基于喹喔啉酮芳基硫醚类的荧光探针及其制备方法和应用

摘要

本发明提供了一种基于喹喔啉酮芳基硫醚类的荧光探针及其制备方法和应用，所述荧光探针分子的化学结构如式(I)所示：

说明书

技术领域

本发明涉及医学诊断领域，具体地，涉及一种基于喹喔啉酮芳基硫醚类的荧光探针及其制备方法和应用。

背景技术

铁死亡是2012年首次发现的一种新的细胞死亡方式，与传统的细胞凋亡方式不同，铁死亡是不依赖于caspases蛋白酶参与，由铁来介导的细胞凋亡。细胞发生铁死亡的过程中，其细胞内会聚集大量的活性氧，氧化酶以及严重下调的还原性谷光甘肽等。

虽然铁死亡发生的很多分子生物学机制还有待于进一步的研究，但是目前的研究表明铁死亡的发生与很多疾病密切相关，例如恶性肿瘤，神经退行性疾病帕金森，阿尔兹海默症等。所以设计开发特异性的铁死亡检测技术对于疾病的诊断具有很大的推动作用。

目前，针对铁死亡的检测主要通过生物学技术来检测其相关的生物标志物，如蛋白印迹法检测谷氨酸半胱氨酸反向转运体(XcT)的表达,以及生物试剂盒检测细胞内脂质氧化的水平。但是这些生物学的方法往往都是侵袭性的，需要将组织裂解破碎，不能实现原位检测。所以设计开发非侵袭性原位检测技术意义重大。

由于在铁死亡发生的过程中，细胞内的铁和活性氧是显著升高的，铁在生物体内大部分以铁卟啉的形式存在，在铁死亡发生时，铁卟啉作为血红素氧化酶的辅酶，催化与铁死亡过程相关的生物标志物的产生，Simonneaux课题组2011年报导了铁卟啉能够催化过氧化氢水溶液氧化芳基硫醚生成手性的亚砜。但Simonneaux课题组报道的传统的化学小分子催化剂，选择性较低及其催化速率较慢。

发明内容

近年来，针对现有铁死亡检测技术的不足和缺陷，我们基于铁死亡发生过程中的生化特征，设计合成了可变色化学荧光探针，实现铁死亡的活细胞及活体原位检测。

铁卟啉是血红素氧化酶的辅酶，所以我们推断血红素氧化酶能够催化氧化具有荧光性能的芳基硫醚化合物生成亚砜，这种荧光分子结构的变化会引发荧光性能的改变，从而起到检测细胞是否发生铁死亡。相较于Simonneaux课题组报道的传统的化学小分子催化剂，酶催化具有更高的选择性及其更快速的催化速率，并且酶是细胞发生铁死亡时所特异性的高表达，因此铁死亡的细胞本身就可以作为一个特殊的反应器催化氧化芳基硫醚类荧光分子。

进一步地，我们研究发现，铁死亡细胞内升高的血红素氧化酶和活性氧能够催化氧化带有芳基硫醚的荧光分子转化成亚砜的荧光分子，芳香环上由供电基团转变为拉电基团，这种电性效应的改变，会引起荧光光谱的位移，从而实现颜色的转变。

本发明基于喹喔啉酮声色团为基本骨架，以邻苯二胺及其衍生物通过环化，亲核取代，羟醛缩合反应构建了带有芳基硫醚类荧光分子，使其能够响应铁死亡细胞内升高的活性氧及其血红素氧化酶。

本发明所构建的基于喹喔啉酮的芳基硫醚类荧光分子可以直接加入到细胞培养液中，与细胞共培养，进行细胞水平的快速原位荧光检测。此外，该类分子还可以实现原位的动物活体成像，通过构建荷瘤鼠之后，用铁死亡诱导剂(Erastin)诱导肿瘤发生铁死亡，而后探针可以通过静脉注射或者瘤内注射的方式进行小动物活体成像的检测。

针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种基于喹喔啉酮芳基硫醚类的荧光探针及其制备方法和应用。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

第一方面，本发明提供一种喹喔啉酮衍生物，所述喹喔啉酮衍生物为喹喔啉酮芳基硫醚化合物，化学结构如下式(I)所示：

所述式(I)中，R选自H基、烯丙基及其衍生物、苄基及其衍生物、碳原子数目为1～8的脂肪酸酯基或碳原子数目为1～8的脂肪酸；R¹选自碳原子数目为1～8的烷氧基、卤素(氟、氯、溴)或碳原子数目为1～8的烷基；R²为芳基硫醚。

优选地，所述芳基硫醚包括噻吩硫醚、苯基硫醚、噻唑硫醚、呋喃硫醚和吡咯硫醚。

优选地，所述R选自H基、烯丙基及其衍生物、苄基及其衍生物、乙酸酯基或乙酸；所述R¹选自甲氧基、卤素或甲基。

优选地，所述喹喔啉酮衍生物为

第二方面，本发明提供一种喹喔啉酮衍生物的制备方法，所述制备方法具体包括如下步骤：

S1、将邻苯二胺及其衍生物分散在溶剂，加入丙酮酸乙酯，搅拌，反应结束后过滤，得到喹喔啉酮骨架化合物：

S2、将所述喹喔啉酮骨架化合物分散在溶剂中，加入卤代亲核试剂和碳酸盐，反应结束后纯化，得到中间取代物；

S3、将所述中间取代物分散在溶剂中，加入芳基硫醚化合物和催化剂，反应结束后纯化，得到所述喹喔啉酮衍生物。

优选地，步骤S1中，所述邻苯二胺及其衍生物与丙酮酸乙酯的摩尔比为1:1～1:1.5；

所述溶剂为无水乙醇，所述反应的温度为室温，反应的时间为6～12小时。步骤S1中，由于环化生成的产物在无水乙醇中不溶解，正好能够沉淀析出，使用其它溶剂会使得产物损失较多

优选地，步骤S2中，所述卤代亲核试剂选自溴乙酸甲酯、苄溴、溴丙烯或溴乙酸；所述碳酸盐选自碳酸钾、碳酸钠或碳酸铯。

优选地，步骤S2中，所述喹喔啉酮骨架化合物与卤代亲核试剂的摩尔比为1:1～1:1.5；

所述溶剂为丙酮，反应的温度为62℃，反应时间为8～12小时。

优选地，步骤S3中，所述中间取代物与芳基硫醚化合物的摩尔比为1:1～1:2；

所述溶剂为醋酸，反应温度为50℃，反应时间为8～24小时。

优选地，当所述卤代亲核试剂为X-CH₂-R，所述碳酸盐为碳酸钾，所述芳基硫醚化合物为R²-CHO时，所述制备方法的反应路线如下：

其中，X为卤素(氟、氯、溴)。

第三方面，本发明提供一种基于上述喹喔啉酮衍生物的荧光探针在原位检测铁死亡中的应用。

铁死亡与帕金森疾病、阿尔兹海默病密切相关，所述荧光探针可在作为帕金森疾病、老年痴呆症用检测探针的用途。另外，诱导肿瘤细胞的铁死亡在一定程度上可以抑制肿瘤生长，所以铁死亡诱导剂具有抗肿瘤的效果，本发明探针可以用于铁死亡诱导剂或者铁死亡抑制剂的筛选。

本发明中基于喹喔啉酮的芳基硫醚类荧光探针在铁死亡细胞中高表达的血红素氧化酶和活性氧的作用下，快速转换成亚砜，实现荧光光谱的蓝移，从而发生荧光分子颜色的改变，从而实现铁死亡的快速原位检测。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

1、可以实现活体组织原位检测。

2、检测快速，特异性高。

3、化学结构简单，易于制备。

4、相较于Simonneaux课题组报道的传统的化学小分子催化剂，酶催化具有更高的选择性及其更快速的催化速率，并且酶是细胞发生铁死亡时所特异性的高表达，因此铁死亡的细胞本身就可以作为一个特殊的反应器催化氧化芳基硫醚类荧光分子。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为实施例1制得的喹喔啉酮衍生物检测铁死亡的反应示意图；其中，图(a)为细胞内喹喔啉酮衍生物检测铁死亡的示意图，图(b)为喹喔啉酮衍生物检测铁死亡的化学反应式；

图2为实施例1制得的喹喔啉酮衍生物的NMR氢谱图；

图3为实施例1制得的喹喔啉酮衍生物的NMR碳谱图；

图4为宫颈癌细胞在不同条件下的激光共聚焦成像图；其中，图a为不同条件下宫颈癌细胞的荧光成像图，图b为不同条件下宫颈癌细胞内绿光与红光的比值图；

图5为荷瘤鼠在不同条件下的荧光成像图；

图6为实施例6制得的喹喔啉酮衍生物的NMR氢谱图；

图7为实施例6制得的喹喔啉酮衍生物的NMR碳谱图；

图8为实施例7制得的喹喔啉酮衍生物的NMR氢谱图；

图9为实施例7制得的喹喔啉酮衍生物的NMR碳谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变化和改进。这些都属于本发明的保护范围。

实施例1

本实施例涉及一种喹喔啉酮衍生物，其制备方法如下：

(1)4-甲氧基邻苯二胺(0.1mol,13.8g)分散于无水乙醇(150mL)中，冰浴下滴加丙酮酸乙酯(0.12mol,13.92g)，常温搅拌12h，反应液过滤，滤饼用无水乙醇洗涤，干燥得到白色粉末1a，(13.6g,产率86％)。

(2)1a(20mmol,3.2g),K₂CO₃(24mmol,3.31g)分散于丙酮中，而后搅拌下逐滴滴加溴乙酸甲酯(24mmol,3.67g).反应混合物在62℃下反应过夜，蒸干溶剂，残渣加入水和乙酸乙酯，分出乙酸乙酯相，硅胶柱分离(石油醚：乙酸乙酯＝10:1),纯化得到3.0g>

(3)将1b(2mmol,500mg)混悬于醋酸中，搅拌下滴加5-甲硫基噻吩-2-甲醛(3mmol,570mg)以及催化量的浓硫酸，50℃下反应8h,而后停止反应，加入乙酸乙酯和水，缓慢加入无水碳酸钾中和醋酸，分离出有机相，硅胶柱分离(乙酸乙酯:石油醚＝10:1)得到322mg红色固体QS-4,产率38％。

QS-4的制备流程如下所示：

图2和图3分别为QS-4的NMR氢谱图和NMR碳谱图。

¹H>3):δ＝8.22-8.25(m,1H),7.34-7.38(m,2H),7.11-7.14(m,2H),6.93-6.99(m,2H),5.05(s,2H),3.89(s,3H),3.78(s,3H),2.56(s,3H)ppm；

¹³C>3):δ＝168.1,156.4,154.5,152.3,143.3,134.4,131.5,130.5,121.5,119.2,114.1,111.0,55.9,53.1,43.7,20.9ppm.

实施例2

配置1mg/mL的QS-4的DMSO储备液，而后通过不同比例的DMSO/H₂O的混合溶剂将QS-4稀释成浓度为10μg/mL的溶液，通过Thermo>

实施例3

配置含1mg/mL的QS-4的DMSO储备液，常温避光保存。将人宫颈癌细胞HeLa细胞种于培养皿中，密度为10⁵/mL,待其贴壁后，加入Erastin继续培养24h,对照组细胞不做任何处理。而后加入探针QS-4,继续孵育30min后，通过激光共聚焦显微镜观察QS-4的变化。结果表明，HeLa细胞诱导铁死亡后，细胞发射出非常明显的绿光，而未经erastin处理的细胞，发射红色荧光。图1为探针QS-4检测铁死亡的反应示意图，由红色荧光转变为绿色荧光。图4为实施例3宫颈癌细胞在不同条件下的激光共聚焦成像图，其中，图a中第一行为宫颈癌细胞在正常培养条件下的荧光成像，中间行为铁死亡细胞的荧光成像，第三行为宫颈癌细胞诱导铁死亡之前加入了还原性谷光甘肽的荧光成像；图a中第一列为绿色荧光通道，第二列为红色荧光通道，第三列为绿色荧光和红色荧光叠加图，当QS-4与铁死亡的细胞孵育后，会在很短的时间内由红色荧光转变成绿色荧光。由图4中结果可知当细胞发生铁死亡后，QS-4的红色荧光会转变成绿色荧光，表明硫醚在铁死亡细胞内被氧化成了亚砜。但是QS-4在普通肿瘤细胞(不具有铁死亡细胞)中呈现出明亮的红色荧光，或者在清除掉活性氧铁死亡细胞中也呈现出明亮的红色荧光。该结果说明QS-4能特异性的区分出铁死亡细胞。

对本实施例所述的荧光探针进行正规动物实验，下列实验显示了探针QS-4在对诱导铁死亡后的荷瘤鼠进行原位活体成像实验。

6只荷瘤鼠随机分成2组，分别是对照组和诱导铁死亡组。对照组荷瘤鼠不做任何处理，铁死亡组荷瘤鼠首先尾静脉注射铁死亡诱导剂erastin(10mg/kg),每两天注射一次，连续注射两周，成像前，荷瘤鼠禁食禁水，通过瘤内注射我们的荧光探针(10mg/kg),半小时后进行小动物活体成像实验，分别采集510-550nm和595－650nm波段的荧光强度。其结果如图5所示，荷瘤鼠诱导铁死亡后，在510-550nm波段能够采集到显著的荧光信号，而正常的对照组其荧光信号基本都分布在595-650nm波段处。图5为实施例3荷瘤鼠在不同条件下的荧光成像,图5中第一行为正常的荷瘤鼠的活体成像，分别采集515-550nm以及595-650nm波段的光谱，第二行为诱导肿瘤铁死亡的荷瘤鼠的小动物活体成像，同样也是采集515-550nm以及595-650nm波段的光谱；由图5中结果可知荷瘤鼠被诱导铁死亡后，我们可以在515-550nm波段采集到大量的荧光信号，证实了QS-4可以实现体内细胞铁死亡过程的检测。

实施例4

配置含1mg/mL的QS-4的DMSO储备液。将人宫颈癌细胞HeLa细胞种于培养皿中，密度为10⁵/mL,待其贴壁后，加入不同浓度的Erastin(50nM,100nM,200nM,500nM,1μM,2μM)继续培养24h,对照组细胞不做任何处理。而后加入探针QS-4(10μM),继续孵育30min后，通过激光共聚焦显微镜观察QS-4的变化测定其检测限。结果表明，不同浓度铁死亡诱导剂(Erastin)处理后的绿色荧光和红色荧光的比值呈现出很好的线性，其最低检测限在200nM左右。

实施例5

采用实施例3相同的实验方法，我们对其它种类的细胞系，例如，人乳腺癌细胞系(MCF-7),人非小细胞肺癌细胞系(A549)等细胞系进行了激光共聚焦显微镜的观察测定，我们发现不同种类的细胞经过Erastin诱导铁死亡后，QS-4加入后均能被铁死亡细胞氧化，出现荧光的变化。结果表明我们的探针对铁死亡细胞具有很好的普适性。

通过以上实施例可以看出，本发明可用于快速特异性在细胞及动物活体层面检测铁死亡的发生。

实施例6

本实施例涉及一种喹喔啉酮衍生物，其制备方法如下：

(1)邻苯二胺(0.1mol,10.8g)分散于无水乙醇(150mL)中，冰浴下滴加丙酮酸乙酯(0.12mol,13.92g)，常温搅拌12h.反应液过滤，滤饼用无水乙醇洗涤，干燥得到白色粉末2a，(13.6g,产率86％)。

(2)2a(20mmol,3.2g),K₂CO₃(24mmol,3.31g)分散于丙酮中，而后搅拌下逐滴滴加溴丙烯(24mmol,2.87g).反应混合物在62℃下反应过夜，蒸干溶剂，残渣加入水和乙酸乙酯，分出乙酸乙酯相，硅胶柱分离(石油醚：乙酸乙酯＝10:1),纯化得到3.0g>

(3)将2b(2mmol,500mg)混悬于醋酸中，搅拌下滴加5-甲硫基噻吩-2-甲醛(3mmol,570mg)以及催化量的浓硫酸，50℃下反应8h,而后停止反应，加入乙酸乙酯和水，缓慢加入无水碳酸钾中和醋酸，分离出有机相，硅胶柱分离(乙酸乙酯:石油醚＝10:1)得到422mg红色固体QS-3,产率48％。

图6和图7分别为QS-3的NMR氢谱图和NMR碳谱图。

本实施例制得的QS-3作为探针同样可以快速特异性在细胞及动物活体层面检测铁死亡的发生，其相关实验结果与实施例2～5的结果基本相同。

实施例7

(1)4-甲氧基邻苯二胺(0.1mol,13.8g)分散于无水乙醇(150mL)中，冰浴下滴加丙酮酸乙酯(0.12mol,13.92g)，常温搅拌12h.反应液过滤，滤饼用无水乙醇洗涤，干燥得到白色粉末1a，(13.6g,产率86％)。

(2)1a(20mmol,3.2g),K₂CO₃(24mmol,3.31g)分散于丙酮中，而后搅拌下逐滴滴加溴丙烯(24mmol,2.87g).反应混合物在62℃下反应过夜，蒸干溶剂，残渣加入水和乙酸乙酯，分出乙酸乙酯相，硅胶柱分离(石油醚：乙酸乙酯＝10:1),纯化得到3.0g>

(3)将3b(2mmol,500mg)混悬于醋酸中，搅拌下滴加5-甲硫基噻吩-2-甲醛(3mmol,570mg)以及催化量的浓硫酸，50℃下反应8h,而后停止反应，加入乙酸乙酯和水，缓慢加入无水碳酸钾中和醋酸，分离出有机相，硅胶柱分离(乙酸乙酯:石油醚＝10:1)得到312mg红色固体QS-1,产率31％。

图8和图9分别为QS-1的NMR氢谱图和NMR碳谱图。

本实施例制得的QS-1作为探针同样可以快速特异性在细胞及动物活体层面检测铁死亡的发生，其相关实验结果与实施例2～5的结果基本相同。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。