一种反式-4-羟基-L-脯氨酸合成菌株及其L-脯氨酸羟化酶基因和应用

摘要

本发明提供了一种反式‑4‑羟基‑L‑脯氨酸合成菌株，所述菌株为蜡样芽孢杆菌（

说明书

技术领域

本发明属于微生物和基因工程技术领域，具体地说涉及一种反式-4-羟基-L-脯氨酸合成菌株及其L-脯氨酸羟化酶基因和应用。

背景技术

反式-4-羟基-L-脯氨酸（trans-4-Hydroxy-L-proline，trans-Hyp）为亚氨基酸，是L-脯氨酸>

反式-4-羟基-L-脯氨酸的生产方法主要有生物提取法和生物酶催化转化法。生物提取法主要以动物胶原蛋白为原料，通过强酸水解、亚硝酸氧化和离子交换树脂纯化等过程制备，此方法虽然技术成熟，但原料成本高，提取率低，“三废”排放量大、污染严重。生物酶催化法利用脯氨酸羟化酶的催化特性，以L-脯氨酸或葡萄糖为原料通过发酵转化得到反式-4-羟基-L-脯氨酸。生物转化法与生物提取法相比反应条件温和，能耗低，污染小。

目前，已有报道具有反式-4-羟基-L-脯氨酸合成功能的菌株，包括：螺旋聚孢属菌(Clonostachys>)，链霉菌 (Streptomycete)，灰略红链霉菌P-8648(Streptomyces>)，指孢囊菌(Dactylosporangium>RH1)。从指孢囊菌中分离得到的编码脯氨酸羟化酶 (P4Hs)的基因被广泛应用在大肠杆菌(Escherichia>)和谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium>)的基因工程菌的构建当中。例如专利文件（申请号201510899127.6）中公开了一种用于生产反式反式-4-羟基-L-脯氨酸的重组菌株，该菌株是由L-脯氨酸羟化酶基因（来源于指孢囊菌），野生型L-谷氨酸激酶基因、L-谷氨酞磷酸还原酶基因和抗性基因分别克隆到表达载体上，再利用RED重组技术将其整合到大肠杆菌基因组得到重组菌株。将该重组菌株应用于羟脯氨酸的发酵生产，经检测，发酵70h后，发酵液中羟脯氨酸的浓度为28.8g/L，L-脯氨酸的浓度为2.4g/L。由此可见，采用现有方法（真菌来源的编码脯氨酸羟化酶 (P4Hs)的基因及其重组菌株）生产效率较低，且L-脯氨酸的残留量偏高。目前尚未获得具有反式-4-羟基-L-脯氨酸生产能力的单纯细菌菌株及新型羟化酶基因的分离。

发明内容

本发明的目的就是提供一种具有反式-4-羟基-L-脯氨酸生产能力的单纯细菌株，以期现有方法所存在的问题。

本发明的目的之二在于提供一种源于上述菌株的、具有反式-4-羟基-L-脯氨酸生产能力的L-脯氨酸羟化酶基因，以进一步克服现有反式-4-羟基-L-脯氨酸生产方法效率低、合成产物中的L-脯氨酸残留量高等问题。

本发明的目的之三在于提供一种反式-4-羟基-L-脯氨酸合成菌株及其L-脯氨酸羟化酶基因的用途。

本发明的目的之一是通过以下技术方案实现的：一种反式-4-羟基-L-脯氨酸合成菌株，所述菌株为蜡样芽孢杆菌（Bacillus>）HBU-AI，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC>

本发明的HBU-AI菌株是由空气中获得的，其获取方法如下：

（1）配制50 g/L的L-脯氨酸标准水溶液，并在20℃~30℃条件下，于空气中开放放置一周。

（2）将溶液用无菌水梯度稀释至10^-7，选取稀释梯度为10^-3、10^-4、10^-5的稀释液100µL涂布到LB平板上，30>

（3）经观察不同稀释度下菌落形态相似，分别挑取单菌落于含有L-脯氨酸的LB液体培养基中，37 ℃，200 rpm培养，48 h后将发酵液于9000 r/min，离心2 min，分别获得相对应菌落的上清液。

（4）检测各个菌落的L-脯氨酸转化活性：

分别取相对应菌落的上清液50 μL加入到1.5 mL离心管内，向离心管内加入0.125mol/L四硼酸钠水溶液200 μL、纯水410 μL、乙腈320 μL，0.38 mol/L FMOC-Cl的乙腈溶液20 μL，置于涡旋混匀器震荡5 s后静置10 min，最后过0.45 μm微孔滤膜于RP-HPLC分析。

液相条件如下：色谱柱为Agilent Extend C-18（4.6 mm ×250 mm，5 μm，Agilent公司），流动相A为0.1% 三氟乙酸水溶液，流动相B为0.1% 三氟乙酸乙腈溶液，检测波长263nm，进样量5 μL；

梯度洗脱条件如下：0–5 min（30% B），5–8 min（30%–40% B），8–15 min（40% B），15–20min（40%-50% B），20–25 min （50% B），25–30 min（50%–90% B），30–38 min（90% B），38–41min（90%-30% B），41–45 min（30% B）。

（5）选取转化活性较高的菌株作为候选菌株并验证各菌株的转化活性，L-脯氨酸转化活性的检测方法同第（4）步，检测结果如表1所示。

表1：

结果表明：从空气中获得的3号菌株是一株能够高效转化L-脯氨酸为反式-4-羟基-L-脯氨酸的菌株，其转化效果如图1所示，该菌株转化3g/L的L-脯氨酸生成反式-4-羟基-L-脯氨酸的浓度为1.86 g/L，得到此菌株转化L-脯氨酸为反式-4-羟基-L-脯氨酸的转化率为62.0 %。

3号菌株的鉴定

对获得的具有羟化酶活性的单菌落进行菌体形态观察、生理生化分析，并对菌株进行16S rDNA序列分析。

菌株分类学特征分别为：

菌落直径2~3 毫米，白色菌落，较干燥，边缘不整齐，在LB液体培养基中培养时，菌体在光学显微镜下呈短小直杆；

利用API50 CH试剂盒检测时，菌株能利用D-核糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、N-乙酰-葡糖胺、水杨苷、麦芽糖、蔗糖、海藻糖、淀粉、糖原、七叶灵枸橼酸铁。

根据16 srDNA序列对上述筛选得到的菌株构建系统发育树，如图2所示，利用API50 CH试剂盒对上述菌株进行API检测，最终将该菌株鉴定为蜡样芽孢杆菌Bacillus>cereus，编号为HBU-AI。对该菌株进行保藏，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC>

一种来源于上述反式-4-羟基-L-脯氨酸合成菌株的L-脯氨酸羟化酶基因，所述L-脯氨酸羟化酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，命名为Bp4h。

一种含有上述L-脯氨酸羟化酶基因的重组载体。进一步地，所述重组载体为上述L-脯氨酸羟化酶基因、L-谷氨酸激酶基因以及L-谷氨酰磷酸还原酶基因共表达的重组载体；其中，L-谷氨酸激酶基因（ProB）和L-谷氨酰磷酸还原酶基因（ProA）均来源于大肠杆菌DH5a菌株。

一种由上述重组载体构建的工程大肠杆菌BL21（DE3）。

含有上述的L-脯氨酸羟化酶基因的工程菌的构建方法，包括以下步骤：

（1）L-脯氨酸羟化酶基因Bp4h的扩增：对L-脯氨酸羟化酶基因Bp4h序列设计引物对，F-Bp4h，如SEQ ID NO.2所示和R-Bp4h，如SEQ ID NO.3所示，采用PCR技术扩增得到Bp4h片段；

（2）L-谷氨酸激酶基因ProB和L-谷氨酰磷酸还原酶基因ProA基因的获得：以大肠杆菌DH5a菌株的基因组DNA为模板，以引物F-proB，SEQ ID NO.4所示和R-proA，如SEQ ID NO.5所示，采用PCR技术扩增得到proBA片段；

（3）重组菌株的构建：将Bp4h片段和proBA片段构建到表达载体pTRC99a中，得到pTRC99a-Bp4h-proBA重组载体，将重组载体转化到大肠杆菌BL21（DE3）菌株中，并诱导其表达。

一种上述的L-脯氨酸羟化酶基因在生产反式-4-羟基-L-脯氨酸中的应用。

本发明的有益效果在于：从空气中获得一株新型的具有合成反式-4-羟基-L-脯氨酸能力的细菌菌株，并得到该菌株的L-脯氨酸羟化酶基因序列，其与现有指孢囊菌（Dactylosporangium>

应用该L-脯氨酸羟化酶基因和L-脯氨酸生成基因（ProBA基因）共同构建双功能酶表达载体，并进一步构建了从葡萄糖一步高效转化为反式-4-羟基-L-脯氨酸的工程大肠杆菌。将该工程大肠杆菌应用于反式-4-羟基-L-脯氨酸的生产，与现有技术（发酵70h后，发酵液中羟脯氨酸的浓度为28.8g/L，L-脯氨酸的浓度为2.4g/L）相比，本发明生产效率显著提高，发酵52 h时，发酵液中羟脯氨酸浓度可达41.6 g/L，产物中L-脯氨酸的残留浓度为0.8g/L。

附图说明

图1 为验证本发明菌株HBU-AI转化活性时，发酵前后发酵培养基样品的色谱对比图；其中，a为 L-脯氨酸和反式-4-羟基-L-脯氨酸标准品色谱图；b为发酵前发酵培养基样品色谱图；c为发酵后发酵液样品色谱图。

图2 为本发明菌株HBU-AI的系统发育树。

图3为本发明基因工程菌发酵生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的转化动态图。

具体实施方式

下面通过实施例详细说明本发明，下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均

为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：

菌株HBU-AI基因文库构建及提取羟化酶基因

（1）提取蜡样芽孢杆菌HBU-AI的基因组DNA，采用Sau3AI 消化菌株HBU-AI的总DNA，其消化体系为：内切酶2 uL，DNA 1.5 uL，10 X Buffer 5 uL，总体积50 uL，其余dd H₂O补足，37>

（2）采用 BamHI消化载体pUC19相连接，其消化体系为：内切酶2 uL，DNA 1.5 uL，10 X Buffer 5 uL，总体积50 uL，其余dd H₂O补足，37>

（3）将消化得到的DNA片段与经消化的载体pUC19相连接，连接产物电转化受体菌E.coli DH5a，菌落涂布在含有氨苄青霉素的 LB 平板上，37 ℃倒置培养 16-20 h，将长出的单菌落接种到相应的含有3 g/L L-脯氨酸的 LB 液体培养基的96孔板中，于37 ℃培养24 h 后用氯胺T法对具有反式-4-羟基-L-脯氨酸转化活性的菌株进行检查。

（4）选取相应有反式-4-羟基-L-脯氨酸转化活性的菌株转接到5 mL LB（含50 mg/mL Amp）中，37 ℃，200 rpm培养过夜，取发酵液提取质粒，酶切验证，将质粒送去北京华大进行序列测定，所采用的方法为Sanger法测序。经序列Blast分析比对得到L-脯氨酸羟化酶基因（Bp4h基因）序列如SEQ ID NO.1所示。

（5）对上述L-脯氨酸羟化酶基因的活性进行验证：

对测序验证后的羟化酶基因设计引物对：F-Bp4h：ATGCTGACCCCGAC（SEQ ID NO.2所示），R-Bp4h：CTAGACGGGCTGGGCCAGCGCGAAG（SEQ ID NO.3所示）；扩增得到Bp4h片段。其中，PCR 反应体系为：10 X Buffer 5uL，dNTP 1uL，DNA模板 1uL，引物F 2uL，引物R 2uL，Taq酶0.5uL，ddH₂O>

将PMD19-Bp4h转入大肠杆菌DH5a菌株，筛选阳性转化子，测序验证无误后，提取质粒，用EcoRI和HindIII进行双酶切，回收的目的片段与同样双酶切的表达载体pTRC99a相连，其中，酶切体系为：质粒15uL，10 X M Buffer 5uL，EcoRI 2uL，HindIII 2uL，ddH₂O26uL，37℃酶切过夜；连接体系为：目的片段>

将pTRC99a-Bp4h转化至大肠杆菌BL21（DE3）中，经IPTG诱导后进行SDS-PAGE分析，并对菌体进行发酵实验，对其转化L-脯氨酸的活性进行HPLC分析（液相条件同实施例1）。

结果表明：按照文库构建方法共获得1000余个转化子，将所有转化子进行L-脯氨酸活性检测，最终发现一个转化子具有反式-4-羟基-L-脯氨酸转化活性，经测序分析，该羟化酶基因序列与指孢囊菌（Dactylosporangium>）p4h基因序列（GeneBank登录号：D78338.1）相似性只有84%。将测序验证后的羟化酶基因克隆到表达载体pTRC99a中，转化至大肠杆菌BL21（DE3），经SDS-PAGE分析在分子量为30 KDa左右有蛋白表达条带，经发酵L-脯氨酸活性验证，该羟化酶序列构建的重组大肠杆菌具有生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的能力。

实施例2L-脯氨酸羟化酶基因和ProBA基因共表达的工程大肠杆菌的构建

（1）ProBA基因的获得

以大肠杆菌DH5a菌株的基因组DNA为模板，以引物F-proB：TATGGTACCAACTGCCGCTAGGCTTGCTG（SEQ ID NO.4所示）和R-proA：GTAGGATCCCGTCAATGGCCTTGTGAATC（SEQ ID NO.5 所示）扩增得到proBA基因片段；将其与克隆载体PMD19相连，转化大肠杆菌DH5a菌株，筛选阳性转化子，测序用于验证序列的正确性。

（2）重组菌株构建

用前述的质粒PMD19-Bp4h为模板，分别用EcoRI和BamHI进行双酶切，回收目的片段；用EcoRI和BamHI对表达载体pTRC99a进行双酶切，使其线性化，回收目的片段；将上述两个片段用T4连接酶在16 ℃下连接1 h。连接产物转化大肠杆菌BL21菌株，筛选阳性转化子，得到pTRC99a-Bp4h（其他条件同实施例2）。

用类似实施例2的操作，以质粒PMD19-proBA为模板，分别用BamHI和HindIII进行双酶切，回收的目的片段；将pTRC99a-Bp4h用BamHI和HindIII进行双酶切，回收目的片段；将上述两个片段连接，连接产物转化大肠杆菌BL21菌株，筛选阳性转化子，得到重组菌株。

（3）对重组菌株由葡萄糖一步转化合成反式-4-羟基-L-脯氨酸的活性进行验证：

种子液制法：从-80℃冰箱拿出冻存的菌株的甘油管，在LB固体培养基上划线，37 ℃培养箱培养，挑取单菌落接入20 mL LB液体中，37 ℃培养，培养好的菌液作为种子液。

将摇瓶种子以1vol％的接种量转接至装液量为1.5 L的5 L发酵罐中，发酵培养基成分为：葡萄糖20.0 g/L、磷酸二钾3.0 g/L、氯化钠0.5 g/L、氯化铵1.0 g/L、硫酸亚铁0.3g/L、蛋白胨5.0 g/L、酵母提取物5.0 g/L、氨苄霉素0.1g/L。

设定发酵罐的培养温度为28℃，初始搅拌200 r/min，DO自控在10-30％（与转速关联），通气量 1.8 L/min；通过连续补加维持发酵罐中葡萄糖的浓度在20.0 g/L，发酵过程中每2h取样，测定其pH 值、菌体OD值、L-脯氨酸和羟脯氨酸的含量，菌体OD₆₀₀和细胞干重（CDW）的换算公式如下：OD₆₀₀>CDWL^-1。

结果表明：以大肠杆菌DH5a菌株的基因组DNA为模板扩增得到proBA基因，测序结果鉴定无误，该基因片段的大小为2358bp。将测序验证后的羟化酶基因和proBA基因分别通过酶切连接的方式连接到表达载体pTRC99a中，转化至大肠杆菌BL21（DE3）。经SDS-PAGE分析在分子量为30 KDa左右有羟化酶的蛋白条带；在分子量为40 KDa左右有L-谷氨酸激酶和L-谷氨酰胺磷酸脱氢酶的蛋白条带。

经5L发酵罐发酵葡萄糖活性验证，如图3所示，该羟化酶序列构建的重组大肠杆菌具有生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的能力，且在发酵52 h时，发酵液中羟脯氨酸浓度可达41.6 g/L，L-脯氨酸的残留浓度为0.8 g/L。由此可知，本发明L-脯氨酸羟化酶基因（核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示）相对于现有真菌来源的羟化酶基因（指孢囊菌羟化酶基因）在羟脯氨酸生产应用中具有突出的优势。

SEQUENCE LISTING

<110> 河北大学

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