯硫酚、D-3-巯基缬氨酸、N-(2-巯基丙酰基)-甘氨酸或十二硫醇等。

制备所述含金团簇的物质的方法，包括以下步骤：

(1)把HAuCl₄溶于甲醇、水、乙醇、正丙醇、乙酸乙酯中的一种配成HAuCl₄浓度为0.01～0.03M的溶液A；

(2)把配体Y溶于溶剂中配成浓度为0.01～0.18M的溶液B；

(3)将步骤(1)的溶液A和步骤(2)的溶液B混合，HAuCl₄和配体Y的摩尔比为1:0.01～1:100(优选1：(0.1-10)，更优选1：(1-10))，在冰浴下搅拌反应0.1～12h(优选0.1-2h，更优选0.5-2h)，滴加0.025～0.8M的NaBH₄溶液(优选NaBH₄水溶液、NaBH₄乙醇溶液、NaBH₄甲醇溶液)后，在冰水浴中继续搅拌反应0.1～12h(优选0.1-2h，更优选1-2h)，NaBH₄与配体Y的摩尔比为1:0.01～1:100(优选1：(0.1-8)，更优选1：(1-8))，得到溶液状的含金团簇的物质。

步骤(2)中的所述溶剂为甲醇、乙酸乙酯、水、乙醇、正丙醇、戊烷、甲酸、乙酸、乙醚、丙酮、苯甲醚、1－丙醇、2－丙醇、1－丁醇、2－丁醇、戊醇、乙醇、乙酸丁酯、三丁甲基乙醚、乙酸异丙酯、二甲亚砜、乙酸乙酯、甲酸乙酯、乙酸异丁酯、乙酸甲酯、2－甲基－1－丙醇、乙酸丙酯中的一种或多种。

第二方面，本发明提供了金团簇在制备预防和/或治疗青光眼药物中的应用，所述金团簇金核直径小于3nm；所述金团簇可经不同配体修饰，配体可为对青光眼有效或无效的成分。

第三方面，本发明提供了由L-NIBC、D-NIBC、CR、RC、N-乙酰基-L-半胱氨酸(L-NAC)、N-乙酰基-D-半胱氨酸(D-NAC)、GSH、1-[(2S)-2-甲基-3-巯基-1-氧代丙基]-L-脯氨酸(Cap)、L-半胱氨酸或D-半胱氨酸配体修饰的金团簇(金核直径小于3nm，优选0.5-2.6nm)在制备预防和/或治疗青光眼药物中的应用。

本发明提出的金团簇或含金团簇的物质(指配体修饰的金团簇)可以使用口服、注射(肌肉注射或静脉注射)或局部点眼方式给药，给药量及给药频率可根据细胞模型实验、动物模型实验及药物体内分布及代谢实验结果计算获得。

功效方面，本发明的金团簇或含金团簇的物质在抑制Aβ聚集的体外实验中表现出优异的抑制Aβ聚集效果，在RGC-5视神经节细胞损伤模型中对改善细胞存活率表现出明显效果，在大鼠青光眼视神经钳夹损伤模型中可显著提升视神经钳夹损伤模型大鼠的闪光视觉诱发电位的N2-P2振幅，并显著减少视网膜神经节细胞的丢失，对视神经损伤有明显保护作用，可缩小视野缺损，降低RGCs细胞凋亡，对改善视网膜和视神经组织结构以及缓解视功能障碍有显著作用，并且在动物层面也具有良好的生物相容性。因此，对预防与治疗青光眼的新药研发有重要意义。

同时，本发明还证明配体分子本身在体外抑制Aβ聚集的动力学实验、RGC-5细胞损伤的青光眼细胞模型中均未表现出明显作用，这表明对青光眼的药效来自于金团簇本身，而不是配体。金团簇本身新的医药用途是本发明的重要贡献。基于金团簇本身对青光眼的药用活性再进一步组配已知有活性(包括但不限于对青光眼的活性)的物质或其它没有活性的物质如载体、助溶剂等，将形成更具竞争力的新药。

附图说明

图1为不同粒径的配体L-NIBC修饰的金纳米粒子的紫外可见光光谱、透射电镜照片和粒径分布图；

图2为不同粒径的配体L-NIBC修饰的金团簇的紫外可见光光谱、透射电镜照片和粒径分布图；

图3为不同粒径的配体L-NIBC修饰的金团簇的红外光谱图；

图4为平均直径为1.8nm的L-NIBC修饰的金团簇的激发光谱图和近红外荧光发射光谱图；

图5为Aβ(1-40)与均为配体L-NIBC修饰的金纳米粒子或金团簇共同孵育48h后的AFM形貌图；

图6为不同粒径、不同浓度的均为配体L-NIBC修饰的金纳米粒子和金团簇的Aβ纤维化动力学曲线图；

图7为配体CR修饰的金团簇(CR-AuNCs)的紫外、红外、透射电镜和粒径分布图；

图8为配体RC修饰的金团簇(RC-AuNCs)的紫外、红外、透射电镜和粒径分布图；

图9为配体1-[(2S)-2-甲基-3-巯基-1-氧代丙基]-L-脯氨酸(即Cap)修饰的金团簇(Cap-AuNCs)的紫外、红外、透射电镜和粒径分布图；

图10为配体GSH修饰的金团簇(GSH-AuNCs)的紫外、红外、透射电镜和粒径分布图；

图11为配体D-NIBC修饰的金团簇(D-NIBC-AuNCs)的紫外、红外、透射电镜和粒径分布图；

图12为不同配体修饰金团簇对Aβ(1-40)聚集及纤维化的抑制效果图；

图13为配体L-NIBC修饰的金团簇或金纳米粒子对H₂O₂诱导的氧化应激青光眼RGC-5细胞模型细胞存活率影响图；

图14为配体L-NIBC修饰的金团簇或金纳米粒子对硝普钠诱导的细胞凋亡青光眼RGC-5细胞模型细胞存活率影响图；

图15为含金团簇的物质对青光眼模型大鼠模型眼睛fVEP N2潜伏期的影响图；

图16为含金团簇的物质对青光眼模型大鼠眼睛fVEP P2潜伏期的影响图；

图17为含金团簇的物质对青光眼模型大鼠眼睛fVEP N2-P2振幅的影响；

图18为连续14天含金团簇的物质给药后，动物视网膜铺片Brn3a染色图例及染色阳性细胞个数统计分析图；

图19为连续14天含金团簇的物质给药后，动物视网膜病理切片HE染色图例及RGCs个数统计分析图；

图20为不同粒径、不同浓度的L-NIBC修饰的金团簇对SH-sy5y神经母瘤细胞存活率的影响图。

具体实施方式

发明人在研究具有某些配体的金纳米粒子对Aβ聚集的作用时发现：当金纳米粒子(金核直径3nm-100nm)金核直径从大变小时，表面相同配体修饰的金纳米粒子对Aβ的聚集从促进作用转变为抑制作用，当其粒径足够小转变为金团簇(金核直径小于3nm)时，可实现Aβ的聚集的完全抑制，而这一效应中起抑制作用的并不是配体，而是金团簇本身。

通常，研究中所用的金纳米粒子金核直径在3nm以上，而当金核直径小于3nm时被称为金团簇，紫外可见吸收光谱中等离子体共振吸收峰(520±20nm)的消失和560nm或570nm以上新吸收峰的出现是判断金团簇是否制备成功的标志。金团簇不能脱离配体单独在溶液中稳定存在，其与含巯基的配体通过Au-S键结合，形成配体修饰的金团簇(或简称金团簇)。

已有文献公开的配体修饰的金团簇有L-谷胱甘肽(GSH)、N-乙酰基-L(D)-半胱氨酸(L(D)-NAC)、N-异丁酰基-L(D)-半胱氨酸(L(D)-NIBC)等修饰的金团簇等，其制备过程见文献(H.F.Qian,M.Z.Zhu,Z.K.Wu,R.C.Jin,Accounts of Chemical Research 2012,45,1470；C.Gautier,T.Bürgi,Journal of the American Chemical Society 2006,128,11079)；其应用集中于催化、手性识别、分子检测、生物传感、药物运输、生物成像等领域(G.Li,R.C.Jin,Accounts of Chemical Research 2013,46,1749；H.F.Qian,M.Z.Zhu,Z.K.Wu,R.C.Jin,Accounts of Chemical Research 2012,45,1470；J.F.Parker,C.A.Fields-Zinna,R.W.Murray,Accounts of Chemical Research 2010,43,1289；S.H.Yau,O.Varnavski,T.GoodsonШ,Accounts of Chemical Research 2013,46,1506)。

本发明围绕金团簇对Aβ聚集的抑制影响进行研究，至少包括：首先以具有不同配体(对Aβ的聚集没有抑制作用的配体)不同尺寸的金团簇为对象，通过抑制Aβ聚集的体外实验、RGC-5视神经节细胞损伤模型实验、大鼠青光眼视神经钳夹损伤模型实验三个层面的研究，并结合金团簇的细胞毒性、小鼠急性毒性实验、小鼠体内分布及药代动力学实验等，提供了配体修饰的金团簇，发现其在制备预防与治疗青光眼的药物中的应用，并与金纳米粒子的实验结果对比，阐明直径大于3nm的金纳米粒子在这一用途中效果不佳，不能用于制备预防或治疗青光眼的药物，而配体修饰的金团簇可以用作制备治疗青光眼的药物。

以下结合具体实施例，更具体地说明本发明的内容，并对本发明作进一步阐述，但这些实施例绝非对本发明进行限制。

下列实施例中所用原料的纯度只要达到化学纯以上即可，来源均可从市场购得。

实施例1：制备配体修饰的金团簇

本实施例介绍制备配体修饰的金团簇(配体修饰的金团簇在本发明中也被称为含金团簇的物质)的方法，包括以下步骤：

(1)把HAuCl₄溶于甲醇、水、乙醇、正丙醇、乙酸乙酯中的一种配成溶液A，其中HAuCl₄的浓度为：0.01～0.03M；

(2)把配体Y溶于溶剂中配成溶液B，其中，配体Y的浓度为：0.01～0.18M；配体Y包括但不局限于L(D)-半胱氨酸及其他半胱氨酸衍生物，如N-异丁酰基-L-半胱氨酸(L-NIBC)、N-异丁酰基-D-半胱氨酸(D-NIBC)、N-乙酰基-L-半胱氨酸、N-乙酰基-D-半胱氨酸等；含半胱氨酸的寡肽及其衍生物,包括但不局限于含半胱氨酸的二肽、三肽、四肽及其它肽，如：L-半胱氨酸-L-精氨酸二肽(CR)、L-精氨酸-L-半胱氨酸二肽(RC)、L-半胱氨酸-L-组氨酸(CH)、L-组氨酸-L-半胱氨酸(HC)、L-赖氨酸-L-半胱氨酸-L-脯氨酸三肽(KCP)、甘氨酸-L-半胱氨酸-L-精氨酸三肽(GCR)、L-脯氨酸-L-半胱氨酸-L-精氨酸三肽(PCR)、L-谷胱甘肽(L-GSH)、甘氨酸-L-丝氨酸-L-半胱氨酸-L-精氨酸四肽(GSCR)、甘氨酸-L-半胱氨酸-L-丝氨酸-L-精氨酸四肽(GCSR)等；及其他含巯基的化合物，如1-[(2S)-2-甲基-3-巯基-1-氧代丙基]-L-脯氨酸(Cap)、巯基乙酸、巯基乙醇、苯硫酚、D-3-巯基缬氨酸、N-(2-巯基丙酰基)-甘氨酸、十二硫醇等中的一种或多种；溶剂为甲醇、乙酸乙酯、水、乙醇、正丙醇、戊烷、甲酸、乙酸、乙醚、丙酮、苯甲醚、1－丙醇、2－丙醇、1－丁醇、2－丁醇、戊醇、乙醇、乙酸丁酯、三丁甲基乙醚、乙酸异丙酯、二甲亚砜、乙酸乙酯、甲酸乙酯、乙酸异丁酯、乙酸甲酯、2－甲基－1－丙醇、乙酸丙酯中的一种或多种；

(3)将溶液A和溶液B混合，使得HAuCl₄和配体Y的摩尔比为1:(0.1-10)，在冰浴下搅拌反应0.1-24h，滴加0.025～0.8M的NaBH₄的水、乙醇或甲醇溶液，在冰水浴中继续搅拌反应0.1-2h，NaBH₄与配体Y的摩尔比为1：(0.1-8)，得到溶液状的含金团簇的物质；

为了获得尺寸不同的金团簇,测量粒径以及方便使用，可进一步进行以下步骤：

(4)反应结束后将反应液以8000～17500r/min范围内选择不同转速进行梯度离心10～100min，不同转速得到的沉淀为不同平均粒径的配体修饰的金团簇；

(5)将步骤(4)得到的不同平均粒径的沉淀与水混合并装入透析袋中在室温下置于水中透析1～7天；

(6)透析后，冷冻干燥12～24h，得到的粉末状或絮状物质即为配体修饰的金团簇。

对得到的粉末或絮状物质进行检测(具体检测方法参见实施例2)，发现不同转速下离心得到的沉淀粒径均小于3nm(一般分布在0.5-2.6nm)，其紫外-可见吸收光谱在570nm以上出现一个或者多个吸收峰，在520nm没有明显吸收峰，确定获得的粉末或絮状物为金团簇。

对得到的粉末或絮状物质进行检测(具体检测方法参见实施例2)，发现其粒径均小于3nm(一般分布在0.5-2.6nm)，其紫外-可见吸收光谱在570nm以上出现一个或者多个吸收峰，在520nm没有明显吸收峰，确定获得的粉末或絮状物为金团簇。

实施例2：制备配体为N-异丁酰基-L-半胱氨酸L-NIBC的金团簇

本实施例以配体L-NIBC为例，详述不同粒径配体L-NIBC修饰的金团簇的制备与确认。

(1)称取1.00g的HAuCl₄溶于100mL甲醇配成浓度为0.03M的溶液A；

(2)称取0.57g的L-NIBC，溶于100mL冰醋酸(乙酸)配成浓度为0.03M的溶液B；

(3)取1mL溶液A分别与0.5mL、1mL、2mL、3mL、4mL、5mL的溶液B混合(即HAuCl₄与L-NIBC摩尔比分别为1:0.5、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5)，冰浴搅拌下反应2h，溶液颜色由亮黄色变为无色，迅速加入新配制的0.03M(称取11.3mg>4溶于10mL乙醇配制得到)的NaBH₄乙醇溶液1mL，溶液颜色变为深褐色后持续反应30min，加入10mL丙酮终止反应。

(4)反应结束后将反应液采用差速离心法(即梯度离心法)得到不同粒径的L-NIBC修饰的金团簇粉末，本步骤可结合使用超滤管，具体方法：步骤(3)反应结束后将反应液转移至截留分子量为100000的容积为50mL的超滤管中，用10000r/min的转速离心20min，取管内的截留物沉淀即得到L-NIBC修饰的金团簇粉末，粒径为2.6nm左右(2.6nm为将该截留物沉淀重悬于超纯水中测量得到)，然后将管外的溶液转移至截留分子量为50000的容积为50mL的超滤管中，用13000r/min的转速离心30min，取管内的截留物沉淀即得到L-NIBC修饰的金团簇粉末，粒径为1.8nm左右的(1.8nm为将该截留物沉淀重悬于超纯水中测量得到)，然后继续将管外的溶液转移至截留分子量为30000的容积为50mL的超滤管中，用17500r/min的转速离心40min，取管内的截留物沉淀即得到L-NIBC修饰的金团簇粉末，粒径为1.1nm左右(1.1nm为将该截留物沉淀溶解于重悬于超纯水中测量得到)。

(5)将通过梯度离心法得到的三个不同沉淀粒径的粉末分别除去溶剂得到粗品，将粗品用N₂吹干后重悬于5mL超纯水，装入透析袋(截留分子量为7000Da，置于2L超纯水中，隔天换水，透析7天，冷冻干燥后得到粉末备用。

对以上制备得到的粉末(配体为L-NIBC的金团簇)进行表征实验，同时以配体同为L-NIBC的金纳米粒子作为对照。配体为L-NIBC的金纳米粒子的制备方法参照文献(W.Yan,L.Xu,C.Xu,W.Ma,H.Kuang,L.Wang and N.A.Kotov,Journal of the American ChemicalSociety 2012,134,15114；X.Yuan,B.Zhang,Z.Luo,Q.Yao,D.T.Leong,N.Yan and J.Xie,Angewandte Chemie International Edition2014,53,4623)中的介绍。

1、透射电子显微镜观察形貌

把待测粉末(实施例2中制得的L-NIBC修饰的金团簇样品和配体同为L-NIBC的金纳米粒子样品)加入超纯水中，得到浓度为2mg/L的样品，然后采用悬滴法制样，具体方法为：取5μL样品滴到超薄碳膜网上，自然挥发直至水滴消失，然后在JEM-2100F STEM/EDS型场发射高分辨透射电子显微镜上观察金团簇的形貌。

四个配体为L-NIBC的金纳米粒子样品的透射电子显微镜形貌照片见图1中的B幅、E幅、H幅、K幅；三个配体为L-NIBC的金团簇样品的透射电子显微镜形貌照片见图2中的B幅、E幅、H幅。

图2的照片表明L-NIBC修饰的金团簇样品粒径均匀，分散性好，L-NIBC修饰的金团簇的平均直径(指金核直径)分别为1.1nm、1.8nm和2.6nm，与图2中C幅、F幅、I幅粒径分布结果相吻合。而相比较的配体为L-NIBC的金纳米粒子样品粒径较大，其平均直径(指金核直径)分别为3.6nm、6.0nm、10.1nm、18.2nm，与图1中C幅、F幅、I幅、L幅粒径分布结果相吻合。

2、紫外-可见吸收光谱

把待测粉末用超纯水溶解到浓度为10mg·L^-1，在室温下测定其紫外可见吸收光谱。扫描范围为190-1100nm，样品池为光程为1cm的标准石英比色皿，参比池盛放超纯水。

结果四个配体为L-NIBC的金纳米粒子样品的紫外-可见吸收光谱见图1中的A幅、D幅、G幅、J幅，粒径的统计分布对应见图1中的C幅、F幅、I幅、L幅；三个配体为L-NIBC的金团簇样品的紫外-可见吸收光谱见图2中的A幅、D幅、G幅，粒径的统计分布对应见图2中的C幅、F幅、I幅。

由图1可以看出，由于表面等离子体效应，配体为L-NIBC的金纳米粒子在520nm左右出现吸收峰，吸收峰的位置与粒径大小相关，其中3.6nm的紫外吸收峰在516nm处，6.0nm的紫外吸收峰在517nm处，10.1nm的紫外吸收峰在520nm处，而18.2nm的吸收峰则红移到523nm处，四个样品在560nm或570nm以上均无任何吸收峰。

图2中可以看到，实施例2三个不同粒径的配体为L-NIBC的金团簇样品的紫外吸收光谱中520nm附近的表面等离子体效应吸收峰消失，而在570nm以上出现两个明显的吸收峰，吸收峰的位置随金团簇的粒径不同而略有不同。这是因为金团簇由于面心立方结构的坍塌，表现出类分子的性质，导致金团簇的态密度不再连续，产生能级分裂，等离子体共振效应消失，同时在长波方向出现新的吸收峰。由此可以判断实施例2得到的三个不同粒径的粉末样品均为配体修饰的金团簇。

3、傅里叶变换红外光谱

红外光谱在布鲁克公司生产的VERTEX80V型傅里叶变换红外光谱仪上采用固体粉末高真空全反射模式测定，扫描范围为4000-400cm^-1，扫描64次。以实施例2中制得的L-NIBC修饰的金团簇样品为例，测试样品为L-NIBC修饰的三个不同粒径的金团簇的干燥粉末，对照样品为纯L-NIBC粉末。结果见图3。

图3为L-NIBC修饰的不同粒径的金团簇的红外光谱，对比纯的L-NIBC(最上面的曲线),L-NIBC修饰的不同粒径的金团簇在2500-2600cm^-1之间的S-H伸缩振动均完全消失,而其他L-NIBC的特征峰仍可观察到，证明L-NIBC分子成功的通过金硫键锚定到金团簇表面。该图还表明配体修饰的金团簇的红外光谱与其尺寸无关。

4、近红外荧光光谱

近红外荧光光谱在Horiba JobinYvon公司生产的NanoLog紫外-可见-近红外荧光光谱仪上测定，所用样品池为光程为1cm的标准石英比色皿。激发波长为415nm，狭缝宽度为10nm；检测的发射波长的范围为700-1500nm，狭缝宽度为10nm。以实施例2中制得的L-NIBC修饰的金团簇样品为例，结果见图4。

图4是以L-NIBC修饰的平均直径1.8nm的金团簇的激发光谱和近红外荧光发射光谱，发现由于能级分裂，金团簇也表现出与半导体量子点相似的荧光发射性质。其他尺寸和配体的金团簇也都具有这一性质，但激发光谱和发射光谱的峰位置随着金团簇的配体及尺寸的不同而略有差别。具有同样配体的金纳米粒子在全波段均无荧光发射特性。

用上述类似的方法制备其它配体Y修饰的金团簇，只是溶液B的溶剂、HAuCl₄与配体Y的投料比、反应时间和NaBH₄加入量稍作调整，如：L-半胱氨酸、D-半胱氨酸、N-异丁酰基-L-半胱氨酸(L-NIBC)、N-异丁酰基-D-半胱氨酸(D-NIBC)做配体Y时，选择乙酸作为溶剂；二肽CR、二肽RC、1-[(2S)-2-甲基-3-巯基-1-氧代丙基]-L-脯氨酸做配体Y时，选用水作为溶剂，等等；其余步骤类似，不再一一赘述。

本发明按上述方法制备得到一系列配体修饰的金团簇，所用的配体及制备过程的参数见表1。

表1不同配体修饰金团簇的制备参数

采用上述相同的方法确认表1所列各实施例样品，图7-图11分别是配体CR、RC、1-[(2S)-2-甲基-3-巯基-1-氧代丙基]-L-脯氨酸(缩写：Cap)、GSH和D-NIBC修饰的金团簇相应的紫外光谱(图7-图11中的A幅)、红外谱图(图7-图11中的B幅)、透射电镜照片(图7-图11中的C幅)和粒径分布(图7-图11中的D幅)。

结果表明：表1得到的不同配体修饰的金团簇直径均在3nm以下，紫外光谱也表现为520±20nm处的峰消失，大于560nm(560nm或570nm)以上范围出现吸收峰，只是该吸收峰的位置随配体及粒径的不同而略有变化。同时，傅里叶变换红外光谱也显示配体的巯基红外吸收峰(位于图7-图11中B幅的虚线之间)消失，而其他红外特征峰均保留，说明各配体分子均成功锚定到金团簇表面，表明本发明成功获得了表1所列配体修饰的金团簇。

实施例3：体外Aβ聚集动力学实验

如前所述，Aβ在青光眼发病过程中扮演重要角色，是基于视神经保护机制治疗青光眼的重要靶点。本实施例通过体外Aβ聚集动力学实验来验证金团簇(有配体修饰)的功能，并将其与相同配体修饰的金纳米粒子及单独使用配体分子时对Aβ聚集动力学的影响比较，证明金团簇对Aβ聚集具有完全抑制作用而金纳米粒子不具有该功能，且其功能来自于金团簇，而不是来自于配体。实验采用ThT荧光标记法表征Aβ(1-40)纤维化聚集动力学。

硫磺素T(thioflavin T,简写：ThT)是一种专门染淀粉样纤维的染料。当其与多肽或蛋白单体共同孵育时，其荧光基本不发生变化，而当其碰到具有纤维结构的淀粉样多肽或蛋白时，会立即与淀粉样多肽或蛋白发生耦合，其荧光强度会呈指数级迅速增强。正是因为这个特性，ThT被广范用于监测多肽或者蛋白淀粉样变性的标记物。Aβ(1-40)的纤维化过程也是一种成核控制的聚合过程，因此，通过ThT荧光标记法测得的Aβ(1-40)纤维的生长曲线主要分为三个阶段：起始期、增长期和平台期。起始期主要是Aβ(1-40)发生构象转变形成错误折叠进而聚集成核的阶段；增长期是Aβ(1-40)单体沿纤维轴向方向累加到核或者寡聚体上形成纤维并快速增长的阶段；平台期是Aβ(1-40)分子全部形成了成熟的长纤维，即纤维不再生长的阶段。ThT荧光标记法可以方便的监测Aβ(1-40)分子的纤维化聚集的动力学过程。

1)Aβ(1-40)单体的前处理

将冻干的淀粉样多肽Aβ(1-40)粉末(Invitrogen Corp.)溶于六氟异丙醇(HFIP)中得到浓度为1g/L的Aβ(1-40)溶液，封口后在室温下孵育2-4小时，然后在通风橱中用高纯氮气(N₂，99.9％)以适当的气流速度将六氟异丙醇吹干(大约耗时1小时左右)，最后将吹干后的Aβ(1-40)溶于200μL二甲亚砜(DMSO)中，密封后置于-20℃冰箱中保存备用，保存时间不得超过一周。使用前将淀粉样多肽的DMSO溶液用大量的磷酸盐缓冲液(PBS，10mM，pH＝7.4)稀释至Aβ(1-40)浓度为20μM，得到Aβ(1-40)的PBS缓冲溶液。所有实验用的Aβ(1-40)溶液均为新鲜配置，现配现用。

2)样品的制备和检测

将配体修饰的金团簇和金纳米粒子分别加入到20μM的Aβ(1-40)的PBS缓冲溶液中，形成不同浓度、不同粒径的不同配体修饰的金团簇样品和相应的不同配体修饰的金纳米粒子样品。采用ThT荧光标记法，在96孔板中37℃下连续孵育，用酶标仪每隔10分钟监测一次荧光强度。通过ThT的荧光强度变化来表征Aβ(1-40)聚集的动力学过程。

实验组采用实施例2制备的粒径为2.6nm、1.8nm、1.1nm的三种L-NIBC修饰的金团簇，对照组采用粒径为18.2nm、10.1nm、6.0nm、3.6nm的四种L-NIBC修饰的金纳米粒子，以及未与金团簇或金纳米粒子结合的L-NIBC分子。对每种粒径的金团簇或金纳米粒子，所用的浓度均有6个，分别是：0ppm(不含金团簇、金纳米粒子或L-NIBC，用于对照)、0.1ppm、1.0ppm、5.0ppm、10.0ppm和20.0ppm，L-NIBC单独使用时，所用的浓度有2个，分别是：1.0ppm、10.0ppm。

结果见图5和图6。

图5分别显示Aβ(1-40)与各实验组和对照组共同孵育48h后的AFM形貌图，其中，A幅为仅有Aβ(1-40)单独孵育48h后的AFM形貌图，B幅为Aβ(1-40)与L-NIBC共同孵育48h后的AFM形貌图，C幅和D幅分别为Aβ(1-40)与平均粒径为6.0nm和3.6nm的金纳米粒子(用L-NIBC修饰)共同孵育48h后的AFM形貌图，E幅为Aβ(1-40)与平均粒径为1.8nm的金团簇(用L-NIBC修饰)共同孵育48h后的AFM形貌图。

图6中A幅为不同浓度L-NIBC存在时的Aβ(1-40)纤维化动力学曲线，B幅-E幅分别为不同浓度下粒径为18.2nm、10.1nm、6.0nm、3.6nm的金纳米粒子存在时的Aβ(1-40)纤维化动力学曲线，F幅-H幅分别为不同浓度下粒径为2.6nm、1.8nm和1.1nm的金团簇存在时的Aβ(1-40)纤维化动力学曲线。图6中A幅-H幅中□代表0ppm(即无金纳米粒子和金团簇)，○代表0.1ppm，△代表1ppm，▽代表5ppm，◇代表10ppm，☆代表20ppm的金纳米粒子或金团簇与Aβ(1-40)一起孵育时，Aβ的纤维化动力学曲线。

从图5可以看到作为对照的A幅里面布满了Aβ纤维；B幅里也布满了Aβ纤维；C幅中虽然纤维有所减少，但还是能看到较长的纤维，D幅中虽然看不到长纤维，但依然存在大量的Aβ短纤维。这说明，L-NIBC对Aβ(1-40)纤维的形成无明显影响，L-NIBC修饰的小尺寸金纳米粒子的加入虽然可以延缓Aβ(1-40)的纤维化进程，但无法实现完全抑制，因短纤维在更长时间后会继续生长成长纤维。图5的E幅可以看到其中既无长纤维也无短纤维，说明L-NIBC修饰的金团簇能够完全抑制Aβ(1-40)的纤维化进程。

图5为定性实验，图6为定量实验，图6的结果表明，L-NIBC的加入对Aβ(1-40)的纤维化动力学无明显影响(图6的A幅)；对金纳米粒子，当颗粒直径大于或等于10.1nm时，L-NIBC修饰的金纳米粒子的加入使得Aβ聚集动力学的增长期和平台期时间皆提前(当金纳米粒子的浓度为20ppm时，Aβ聚集动力学的增长期提前至12h，平台期时间提前至16h，参见图6的B幅)，说明此时L-NIBC修饰的金纳米粒子能加速Aβ的聚集(图6的B幅和C幅)；而当金纳米粒子颗粒尺寸小于或等于6.0nm(图6的D幅和E幅)时，则能延迟Aβ开始聚集的时间(当L-NIBC修饰金纳米粒子的浓度为20ppm时，Aβ聚集动力学的增长期延迟至54h)，说明此时金纳米粒子对Aβ的聚集有一定抑制作用。但从图6中看到，即使在很大浓度时(20.0ppm)L-NIBC修饰的金纳米粒子的加入也无法实现完全抑制(指不出现增长期，荧光曲线完全为平)的效果。另一方面，L-NIBC修饰的金纳米粒子加入后，由于ThT的荧光发射峰位于515nm处，而L-NIBC修饰的金纳米粒子的等离子体共振吸收峰位于520nm附近，因此此处观察到的ThT荧光强度的下降是金纳米粒子的等离子体共振效应对ThT荧光的部分淬灭，而不能归因于L-NIBC修饰金纳米粒子对Aβ(1-40)聚集的抑制作用。

图6的F幅-H幅表明所有的L-NIBC修饰的金团簇均能大幅度抑制Aβ的聚集(推迟增长期开始的时间，当L-NIBC修饰的金团簇的浓度为5ppm时，20μM的Aβ聚集动力学的增长期开始的时间即可延迟至50h之后)，而且当L-NIBC修饰的金团簇的浓度达到10ppm及以上时，均能完全抑制Aβ的聚集(不出现增长期，荧光曲线完全为平)。至于完全抑制所需的L-NIBC修饰的金团簇最低浓度与配体的种类和金团簇直径有关，其中颗粒尺寸为1.1nm、1.8nm和2.6nm的L-NIBC修饰的金团簇所需的最低浓度分别为5.0ppm，5.0ppm和10.0ppm。此外，由于L-NIBC修饰的金团簇不存在等离子体共振效应，因而对ThT的荧光无淬灭作用，因此，此处观察到的荧光强度的降低完全是由于L-NIBC修饰的金团簇对Aβ(1-40)聚集的抑制作用。图6的定量结果与图5的定性结果完全吻合。

本实验表明：当L-NIBC修饰的金纳米粒子尺寸小于或等于6.0nm时，对Aβ的聚集及纤维化有一定的抑制作用，但作用有限；L-NIBC修饰的金团簇具有完全抑制Aβ聚集及纤维化的功能，由于L-NIBC分子本身不能影响Aβ的聚集及纤维化(结合图5的B幅与图6的A幅)，因此，这一功能来自于金团簇，而不是作为配体的L-NIBC。本实验结果为利用金团簇形成与Aβ的聚集及纤维化相关的疾病的药物研发提供了有力支持，这为形成与Aβ的聚集及纤维化相关的疾病(如青光眼)的药物打下了基础。L-NIBC修饰的金团簇可归为本发明定义的含有金团簇的物质。

本实施例还对表1所列其他不同配体修饰的金团簇的功能进行了验证，例如，图12的A幅-H幅分别是CR、N-乙酰基-L-半胱氨酸(L-NAC)、GSH、1-[(2S)-2-甲基-3-巯基-1-氧代丙基]-L-脯氨酸(Cap)、D-NIBC、RC、L-半胱氨酸和D-半胱氨酸修饰的金团簇(用量均为10ppm)对Aβ(1-40)的聚集和纤维化的抑制作用效果图。对不同配体修饰的金团簇也观察到类似现象，并能做出相同的结论：这些配体本身不能影响Aβ的聚集及纤维化，配体修饰的尺寸大于3nm的金纳米粒子对Aβ的聚集及纤维化抑制作用有限，更大的金纳米粒子甚至对Aβ的聚集及纤维化有促进作用；而配体修饰的金团簇对Aβ聚集及纤维化具有优异的抑制作用，当浓度达到5-10ppm以上时，则可实现完全的抑制效果，完全抑制所需的最低浓度根据配体的不同和金团簇颗粒尺寸的不同而略有差别。这些配体修饰的金团簇同样归为本发明定义的含金团簇的物质。

由于金团簇不能脱离配体单独在溶液中稳定存在，本实验以配体修饰的金团簇进行实验，但实验结果显示影响Aβ的聚集及纤维化的为金团簇本身，表明金团簇是功效成分。因此，基于本发明贡献的金团簇的上述功能而实施的其它改变，例如不使用配体、改变配体、使用具有活性或不具有活性的配体、将金团簇与其它载体或药物合用等其它变化，均属于基于本发明做出。

实施例4：H₂O₂诱导RGC-5细胞氧化应激损伤模型实验

本实施例以细胞存活率为指标，通过cck-8法检测的结果，测试配体修饰的金团簇对抗H₂O₂引起的细胞毒性作用，以说明金团簇在神经节细胞氧化应激损伤机制中具有神经保护作用。

实验一：

取对数生长期的RGC-5细胞，用完全培养基(DMEM培养基+10％FBS+1％青霉素-链霉素)稀释成密度为5×10⁴/mL的细胞悬液，每孔100μL接种于96孔板，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养。一组实验加药方式为，待细胞贴壁后，弃去原培养液，在不同的板孔中加入由维持培养基(DMEM培养基+2％FBS+1％青霉素-链霉素)配制的不同浓度的待测物(待测物是：粒径为2.6nm、1.8nm、1.1nm的三种L-NIBC修饰的金团簇，或粒径为18.2nm、10.1nm、6.0nm、3.6nm的四种L-NIBC修饰的金纳米粒子，或作为参比的未与金团簇或金纳米粒子结合的L-NIBC分子)溶液50μL使其终浓度分别为0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10ppm，预处理2h后，在给药组和模型组加入50μL>2O₂(终浓度为100μM)，孵育细胞24h，每孔加入10％的CCK-8孵育4h，于450nm波长处测定各孔吸光度值来评价金团簇对H₂O₂损伤的预保护作用。另一组实验加药方式为，待细胞贴壁后，弃去原培养液，在不同的板孔中分别加入由维持培养基配制的50μL>2O₂溶液(终浓度为100μM)，分别孵育4h，8h，12h，24h后，然后在每组不同孵育时间的板孔中，分别加入不同浓度的维持培养基配制的待测物溶液50μL使其终浓度分别为0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10ppm，再分别继续培养24h。然后每孔加入10％的CCK-8孵育4h，于450nm波长处测定各孔吸光度值来评价金团簇对H₂O₂损伤的治疗作用。以上实验均设置不含细胞的空白对照组、细胞未做任何处理的细胞对照组以及细胞用100μM的H₂O₂处理的损伤对照组。

结果表明本发明提供的配体修饰的金团簇可显著提高H₂O₂损伤的RGC细胞模型的存活率，说明其能对抗氧化应激引发的RGC细胞凋亡。而相同配体的较大尺寸的金纳米粒子对抗氧化应激引发的RGC细胞凋亡的效果不佳或无明显作用，L-NIBC对抗氧化应激引发的RGC细胞凋亡无明显作用。不同配体修饰的金团簇具有相似效应，而相应的配体本身则无明显作用，说明其作用来自于金团簇本身，而不是配体。

实验二：

取对数生长期的RGC-5细胞，用完全培养基(DMEM培养基+10％FBS+1％青霉素-链霉素)稀释成密度为5×10⁴/mL的细胞悬液，每孔100μL接种于96孔板，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养。待细胞贴壁后，弃去原培养液，在不同的板孔中加入由维持培养基(DMEM培养基+2％FBS+1％青霉素-链霉素)配制的不同浓度的金团簇或金纳米粒子溶液50μL使其终浓度分别为0.1、1和10ppm，预处理2h后，加入约50μL>2O₂(终浓度为105μM)，孵育细胞24h，每孔加入10％的CCK-8孵育4h，于450nm波长处测定各孔吸光度值来评价金团簇对H₂O₂损伤的预保护作用。以上实验均同时设置细胞未做任何处理的空白对照组、细胞用105μM的H₂O₂处理的模型对照组、细胞添加100ppm金团簇但不添加H₂O₂的金团簇对照组，以及细胞添加10ppm配体和105μM的H₂O₂但不添加金团簇或金纳米粒子的配体对照组。

以L-NIBC修饰的金团簇或金纳米粒子的实验结果为例，如图13所示。结果显示，经24小时培养后，添加了100ppm金团簇但不用H₂O₂处理的金团簇对照组相对于空白对照组(设为100％)的细胞存活率上升至111.5±6.2％(P<0.05)，说明金团簇无毒。添加了100μM的H₂O₂但未添加金团簇或金纳米粒子的模型对照组的细胞存活率降为43.0±7.8％(对空白对照组P<0.005)，添加了10ppm的L-NIBC和100μM的H₂O₂但未添加金团簇或金纳米粒子的配体对照组细胞存活率为47.5±6.6％(对空白对照组P<0.01，对模型对照组P>0.05)，说明配体单独使用时对H₂O₂损伤的细胞模型存活率无提升作用。而添加了0.1ppm、1ppm和10ppm金团簇的给药组细胞存活率分别上升至69.8±9.5％(对模型对照组P<0.05)、83.3±6.1％(对模型对照组P<0.01)和86.8±7.4％(对模型对照组P<0.01)。另一方面，相应配体的平均尺寸为6.0nm的金纳米粒子在三个实验浓度对模型细胞的存活率与模型对照组均无明显差异(P>0.05)。

以上结果表明本发明提供的配体修饰的金团簇可显著提高H₂O₂损伤的RGC细胞模型的存活率，说明其能对抗氧化应激引发的RGC细胞凋亡，而L-NIBC对抗氧化应激引发的RGC细胞凋亡无明显作用，说明其作用来自于金团簇本身，而不是配体。相同配体的较大尺寸的金纳米粒子对抗氧化应激引发的RGC细胞凋亡也无明显作用，说明金纳米粒子不能作为药物用于青光眼的预防与治疗。

表1所列的不同配体修饰的金团簇或金纳米粒子采用同样的步骤开展实验，也有相似作用，在此不一一赘述。

实施例5：N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)诱导的RGC-5细胞兴奋毒性模型实验

本实施例以细胞存活率为指标，通过cck-8法检测的结果，反映配体修饰的金团簇对抗NMDA引起的细胞毒性作用，以说明金团簇在神经递质兴奋毒性反应损伤机制中具有神经保护作用。

取对数生长期的RGC-5细胞，用完全培养基稀释成密度为5×10⁴/mL的细胞悬液，每孔100μL接种于96孔板，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养。一组实验加药方式为，待细胞贴壁后，弃去原培养液，在不同板孔中加入由维持培养基配制的不同浓度的待测物(待测物是：粒径为2.6nm、1.8nm、1.1nm的三种L-NIBC修饰的金团簇，或粒径为18.2nm、10.1nm、6.0nm、3.6nm的四种L-NIBC修饰的金纳米粒子，或作为参比的未与金团簇或金纳米粒子结合的L-NIBC分子)溶液50μL，使其终浓度分别达到0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10ppm。预处理2h后，在给药组和模型组加入维持培养基配制的50μL>

结果表明本发明提供的配体修饰的金团簇能显著提高NMDA诱导兴奋毒性损伤的RGC细胞模型的存活率，说明其能抑制神经性递质介导的兴奋性RGC细胞凋亡。而相同配体的较大尺寸的金纳米粒子对神经性递质介导的兴奋性RGC细胞凋亡的抑制效果不佳或无明显作用，L-NIBC对神经性递质介导的兴奋性RGC细胞凋亡无明显作用。不同配体修饰的金团簇具有相似效应，而相应的配体本身则无明显作用，说明其作用来自于金团簇本身，而不是配体。

实施例6：硝普钠(SNP)诱导的RGC-5细胞凋亡损伤模型实验

本实施例以细胞存活率为指标，通过cck-8法检测的结果，反应配体修饰的金团簇对抗SNP引起的细胞毒性作用，以说明金团簇在细胞凋亡损伤机制中具有神经保护作用。

实验一：

取对数生长期的RGC-5细胞，用完全培养基稀释成密度为5×10⁴/mL的细胞悬液，每孔100μL接种于96孔板，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养。一组实验加药方式为，待细胞贴壁后，弃去原培养液，加入由维持培养基配制的不同浓度的待测物(待测物是：粒径为2.6nm、1.8nm、1.1nm的三种L-NIBC修饰的金团簇，或粒径为18.2nm、10.1nm、6.0nm、3.6nm的四种L-NIBC修饰的金纳米粒子，或作为参比的未与金团簇或金纳米粒子结合的L-NIBC分子)溶液50μL，使其终浓度分别达到0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10ppm。预处理2h后，在给药组和模型组加入维持培养基配制的50μL>

结果表明本发明提供的配体修饰的金团簇能显著提高SNP引发的RGC细胞凋亡损伤模型的细胞存活率，说明其对脑缺血缺氧引发的RGC细胞凋亡具有保护作用。而相同配体的较大尺寸的金纳米粒子对脑缺血缺氧引发的RGC细胞凋亡的保护作用效果不佳或无明显作用，L-NIBC对脑缺血缺氧引发的RGC细胞凋亡的保护作用无明显作用。不同配体修饰的金团簇具有相似效应，而相应的配体本身则无明显作用，说明其作用来自于金团簇本身，而不是配体。

实验二：

取对数生长期的RGC-5细胞，用完全培养基稀释成密度为5×10⁴/mL的细胞悬液，每孔100μL接种于96孔板，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养。一组实验加药方式为，待细胞贴壁后，弃去原培养液，加入由维持培养基配制的不同浓度的金团簇或金纳米粒子溶液50μL，使其终浓度分别达到0.1、1和10ppm。预处理2h后，加入维持培养基配制的50μL>

以L-NIBC修饰的金团簇或金纳米粒子的实验结果为例，如图14所示。结果显示，经24小时培养后，添加了100ppm金团簇但不用SNP处理的金团簇对照组相对于空白对照组(设为100％)的细胞存活率上升至115.4±4.8％(P<0.05)，说明金团簇无毒。模型对照组的细胞存活率降为56.7±6.0％(对空白对照组P<0.001)，配体对照组细胞存活率为52.8±8.0％(对空白对照组P<0.01，对模型对照组P>0.05)，说明配体单独使用时对SNP损伤的细胞模型存活率无提升作用。而添加了0.1ppm、1ppm和10ppm金团簇的给药组细胞存活率分别上升至89.0±7.2％(对模型对照组P<0.01)、92.5±7.7％(对模型对照组P<0.01)和83.5±5.2％(对模型对照组P<0.01)。另一方面，相应配体的平均尺寸为6.0nm的金纳米粒子在三个实验浓度对模型细胞的存活率与模型对照组均无明显差异(P>0.05)。

以上结果表明本发明提供的配体修饰的金团簇可显著提高SNP损伤的RGC细胞模型的存活率，说明其能对抗SNP诱导的RGC细胞凋亡，而L-NIBC对抗SNP诱导的RGC细胞凋亡无明显作用，说明其作用来自于金团簇本身，而不是配体。相同配体的较大尺寸的金纳米粒子对SNP诱导的RGC细胞凋亡也无明显作用，说明金纳米粒子不能作为药物用于青光眼的预防与治疗。

表1所列的不同配体修饰的金团簇或金纳米粒子采用同样的步骤开展实验，也有相似作用，在此不一一赘述。

实施例7：大鼠青光眼视神经钳夹损伤模型实验

大鼠视神经钳夹损伤模型是一个广泛应用的非高眼压青光眼动物模型。该模型是采用压力恒定的反向镊夹持大鼠视神经制作的不完全损伤模型，它保持了视神经外模完整，操作简单，重复性好，较接近临床青光眼特征，是研究青光眼视神经损伤及视网膜功能较为成熟的动物模型。尤其是这一模型在RGCs细胞死亡的病理过程以及测试药物对抑制或减缓视神经损伤及RGCs凋亡的研究中应用广泛。

实验一：

1)制作大鼠视神经钳夹损伤模型

108只SPF级成年雄性Brown Norway大鼠，适应性饲养一周后，采用5％水合氯醛腹腔注射麻醉。大鼠右眼周皮肤常规消毒，置于双目手术显微镜下，剪开外眦与球结膜，推开哈达腺与泪腺组织，沿巩膜壁分离到外直肌抵止点，分离暴露视神经。用无创血管夹在球后1mm处夹持视神经10s造成视神经钳夹伤。在夹持过程中要注意避开血管。夹持结束后，缝合外直肌肌肉断端及各层组织，恢复结膜囊。术后观察眼底视网膜血管运行情况，涂典必殊眼膏，缝合眼睑。术后第一天观察大鼠视神经钳夹模型是否造模成功，无视网膜缺血，无视网膜前玻璃体出血等并发症者为成功模型，不成功者剔除实验。所有大鼠左眼不做任何处理，作为正常对照组。

2)动物实验：随机将108只视神经钳夹损伤模型大鼠按给药时间长短分为3组，分别为7天、14天和21天取材组，n＝36只/组。每组又随机分为3个小组，包括高剂量给药组(金团簇浓度：5g/L)、低剂量给药组(金团簇浓度：1g/L)和对照组(生理盐水)，n＝12只/组。高剂量给药组和低剂量给药组大鼠从建模当天起右眼滴注待测化合物溶液20μl/眼。对照组大鼠从建模当天起右眼滴注10μl/眼生理盐水作为对照。所有大鼠(包括对照组，高剂给药量和低剂量给药组)左眼均滴10μl生理盐水作为对照。滴注频率和时间为3次/天(7.00am，3.00pm和11.00pm),共7天、14天和21天。

3)检测指标和检测方法

眼底照相：每只大鼠用药前和用药后第7/14/21天，所有大鼠眼底照相。大鼠采用5％水合氯醛腹腔注射全身麻醉后，剪去鼠须，用复方托吡卡胺滴眼液散瞳，暴露鼠眼调整镜头方向，直至视网膜目标血管在屏幕清晰可见，拍摄彩色眼底像。注意在整个过程中采用羟丙甲纤维素滴眼液湿润眼角膜。

视觉诱发电位检测(Visual Evoked Potential，VEP检测)：参照国际临床视觉电生理标准，检测每只大鼠用药前和用药后第7/14/21天双眼的VEP。5％水合氯醛腹腔注射麻醉动物后，用复方托吡卡胺滴眼液散瞳。为了减少干扰电阻，将大鼠前囟和视皮质区所对应处体表毛剔除。将大鼠置于暗室内适应30min。采用全视野闪光刺激器(刺激频率1.0Hz；频带宽0.1～75Hz)。分析时间为250ms，采样频率2.7Hz叠加100次；连续测量至少3次。皮肤记录电极为7mm盘状氯化银，作用电极置于角膜表面，参考电极置于同侧颞部，地电极置于尾部皮下。检查另外一只眼时，用不透光黑眼罩完全遮盖对侧眼。VEP波形的描述采用ab波标定法。为了排除其他潜伏期和振幅的变异干扰，采用与临床相一致的L5b和振幅A5为观察指标。每次观察并记录3条稳定波形，取L5b和A5平均值作为观察值。

常规苏木精和伊红染色(HE染色)：每组随机取6只大鼠，5％水合氯醛腹腔注射麻醉后完整摘除眼球以及眼眶内段视神经。磷酸盐缓冲液(Phosphate buffer saline,PBS)漂洗，在手术显微镜下去除角膜，晶状体和玻璃体。将眼杯和视神经浸入4％多聚甲醛缓冲液中固定24小时。将组织取出，用PBS洗三次，依次梯度乙醇(50％乙醇90min，70％乙醇90min，85％乙醇90min，95％乙醇60min，100％乙醇60min)脱水。在二甲苯和乙醇1：1混合液中浸泡1h，然后在纯二甲苯中浸泡1h。浸蜡、包埋和切片：将透明后的组织依次浸入石蜡和二甲苯1：1混合液中90min，再放入石蜡中120min，立即冷却。然后将眼杯标本5μm连续切片，60℃烤片备用。将玻片浸入二甲苯5min，重复3次。然后将玻片依次浸入梯度乙醇(100％，90％和70％)中各5min，最后用自来水冲洗切片5min。将玻片在苏木精染液中染色5min。用水洗去玻片上多余染液后，75％盐酸乙醇液分色10s，用自来水冲洗玻片直到显微镜检测细胞核及核染色质清晰为止。用0.5％伊红溶液染色5min后，依次用70％，85％，95％，100％乙醇脱水2min。用二甲苯透明2次，每次1min。擦去切片周围多余二甲苯，注意切勿干涸，快速滴加适量中性树胶然后加盖玻片封片后进行光学显微镜观察视网膜形态、RGCs变化并采图。

全视网膜铺片以及Brn3a免疫荧光染色及计算机图像分析RGCs：每组随机取6只大鼠，5％水合氯醛腹腔注射麻醉后完整摘除眼球用PBS漂洗干净。眼球浸入4％多聚甲醛缓冲液中常温固定30min。然后在手术显微镜下除去角膜，虹膜，晶状体，将剩余的眼杯组织再浸入4％多聚甲醛缓冲液中常温固定30min。在巩膜剪开4个放射状切口以便平铺视网膜。轻轻剥离视网膜，用PBS漂洗一次，然后将玻璃体面朝上，用毛笔尖小心清除残余玻璃后进行视网膜铺片，4℃干燥过夜。将视网膜铺片用PBS洗5min共3次后，整个视网膜用0.5％Triton-X100(用PBS配置)封闭液常温封闭15min。多余封闭液用PBS洗5min共3次后，用含有Brn3a一抗的稀释液(2％牛血清白蛋白，2％Triton-X100溶于PBS缓冲液，抗体稀释度为1:100)4℃孵育过夜。PBS冲洗5min共3次。加以稀释液配置的二抗(Cy3标记的驴抗羊二抗，释度为1:200)常温孵育2h。最后用PBS冲洗10min共3次，封片后正置于荧光显微镜下观察拍照。待测视网膜铺片以视神经乳头为中心，用摄像头和Adobe Photoshop软件采集图片。采用Scion图像分析软件(Scion Corp.,Frederick,MD)来统计视野下(7200平方微米，40X放大率)Brn3a-阳性视网膜细胞的总数。一共采集镜头下4-6个据视神经乳头距离相等的不同区域里RGCs数目。换算求得平均值以代表视网膜标记细胞数的比较参数。采用SPSS 21.0统计软件(Chicago，IL)进行数据统计学分析。实验数据以实验平均数±标准差(mean±SEM)表示。数据采用方差分析，组与组之间的统计学分析采用One-Way Anova检验。p<0.05为差异有统计学意义。

结果表明本发明提供的配体修饰的金团簇能缩小给药组模型大鼠右眼的视野缺损，降低其RGCs细胞的凋亡，改善其视网膜细胞的结构及排列，对缓解模型大鼠的右眼视功能障碍有显著作用，说明金团簇能用于制备青光眼预防及治疗药物。

实验二：

1)制作大鼠视神经钳夹损伤模型

SPF级成年雄性Sprague Dawley(SD)大鼠，适应性饲养一周后，采用腹腔注射氯胺酮(50mg/kg)和赛拉嗪(10mg/kg)麻醉动物。用1:10稀释的聚维酮碘溶液消毒动物眼周毛发和皮肤，并用生理盐水冲洗结膜囊。在眼外眦上方约2mm处，剪开眼球结膜，避开大血管，沿外直肌方向向后钝性分离，提起球结膜向前稍微牵拉眼球，暴露视神经。然后用止血钳在球后约2mm处钳夹视神经，持续30s之后，小心将眼球复位，并在手术眼结膜囊内给予眼用抗生素凝胶。将动物放回笼子并注意观察，直至动物清醒。造模后1-3天给以止痛剂。术后观察大鼠视神经钳夹模型是否造模成功，无视网膜缺血，无视网膜前玻璃体出血等并发症者为成功模型，不成功者剔除实验。所有大鼠左眼不做任何处理，作为正常对照组。

2)动物实验：采用计算机生成的随机方法将60只SPF级成年SD大鼠分为5组(n＝12/组)。1组动物不做任何处理，作为正常对照组。2-5组动物右眼通过钳夹法制造大鼠视神经损伤模型，分别为阴性对照组，低剂量给药组、中剂量给药组和高剂量给药组。造模当天记为第1天。低剂量、中剂量和高剂量给药组大鼠从造模当天起右眼分别滴注0.1g/L、0.2g/L或0.5g/L的L-NIBC修饰的金团簇生理盐水溶液，每天3次，每次10μL/眼(两次给药时间间隔5±0.5小时)。对照组大鼠从造模当天起右眼滴注生理盐水作为对照，每天3次，每次10μL/眼。第7天、第14天分别测定各组大鼠闪光视觉诱发电位。第15天，所有动物安乐死，取右眼，经适当处理后，分别行HE染色和免疫荧光染色(n＝6/组)。

3)检测指标和检测方法

闪光视觉诱发电位检测(flash visual evoked potentials，fVEP)：采用罗兰电生理诊断系统(Roland Consult Electrophysiological Diagnostic Systems,RETIportVEP-ERG-AEP Version 6.16.3.4,Germany)，在试验前对所有动物进行一次fVEP检查，然后于第7和第14天对各组动物右眼进行一次fVEP检查。主要步骤如下：检查前，动物至少暗适应12小时。用1.0％托吡卡胺对动物进行散瞳，腹腔注射氯胺酮(50mg/kg)和赛拉嗪(10mg/kg)麻醉动物。将动物俯卧放置于升降台，将接地电极插入大鼠尾根部皮下，参考电极置于大鼠口中，测试电极插入大鼠头部枕骨粗隆处皮下。检查各电极电阻，符合要求后开始收集电生理信号(刺激频率1.3Hz；频带7.3Hz)，fVEP波形的描述采用NP波标定法，取N2和P2平均值作为观察值,每个动物重复收集3次稳定波形。采用SPSS 21.0统计软件(Chicago，IL)进行数据统计学分析。实验数据以实验平均数±标准差(mean±SEM)表示。数据采用方差分析，组与组之间的统计学分析采用One-Way Anova检验。P<0.05为差异有统计学意义。

全视网膜铺片以及Brn3a免疫荧光染色：每组随机取6只大鼠，安乐死后，将右眼球取出后，用针头在角巩膜缘处扎几个孔，放置4％多聚甲醛中约20分钟，随后取出眼球，去掉角膜和晶体，随后在冰面上小心剥离视网膜，剥下后将视网膜切成四叶状，放回4％多聚甲醛中固定5分钟。用0.01mol/L磷酸盐缓冲液(Phosphate buffersaline,PBS)冲洗视网膜6分钟。加入封闭液(Blocking Reagent，产品编号：SC-516214，批号：C1317，圣克鲁斯生物技术有限公司)在室温下摇床震荡2小时，随后吸出封闭液，加入Brn-3a抗体(14A6)(产品编号：SC-8429，批号B1216，圣克鲁斯生物技术有限公司，用稀释液1:50稀释后使用；稀释液：2.5mL封闭液，0.15mL TritonX-100，加入到47.35mLPBS中混匀)。在2-8℃下，摇床震荡孵育约72小时。之后取出平衡至室温30分钟，随后用PBS冲洗5次。加入m-IgGκBP-CFL 488(产品编号：SC-516176，批号A1917，圣克鲁斯生物技术有限公司，用稀释液1:100稀释后使用)，在2-8℃下，摇床震荡孵育过夜。用PBS冲洗5次后，放置玻片上，用封片胶封片。通过荧光显微镜观察视网膜铺片，评估Brn3a染色阳性的神经节细胞(Retinalgangliacells，RGCs)。在40x共聚焦显微镜下对四叶视网膜铺片的每一叶中心进行拍照，采用ImageJ bundled with 64-bit Java1.6.0_24软件(软件选择尺寸范围：50-infinity)对图像进行计数每张照片内RGC的数量，取4个计数的平均值作为该动物的RGC数量。采用SPSS21.0统计软件(Chicago，IL)进行数据统计学分析。P<0.05为差异有统计学意义。

组织病理学检查(苏木精-伊红染色，HE染色)：每组随机取6只大鼠，安乐死后采集动物眼球置于改良的Davidson’s溶液中固定24至72小时，然后转移至10％中性缓冲福尔马林溶液。HE染色前，将眼球取出，用PBS洗三次，依次梯度乙醇(50％乙醇90min，70％乙醇90min，85％乙醇90min，95％乙醇60min，100％乙醇60min)脱水。在二甲苯和乙醇1：1混合液中浸泡1h，然后在纯二甲苯中浸泡1h。浸蜡、包埋和切片：将透明后的组织依次浸入石蜡和二甲苯1：1混合液中90min，再放入石蜡中120min，立即冷却。然后将眼杯标本5μm连续切片，60℃烤片备用。将玻片浸入二甲苯5min，重复3次。然后将玻片依次浸入梯度乙醇(100％，90％和70％)中各5min，最后用自来水冲洗切片5min。将玻片在苏木精染液中染色5min。用水洗去玻片上多余染液后，75％盐酸乙醇液分色10s，用自来水冲洗玻片直到显微镜检测细胞核及核染色质清晰为止。用0.5％伊红溶液染色5min后，依次用70％，85％，95％，100％乙醇脱水2min。用二甲苯透明2次，每次1min。擦去切片周围多余二甲苯，注意切勿干涸，快速滴加适量中性树胶然后加盖玻片封片。通过光学显微镜观察病理切片，在40x光镜下对切片进行拍照，每张切片在视神经两侧各选取2个视野拍照，随后在每张照片中划定同样大小的计数框(计数框大小：长18.00cm×3.47cm宽)，由2人分别计数每张照片计数框内RGC的数量，2人计数的均值作为每张照片上的细胞数量，最终取每只眼4个计数的平均值作为该动物的RGC数量。采用SPSS 21.0统计软件(Chicago，IL)进行数据统计学分析。P<0.05为差异有统计学意义。

实验结果如下：

1)不同剂量金团簇对模型大鼠闪光视觉诱发电位(fVEP)的影响

本试验采用钳夹法建立大鼠视神经损伤模型，并通过连续14天，每天3次(两次给药时间间隔5±0.5小时)滴眼给药，每次10μL/眼，并在第7天和14天评价不同剂量的金团簇给药对SD大鼠fVEP的影响。视神经损伤后，fVEP波幅愈低、波形愈宽、潜伏期愈长，则表示损伤越重。

N2和P2潜伏期：在造模和给药前，正常对照组、阴性对照组和低、中、高剂量组动物的N2和P2潜伏期均无显著差异(P>0.05)(图15和图16)，说明实验分组不对后续实验结果造成影响。在造模及给药后7天和14天，与正常对照组相比，阴性对照组和低、中、高剂量给药组动物N2和P2潜伏期，均极显著延长(P<0.0001)(图15和16)。说明本试验成功建立钳夹造成的视神经损伤模型。在造模及给药后7天和14天，与阴性对照组相比，低、中、高剂量给药组动物N2和P2潜伏期，均无显著差异(P>0.05)(见图15和16)。

N2-P2振幅：大鼠在造模和给药前，正常对照组、阴性对照组和低、中、高剂量组动物的N2-P2振幅均无显著差异(P>0.05)(图17的A幅和B幅)，说明实验分组对后续实验结果没有影响。在造模及给药后7天，与正常对照组(22.2±2.3μV)相比，阴性对照组N2-P2振幅(14.7±1.2μV)显著降低(降低了33.7±5.4％，P<0.05)，说明大鼠视功能及视神经受到显著影响，本实验视神经损伤模型造模成功。与阴性对照组相比，高剂量给药组N2-P2振幅(22.0±2.0μV)显著升高(升高了49.4±9.1％，P<0.05)。低剂量与中剂量给药组N2-P2振幅与阴性对照组相比虽然也有所提高(低剂量组：20.2±1.6μV，提高37.6±7.3％；中剂量组：29.9±1.5μV，提高35.5±6.8％)，但没有显著性差异(P>0.05)。在造模及给药后14天，阴性对照组N2-P2振幅(13.2±1.5μV)显著低于正常对照组(19.7±1.2μV)(降低32.9±8.0％，P<0.05)。与阴性对照组相比，金团簇高剂量给药组大鼠N2-P2振幅(22.4±1.7μV)大幅度提升(升高69.0±8.5％，P<0.01)，而低剂量和中剂量给药组对改善N2-P2振幅均无显著作用(低剂量给药组：15.2±1.2μV，提高14.5±6.2％，P>0.05；中剂量给药组：17.6±1.4μV，提高32.8±7.0％，P>0.05)。以上结果表明短期和长期金团簇给药均能显著提高SD大鼠N2-P2振幅，并且该作用呈剂量依赖性。同时，显微镜观察发现，金团簇给药可显著改善视神经钳夹损伤模型所造成的视野缺损，并且也呈剂量依赖性。说明金团簇对动物的视神经损伤有明显改善作用。

2)Brn3a免疫染色检查不同剂量金团簇连续给药14天对SD大鼠RGCs细胞的影响

Brn3a在神经元的生存和分化相关基因的激活，在鼠类视网膜发育过程中，对RGCs的分化、存活以及轴突的延伸其重要作用，是RGCs重要且可行度非常高的标记物。Brn3a免疫染色显示细胞个数越多，则RGCs细胞存活数量越多。结果如图18所示，与正常对照组(图18的A幅)(单个计数框内Brn3a染色阳性细胞个数：126.5±7.0个)相比，阴性对照组(图18的B幅)Brn3a染色阳性细胞数量(7.6±1.6个)仅为正常对照组的6.0±1.3％(P<0.01)(图18的F幅)，说明造模损伤后动物神经节细胞会大量丢失。相比于阴性对照组，金团簇高剂量给药组(图18的E幅)Brn3a染色阳性细胞个数(50.8±22.9个)显著提高(提高5.6倍，P<0.01)(图18的F幅)。金团簇低剂量(图18的C幅)和中剂量给药组(图18的D幅)RGCs数量(分别为19.6±9.6个和15.8±5.4个)与阴性对照组相比虽也有所提高，但均无统计学差异(P＞0.05)(图18的F幅)。以上结果支持fVEP实验结果，说明金团簇对视神经损伤后神经节细胞的丢失有明显的保护作用，且效果呈剂量依赖性。

3)HE染色检查不同剂量金团簇连续给药14天对SD大鼠视网膜组织形态及RGCs数量的影响

大鼠视网膜病例切片进行苏木精—伊红染色(hematoxylin-eosin stainin，HE染色)可在显微镜下从另一个角度观察视网膜组织形态同时对RGCs细胞进行计数。结果如图19显示，与正常对照组(图19的A幅)(单个计数框内RGCs数量：27.1±0.9个)相比，阴性对照组(图19的B幅)的视网膜呈明显的组织水肿，且厚薄不均，RGCs细胞大量丢失(15.5±0.5个，减少44.8±1.8％，P<0.01)，且排列出现明显高低不平。与阴性对照组相比，金团簇高剂量(图19的E幅)给药组的RGCs细胞数量(19.1±1.2个)显著增加(增多27.4±4.4％，P<0.05)，且视网膜组织结构明显改善，组织水肿和空泡样状况明显减少。金团簇低剂量(图19的C幅)和中剂量给药组(图19的D幅)与阴性对照组相比RGCs数量虽然有所增多(低剂量给药组：16.5±0.6个，增多10.4±2.4％；中剂量给药组16.2±1.1个，增多8.4±4.1％)，但均无显著性差异(P>0.05)(图19的F幅)。上述结果与Brn3a免疫染色RGCs计数的结果呈对应关系，表明金团簇可减少视神经受损所造成的RGCs丢失，显著改善视网膜结构及RGCs排列，具有视神经保护作用，且效果呈剂量依赖关系。

以上结果表明,金团簇可显著提升视神经钳夹损伤模型大鼠的闪光视觉诱发电位的N2-P2振幅，并显著减少视网膜神经节细胞的丢失，对视神经损伤有保护作用，可缩小视野缺损，降低RGCs细胞凋亡，对改善视网膜和视神经组织结构以及缓解视功能障碍有显著作用，可作为含金团簇的物质用于制备预防或治疗青光眼的药物。

表1所列的其它不同配体修饰的金团簇也有相似作用，在此不一一赘述。

实施例8：生物安全性评价

1、采用SH-sy5y细胞株评价细胞层面金团簇的生物安全性。

具体方法如下：收集细胞繁殖处于对数期的SH-sy5y细胞(细胞传至第六代)，调整细胞悬液浓度，每孔加入100μL，铺板使待测细胞调密度至1000-10000孔，将细胞培育板(96孔平底板边缘孔用细胞培养液填充)置于细胞培育箱中，在5％CO₂，37℃环境中孵育24h让细胞贴壁。将96孔板取出，酒精消毒后置于生物安全柜内，吸出原细胞培养液,分别加入用细胞培养液稀释至1ppm、10ppm、50ppm，100ppm、200ppm、500ppm的表1所列的配体修饰的金团簇溶液，对照组(无金团簇)加入等量的新鲜细胞培养液，然后放入细胞培育箱中继续孵育48h,实验组和对照组每组均设6个复孔。培养48h后，离心除去培养液，用PBS冲洗2-3遍后，在每孔加入100μL新鲜培养液和20μL噻唑蓝(MTT)溶液(5mg/ml，即0.5％MTT)，继续培养4h后终止培养，取出96孔板，离心(1000r/min)10min，吸出上清液，每孔加入200μL>

以实施例2的L-NIBC修饰的金团簇为例，结果见图20，其中A幅-C幅分别是粒径为2.6nm、1.8nm、1.1nm，终浓度分别为1ppm、10ppm、50ppm，100ppm、200ppm、500ppm的金团簇对SH-sy5y细胞存活率的影响。可以看到，在相当高的浓度(如100ppm)下，L-NIBC修饰的金团簇的加入对细胞存活率几乎无影响，在更高浓度(如200和500ppm)下，L-NIBC修饰的金团簇的加入会造成较小程度的细胞损伤(细胞死亡率小于20％)。由于100ppm已远大于药物的起效浓度(0.1ppm或更低)，因此，可以认为L-NIBC修饰的金团簇在细胞层面具有很高的安全性。

其它配体修饰的不同尺寸的金团簇也有相似的效果，在此不一一赘述。

2、采用小鼠急性毒性实验评价金团簇的急性毒性。

具体方法如下：对于表1所列的不同配体修饰的的金团簇(以实施例2中L-NIBC修饰的平均直径为1.8nm的金团簇为例)，取60只成年小鼠，分成四组，每组15只，分别为对照组及三个实验组。其中对照组正常喂养，而三个实验组在正常饮食的情况下，按每天0.1g/Kg体重、0.3g/Kg体重和1g/Kg体重的量采用口服灌胃的方法喂食金团簇，持续一星期。停止喂食金团簇后再继续正常饲养30天。观察小鼠的异常反应。

在小鼠实验中，三种不同浓度的不同尺寸的金团簇摄入对小鼠的存活及活动性均无影响。即使是1g/Kg体重的高剂量摄入，小鼠依然保持健康。

表1所列的其它不同配体修饰的金团簇也有类似结果，在此不一一赘述。从以上结果可以得到结论，金团簇是非常安全的。

实施例9：金团簇在小鼠体内组织分布及代谢分布

实验一：

操作步骤：80只小鼠随机分成四组，每组20只，采用口服灌胃的方式喂食表1所列的配体修饰的金团簇，每组金团簇喂食的量分别是100mg/kg、20mg/kg、5mg/Kg和1mg/kg。喂食金团簇后再将每组的20小鼠随机分成4组，每组5只，分别按喂食后2h、6h、24h和48h的时间点处死小鼠，分离心、肝、脾、肺、肾和脑组织。将各组织称重，然后加入2mL水进行组织匀浆，匀浆后加入2mL王水涡旋混匀，再放在振荡器上振荡72h后，加入2wt％的稀硝酸溶液定容到10mL，15000rpm离心15min。吸取上清液4mL，用原子吸收光谱法测定组织液中金元素的含量。

结果表明金团簇可通过血脑屏障到达大脑，并随着时间的延长能排出体外因而在体内无明显蓄积，因此，本发明提供的含有金团簇的物质在制备治疗AD或PD的应用中有良好前景。

实验二：

操作步骤：80只小鼠随机分成四组，每组20只，采用腹腔静脉注射的方式对小鼠给予表1所列的配体修饰的金团簇，每组金团簇(以L-NIBC修饰的平均直径为1.8nm的金团簇为例)的用量相对于小鼠的体重分别是100ppm、20mg ppm、5ppm和1ppm。注射金团簇后再将每组的20小鼠随机分成4组，每组5只，分别按喂食后2h、6h、24h和48h的时间点处死小鼠，分离心、肝、脾、肺、肾和脑组织。将各组织称重，然后加入2mL水进行组织匀浆，匀浆后加入2mL王水涡旋混匀，再放在振荡器上振荡24h后，加入2wt％的稀硝酸溶液定容到5mL，15000rpm离心15min。吸取上清液1mL，用原子吸收光谱法的石墨炉法测定组织液中金元素的含量。

针对表1所列的其它不同配体的金团簇均采用上述实验步骤开展实验。

结果表明2h后，大脑中的金元素含量达到初始给药浓度的1％-10％，6h后，脑内含量能维持在相似的水平，24h后其脑内含量显著下降，48h时除100ppm给药量的样本外，均降低至检测限附近或以下。以上结果说明，含金团簇的物质在动物层面也具有良好的生物安全性，能穿透血脑屏障，并在体内无明显蓄积。

综上所述，以上实验结果说明了以下几点(以下提及的“金纳米粒子”和“金团簇”均指有配体修饰)：

(1)在抑制Aβ聚集的体外实验(实施例3)中，发现金纳米粒子对Aβ聚集动力学的影响与尺寸相关。当颗粒直径大于或等于10.1nm时，金纳米粒子的加入能加速Aβ的聚集，而当粒子尺寸小于或等于6.0nm时，则对Aβ的聚集有抑制作用，但无法实现Aβ聚集的完全抑制。但当所用的为金团簇(平均直径小于3nm)时，所有的金团簇均能在体外大幅度抑制Aβ的聚集，而且这一作用与金团簇的浓度有关。当金团簇的浓度达到5-10ppm时，就能完全抑制Aβ的聚集，完全抑制所需的最低浓度与配体的种类和金团簇直径有关。当金团簇的浓度达到5-10ppm时，就能完全抑制Aβ的聚集。

(2)在RGC-5视神经节细胞损伤模型实验中(实施例4-实施例6)，发现本发明所用的各种不同配体修饰的不同尺寸的金团簇(平均直径均小于3nm)可显著提高RGC-5损伤模型的细胞存活率，说明细胞层面金团簇的药效显著。而相应的较大尺寸的金纳米粒子则效果不显著或无作用。由于所用的配体本身均对Aβ的聚集及不同RGC-5视神经节细胞损伤模型均无作用(实施例3-6)，因此，可以推出金团簇的药效来自于其自身的结论，这为金团簇的应用提出了新的思路。

(3)进一步地，本发明采用了大鼠青光眼视神经钳夹损伤模型(实施例7)进一步验证金团簇的药效，说明所用的金团簇可显著提升视神经钳夹损伤模型大鼠的闪光视觉诱发电位的N2-P2振幅，并显著减少视网膜神经节细胞的丢失，对视神经损伤有明显保护作用，可缩小视野缺损，降低RGCs细胞凋亡，对改善视网膜细胞的结构和排列有明显作用，说明金团簇可缓解青光眼相关的视功能障碍，能用于制备相关疾病的预防和/或治疗药物。

(4)进一步评价生物安全性的实验中(实施例8)，金团簇在100ppm重量百分比(以下所述ppm均为重量百分比)浓度下与神经细胞共同培养时对细胞的存活率无明显影响，超过100ppm(远大于药物起效的浓度)时，细胞存活率略有下降。由于金团簇的起效浓度(0.1-1ppm)远低于100ppm，因此，可以认为金团簇在细胞层面具有优异的生物安全性。而在小鼠急性毒性实验中，采用每天一次1g/Kg体重(相当于1000ppm)给药量连续服用七天，小鼠未表现出不良反应。在小鼠体内分布及药代动力学实验(实施例9)中，2h后，大脑中的金元素含量达到初始给药浓度的1％-10％，6h后，脑内含量能维持在相似的水平，24h后其脑内含量有显著下降，48h时除100ppm给药量的样本外，均降低至检测限以下。以上结果说明，含金团簇的物质在动物层面也具有良好的生物安全性，能穿透血脑屏障，并在体内无明显蓄积。以上结果说明，含金团簇的物质在动物层面也具有良好的生物安全性，能穿透血脑屏障，并在体内无明显蓄积，因此在制备治疗青光眼的药物的应用中有良好前景。

(5)相对于现有技术，本发明所用的配体并非针对Aβ及其聚集行为特殊设计，且对比实验表明所用的配体对Aβ的聚集无明显作用(实施例3)，但由于金团簇的尺寸小于Aβ蛋白本身的尺寸，因此可通过尺度效应与弱分子间相互作用的结合大幅度抑制Aβ的聚集。RGC-5视神经节细胞损伤模型与大鼠青光眼视神经钳夹损伤模型中的显著效果更验证了金团簇应用于制备预防或治疗青光眼的药物中的可行性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。