用于生物纳米探针的SEM/ESEM阴极荧光成像方法

摘要

用于生物纳米探针的SEM/ESEM—阴极荧光成像方法属于阴极荧光成像技术领域，尤其涉及生物荧光成像技术领域，其特征在于，采用SEM/ESEM和CL组成的联机系统，包括量子点和纳米颗粒在内的纳米探针，选择包括玻璃、导电玻璃、SiO2‑Au‑Si复合膜、Si、SiO2、碳基薄膜在内的任何一种衬底，以SEM外接模式、配以阴极荧光谱的CL全光模式，得到CL像和相对应的SE或TE电子像，以及CL像和电子像的合成像，以SEM快速扫描模式、配以阴极荧光谱的CL单光模式，得到单细胞的CL谱，或单一波长的CL单光像和各电子像，从而得到了由纳米颗粒/量子点探针特异性标识的单细胞和单分子的高分辨光子像和对应的电子像，可以在室温～‑180℃下低温成像，还可以与具有不同发光特性的荧光分子/荧光蛋白探针匹配，并减少高能电子束对生物样品的辐照损伤。

说明书

技术领域

本发明属于阴极荧光成像技术领域，尤其涉及生物荧光成像技术领域，采用扫描电子显微镜SEM和阴极荧光谱仪CL联机系统，接收电子束激发产生的荧光信号，以及二次电子、背散射电子和透射电子信号，获得由纳米颗粒或半导体量子点探针特异性标记的高分辨和高灵敏度的阴极荧光CL像和对应的电子像，以及单细胞发出的紫外-可见光-红外波段的CL谱，采用电子像和光子像的合成像，以及改变细胞样品衬底的方法，获得衬度增强的CL像，以十几纳米的分辨率显示单个蛋白等单分子在单细胞表面和内部的位置和分布。此方法适用于各类由高分辨场发射扫描电镜/环境扫描电镜和高灵敏阴极荧光谱仪构成的观测系统，纳米颗粒、量子点、荧光染料分子和荧光蛋白等荧光探针标记的生物组织结构，以及半导体、纳米材料、矿物、无机、有机物等各类纳米-微米尺度的发光材料。

背景技术

扫描电子显微镜SEM，简称SEM，以下同，是以高能电子束为激发源，对各种固体材料，包括生物样品进行高分辨成像的设备。SEM与阴极荧光谱仪CL，简称CL，以下同，构成的观测系统SEM-CL，可获得发光材料的光子像和对应的电子像。因此，CL谱仪技术在多种学科和工程技术领域已到广泛应用，并具有潜在的应用前景。目前，CL技术多用于地质矿物、半导体和IT产业、纳米科技、光电子器件、生物药物等学科和技术领域。随着电子显微镜技术的快速发展，由高分辨扫描电镜和高精度阴极荧光谱仪构成的SEM-CL系统，有望在细胞生物学领域得到应用，例如获得以生物纳米探针特异性标定的细胞组织的高分辨荧光像和对应的电子像。

在SEM中，高能入射电子与固体样品相互作用，会从样品中激发产生多种信号，主要包括二次电子SE、背散射电子BSE、吸收电子AE、透射电子TE、阴极荧光CL、特征-X射线、电子束感生电流EBIC等(图2)。其中二次电子SE的作用深度最浅，约10nm，形成高分辨像。上述信号形成的电子像，如SE像、BSE像、TE像，以及光子CL像和X-射线元素分布像在材料科学和生命科学领域已得广泛和深入的研究和应用。

生物荧光成像技术是细胞免疫学、分子生物学、分子遗传学、肿瘤学、病理学等生物医药学科普遍采用的可视化研究手段，在疾病诊断、临床检验和治疗、药物研发等方面发挥着重要作用。目前用于生物荧光成像的主要仪器是以光作为激发源的光学显微镜，包括荧光显微镜(FM)，激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)，以及最新发展的超高分辨光学显微镜(如，STORM等)。根据Abbe成像原理，普通光学显微镜受到光衍射极限的限制，只能达到亚微米级(～200nm)的分辨率。超高分辨光学显微镜利用受激辐射耗尽和单分子定位重构等技术，突破了光学衍射极限，达到数十纳米的分辨率(～20nm)。因此，2014年的诺贝尔化学奖颁发给了此项发明的Eric Betzig，Stefan W.Hell，和William E.Moemer三位科学家。在此之前的2008年，诺贝尔化学奖颁给了Osamu，Shimomura，Martin Chalfie，和Roger Y.Tsien(钱永健)等科学家，表彰他们发现和发展了用于活细胞荧光成像的绿色荧光蛋白(GFP，EGFP)。这些先进的生物荧光可视化技术极大推动了生物医药学的发展，为医药学研究做出了突出贡献。

目前，以光子(包括可见光、紫外光、激光、X-射线等)为激发源的光学显微镜(OM)和生物荧光显微镜(FM)难以显示单分子(蛋白、核酸等)、细胞亚结构(细胞核，细胞器等)的显微特征和分布，不能识别由量子点和纳米颗粒特异性转导的单分子、膜蛋白、基因等十几纳米尺度的细胞结构和纳米药物，也难以获得单细胞的荧光谱信息。

近些年来，电子显微镜和光学显微镜的关联技术(Correlative light-electronmicroscopy，CLEM)得到了快速发展，它结合了电子显微镜的高分辨像和荧光显微镜FM的特异性荧光像。CLEM关联系统中的场发射扫描电镜SEM/环境扫描电镜ESEM的分辨率已达到0.6nm，场发射透射电镜TEM的分辨率已达到0.1nm，球差校正透射电镜Cs-TEM的分辨率已达到0.08nm。与此相比，CLEM中的FM-荧光像的分辨率则低得多，通常仅为～200nm，难以与电子显微镜相匹配，因此，多用于为电子显微镜寻找和确定感兴趣观察区。

阴极荧光谱仪CL是配置在TEM、SEM及电子探针中，以高能电子束为激发源的观测设备。因此，CL-荧光像的分辨率明显高于FM-荧光像。场发射SEM/ESEM中配置的高灵敏和高精度的阴极荧光谱仪，其CL像可达到十几纳米的分辨率，CL谱的测试精度可达到0.05nm。因此，SEM/ESEM-CL系统在研究纳米颗粒和量子点特异性标识的生物超微结构方面具有明显优势。TEM-CL系统中的CL像分辨率可达到1nm，但它刚进入国内外市场，价格昂贵，尚未被普遍接受。CL成像技术也存在一些问题，如在高真空环境和高能电子辐照下，会使生物样品脱水、变形、细胞组织损坏和凋亡、荧光蛋白和染料分子产生荧光淬灭、存在背底反射光等问题。此外，高能电子激发产生的荧光量子效率较低。

发明内容

本发明的目的在于，采用高分辨场发射扫描电镜SEM和环境扫描电镜ESEM配置的高灵敏阴极荧光谱仪CL(SEM/ESEM-CL)，原位收集从样品，特别是从细胞等生物样品中发射出的阴极荧光CL信号和电子信号，电子信号包括从样品表面反射出来的二次电子SE和背散射电子BSE，以及穿透薄样品的透射电子TE(图2)，获得由纳米颗粒/量子点探针特异性标识的单细胞、单分子、单一膜蛋白的高分辨光子像和对应的电子像、由有机荧光基团/染料分子探针等转染的细胞组织的高分辨荧光像和对应的电子像、获得光子和电子的合成像，以及从单细胞中发出的紫外-可见光-红外波段的CL荧光谱。通过采用不同类型的生物探针，选择不同的孵育固定细胞的衬底材料，包括玻璃、氧化铟锡ITO导电玻璃、SiO₂-Au-Si复合膜、单晶Si、SiO₂、碳和石墨烯等碳基薄膜，以及优选SEM/ESEM的工作参数等方法，提高荧光量子效率，获得荧光增强的CL像和CL谱，降低有机分子的荧光淬灭现象，并减少电子束对生物样品的辐照损伤。

此方法适用于各种场发射扫描电镜SEM和环境扫描电镜ESEM，及高敏感阴极荧光谱仪CL，由纳米颗粒、量子点、荧光分子和荧光蛋白等构成的生物探针和混合探针，以及生物样品、药物、半导体、有机、无机、氧化物、矿物、碳和石墨烯等发光材料和发光器件。

本发明的特征在于，是在一个用于生物纳米探针的阴极荧光成像系统，以下简称系统中，依次按以下步骤实现的：

步骤(1)，构建系统，是一个扫描电子显微镜SEM/环境扫描电镜ESEM和一个阴极荧光谱仪CL组成的联机系统，符号“/”表示“或者”；

系统中的扫描电镜SEM/环境扫描电镜ESEM主要包括：电子枪1、三级电磁透镜2、SEM电子束控制单元、SEM样品室、电子探测器控制单元、样品台控制单元，及SEM主机。系统中的阴极荧光谱仪CL主要包括：CL接收镜11、分光光谱仪、图像扫描控制器，及CL主机；

所述SEM样品室包括：设在SEM样品室底座12上的环形透射电子TE探测器TED6、位于所述环形透射电子TE探测器TED6上端面上方的TE样品台5、底部固定在底座上面、横臂位于所述TE样品台5上方的呈“T”字形的SEM样品台7、依次叠压在所述SEM样品台7横臂上端面的SEM样品托8、样品衬底9和样品10，一个一端悬臂式伸入到所述SEM样品室右侧面上的阴极荧光CL接收镜11，一个位于SEM样品台7左侧面上的高真空二次电子SE探测器ETD4，以及一个低真空二次电子SE探测器LFD3；

所述样品台控制单元用于通过控制所述SEM样品台7和TE样品台5的升降和水平移动来调整入射电子束与样品观测点之间的相对位置；

所述SEM电子束控制单元用于控制入射电子束在SEM样品10表面或TE样品台5上的样品上逐点扫描；

所述电子探测器控制单元的三个输入端分别与所述高真空二次电子SE探测器ETD4、低真空二次电子SE探测器LFD3，以及透射电子TE探测器TED6的输出端相连；

所述SEM主机的一个输入端与所述电子探测器控制单元的输出端相连，而所述SEM主机的另外二个输出端分别与所述SEM电子束控制单元的输入端和SEM显示器的输入端相连；

所述分光光谱仪与阴极荧光CL接收镜(11)的输出端相连，接收CL光子信号并在单光模式下进行分光，或在全光模式下让光子通过分光光谱仪而不分光，然后将CL信号输入到CL探测器控制单元；

所述CL探测器控制单元，包括一个高灵敏光电倍增管PMT探测器、快速CCD探测器和高灵敏InGaAs红外探测器，分别依次接收和放大分光光谱仪输出的紫外-可见光-红外波段的CL光子，并把光子信号输入到CL谱仪的图像扫描控制器；

所述图像扫描控制器在输入CL信号的同时从所述电子探测器控制单元接收包括二次电子SE和透射电子TE在内的电子信号，然后在CL显示器上同时显示全光或单光CL像和对应的电子像，或显示CL谱，并将CL像和对应的电子像合成，形成光子和电子的合成像；

步骤(2)，按以下步骤制备样品，所述样品是指：把生物纳米探针或荧光分子探针通过链霉素亲和生物素作用，利用中间分子与细胞上的特定分子偶联，得到特异性标记的单细胞、细胞亚结构及单分子生物样品，以实现在单细胞和单分子水平上的荧光成像，所述纳米探针，至少包括纳米颗粒、量子点、核-壳结构的量子点中的任意一种，所述荧光分子探针至少包括荧光蛋白和荧光染料分子中的任意一种，所述介导探针与特定分子结合的中间分子至少包括核酸适配体分子、抗体分子、多肽分子、小分子化合物中的任何一种，所述标记的特定单分子至少包括细胞蛋白分子、核糖核酸RNA中的任何一种分子；

步骤(2.1)，把所述细胞样品10孵育固定在一个样品衬底9上，所述衬底9是玻璃、氧化铟锡ITO导电玻璃、SiO2-Au-Si复合膜，单晶Si、SiO2、碳或石墨烯等碳质薄膜中的任何一种；

步骤(2.2)，用上述方法制备的生物纳米探针对固定好的细胞样品进行特异性标定，或用荧光蛋白和荧光染料分子探针中的一种探针对细胞进行转染表达，除去未结合的非特异性探针，得到特异性探针标记后形成的生物探针和探针复合体，包括如下几种：

·蛋白质—核酸适配体—生物素—链霉亲和素—纳米探针

·蛋白质—核酸适配体—荧光分子探针

·蛋白质—抗体—纳米单针/荧光分子探针

·蛋白质—抗体—生物素—链霉亲和素—纳米探针和荧光分子探针

·特定蛋白质—荧光蛋白，形成融合蛋白

·核荧光染料分子

步骤(3)，把经过步骤(2)处理的样品10放在SEM样品托8上固定粘贴，把所述SEM样品托(8)安装在所述SEM样品室的所述SEM样品台7上，并使入射电子扫描成像区正对着垂直入射电子束的方向，

步骤(4)，把所述分光光谱仪先分别与所述CL探测器控制单元的光电倍增管PMT探测器、快速CCD探测器和InGaAs红外探测器连接后，再分别连接到与所述图像扫描控制器，所述图像扫描控制器与CL主机连接，收集所述SEM样品10或TE样品发射出的光子和电子信号，在CL显示器上同时显示CL像和相对应的二次电子SE像或透射电子TE像，以及光子和电子的合成像，或显示CL谱；

步骤(5)，对所述扫描电镜SEM样品室抽真空达到设定的真空度，包括达到高真空度﹤10-3Pa或低真空度0.1torr～1torr；

步骤(6)，给所述扫描电镜SEM的电子枪1施加1kV～30kV的加速电压，10^-8A～10^-9A的入射电流，调整到5mm～13mm的样品工作距离，×30～×200000的放大倍率，所述入射电子束经过三级电磁透镜2聚焦后由所述SEM电子束控制单元控制所述入射电子束在所述SEM样品10上逐点扫描，此时，入射电流为10^-8A～10^-9A，入射束束斑尺寸为No.1～No.7中的任何一种，物镜光阑孔径为100μm、>100μm、100μm、50μm、40μm、30μm、20μm中的任何一种孔径，相应物镜光阑为No.1～No.7中的任何一种，按需要选择物镜光阑；

步骤(7)，设定二种工作模式，在全光模式下，收集记录和显示CL全光像，以及相对应的包括高、低真空中的SE像和TE像在内的任何一种，在单光模式下，收集记录和显示某一波长的CL单光像和对应的各电子像，或CL谱，CL谱仪的高灵敏光电倍增管PMT探测器的电压小于1500V，分光光谱仪的衍射光栅为300l/mm或1200l/mm，狭缝宽度范围为1mm～10mm，二种工作模式的步骤如下：

若：为了得到所述的CL全光像和对应的各电子像，以及光子-电子合成像，执行步骤(7.1.1)；

若：为了得到某一波长的CL单光像和对应的各电子像，或CL谱，执行步骤(7.2.1)；

步骤(7.1.1)，把所述扫描电镜SEM的扫描方式设为外接方式，所述分光光谱仪设为全光模式，

步骤(7.1.2)，SEM采用所述高真空二次电子SE探测器ETD(4)，在高真空中收集二次电子SE，或采用所述低真空二次电子SE探测器LFS(3)，在低真空中收集二次电子SE，或采用所述透射电子TE探测器TED(6)收集透射电子TE；

步骤(7.2.1)，把所述扫描电镜SEM的扫描方式设为快速扫描模式，所述分光光谱仪设为单光模式，收集和记录某一波长的CL单光像和对应的所述电子像，或CL谱，并把CL单光像和对应的电子像进行合成；

步骤(8)，按以下步骤进行低温成像并收集CL谱，以获得CL像和对应的所述电子像：

步骤(8.1)，开启所述阴极荧光谱仪CL的样品制冷装置，设置温度范围为室温～-180℃；

步骤(8.2)，重复步骤(6)和(7)，获得二种工作模式下的图像和CL谱。

本发明的效果如下：

1、以高能电子束为激发源的阴极荧光CL像的分辨率明显高于以光为激发源的普通荧光显微镜FM的荧光像。CL-荧光像可识别由量子点和纳米颗粒探针标定的单细胞、单一蛋白等细胞超微结构，使生物荧光像进入到单分子水平，而FM-荧光像则不能识别单个纳米颗粒和量子点，以及由纳米探针标定的细胞超微结构。

2、纳米颗粒(Au、碳、TiO₂等)、量子点QDs(CdSe，CdS，CdTe，ZnS，碳，石墨烯、Fe₃O₄等)及核-壳结构的量子点(ZnS/CdSe，CdS/Ag₂S，CdS/ZnS，CdS/Cd(OH)₂，ZnSe/CdSe，CdS/HgS，CdS/PbS等)是新型的生物纳米探针。QDs或纳米颗粒与不同的有机分子(蛋白质、抗体、核酸、链霉亲和素等)偶联，可特异性标记蛋白质、核酸等单分子，进而识别靶向分子/蛋白的位置和分布，研究细胞的信号转导，胞内组分移动等问题。对半导体QDs的理论研究表明，与有机荧光分子/蛋白比较，QDs具有荧光量子产率高、发光峰窄、发光强度和波段/颜色可通过改变量子点的尺寸来调制、荧光穿透深度较深、非特异性吸收少、光化学稳定性高等优良的光学性能，并与生物组织有很好的生物相容性。

3、扫描电镜SEM/环境扫描电镜ESEM与阴极荧光谱仪CL的联机系统(SEM/ESEM-CL)有如下特点：

(1)可同时获得高分辨电子像和高分辨荧光像，以及电子-光子的合成像。

(2)入射电子束能量和辐照剂量可调，因此可方便地与具有不同发光特性的荧光探针，包括纳米颗粒、半导体量子点、荧光分子和荧光蛋白在内的任何一种相匹配，以减少高能电子对生物样品的辐照损伤，降低荧光淬灭及碳污染现象。

(3)CL谱仪有多种探测模式，并涵盖了生物荧光探针的所有发光波段，获得紫外光—可见光—红外光波段的荧光像，以及细胞群和单细胞的CL谱。

(4)环境扫描电镜(ESEM)可选择不同的真空模式及相应的探测方式，以适应对导体、半导体、绝缘体及含水样品(如生物细胞)的观测。高真空模式(<10^-3Pa)配合二次电子探测器ETD或背散射电子探测器BSED，可获得高分辨形貌像；扫描透射模式(STEM)配合透射电子探测器(TED)可提高图像分辨率；低真空模式(0.1torr～1torr)配合大视场二次电子探测器(LFS)，可减小或消除不导电样品的荷电效应；环境真空模式(1torr～20torr)配合气体放大的二次电子探测器(GSED)，可实现在水湿环境中的观测。

4、选择不同类型的固定细胞样品的衬底材料，包括玻璃、ITO导电玻璃、SiO₂-Au-Si复合膜、单晶Si、SiO₂、碳基薄膜，以增强荧光强度和变化幅度。

5、光学荧光显微镜FM-荧光像中常用的荧光基团和染料分子探针等，原则上都可以在阴极荧光CL谱仪中使用。

附图说明：

图1.本发明的流程框图。

图2.入射电子与固体样品相互作用产生的信号类型示意图。

图3.扫描电镜SEM和阴极荧光谱仪CL联机系统的工作原理示意图。图中：1－电子枪；2－三级电磁透镜；3－低真空二次电子SE探测器LFS；4－高真空SE探测器ETD；5—TE样品台；6—透射电子TE探测器TED；7—SEM样品台；8—SEM样品托：9—样品衬底；10—SEM样品；11－CL接收镜；12—SEM样品室底座。

图4.ZnS/CdSe量子点QDs的阴极荧光观测。

(a)阴极荧光CL谱。

(b)阴极荧光CL像。

样品衬底是ITO导电玻璃，放大倍率×600，加速电压15kV，物镜光阑No.5，束斑尺寸No.5.0(～2×10^-9A)，PMT探测器电压：1400V(CL成像)和1044V(CL谱)。

从图4可见，ZnS/CdSe核-壳结构量子点QDs在电子束辐照下，产生很强的荧光量子效率，CL峰强度很高，CL发光谱在可见光范围。ZnS/CdSe半导体QDs探针比有机染料或蛋白类探针有更强和更稳定的发光特性，在较高能量电子束(15kV)辐照下，QDs荧光探针没有出现电子束辐照损伤现象。

图5.由Au纳米探针标记的三阴性乳腺癌细胞MB-231的表皮生长因子受体EGFR蛋白(HER1)和酪氨酸蛋白激酶受体c-MET蛋白的CL-荧光像和FM-荧光像。

(a)一个纳米Au颗粒特异性标记一个膜蛋白分子HER1的制备过程示意图(彩图)。

(i)一个10nm-Au纳米颗粒(绿色)与链霉亲和素Streptavidin(红色)偶联，构成一个链霉亲和素-Au纳米探针；

(ii)核酸适配体Aptamer tutu 22(绿色-紫色螺旋)与生物素Biotin(黄色)偶联；

(iii)一个膜蛋白分子HER1(蓝色)；

(iv)一个HER1—核酸适配体-生物素—链霉亲和素-Au构成的复合体，其中，金颗粒上偶联的链霉亲和素与核酸适配体上的生物素特异性结合，从而实现了用一个10nm-Au颗粒特异性标记一个HER1分子。

同理：将30nm-Au颗粒代替10nm-Au颗粒，将Aptamer CLN-64代替Aptamer tutu22，将膜蛋白分子c-MET代替膜蛋白分子HER1，从而实现了用一个30nm-Au颗粒特异性标记一个c-MET(图中未画出)。

(b)和(c)一个MB231癌细胞表面(局部)的高倍SE像和阴荧光CL像。衬底为ITO导电玻璃。放大倍率×150000，加速电压15kV，1×10^-9A；物镜光阑No.5，束斑尺寸No.5.0(～2×10^-9A)，PMT探测器电压：1400V。

(d)SE像和CL像的合成像(彩图)。

从图5(b)的SE像清晰地看出，细胞表面分布着大量15nm和30nm的Au颗粒，纳米Au颗粒的电子致密核心呈现出明亮的衬度。根据上述样品制备原理可知，SE像中呈现出的是与15nm-Au颗粒标记的HER1和与30nm-Au颗粒标记的c-MET。这些膜蛋白分子HER1和c-MET分布在细胞表面，呈现出不同的组合形态，包括单体、二聚体、三聚体、多聚体，以及同源二聚体、异源二聚体和同源/异源多聚体。

从图5(c)CL像看出，细胞表面呈现出均匀的亮衬度，为ITO半导体衬底发出的弱荧光，CL谱仪已探测不到ITO衬底的荧光；而细胞表面分布的Au纳米颗粒则呈现出暗衬度，表明Au纳米颗粒为不发光物质。此外，从Au纳米颗粒的SE像(亮衬度)和CL像(暗衬度)中，可以分辨出10nm和30nm的金颗粒，表明SE像和CL像均达到～10nm的空间分辨率。由此可知，由电子和光子的相互对应的图像可以显示Au纳米颗粒偶联的乳腺癌细胞表面的单一膜蛋白分子的位置、分布、聚合态及数量等多种信息。

从图5(c)的SE和CL的合成像看出，合成像使Au颗粒的衬度和分辨率得到进一步增强，更清晰地显示出细胞表面15nm-Au和30nm Au颗粒的轮廓。这是由于在电子-光子的合成像中，包含有二次电子SE和背散射电子BSE信号提供的形貌衬度和成分衬度信息，以及光子信号提供的物理(发光)衬度信息。这为计算和统计同源/异源二聚体膜蛋白的比例、间距及分布提供了更准确的定位数据。

高分辨和高放大倍率的膜蛋白分子的电子像和光子像为研究膜蛋白分子HER1的分布、功能，及参与的信号通路，以及研究开发HER1高表达的肿瘤治疗药物提供了高分辨分子水平的可视化的新研究方法。

图6.由增强绿色荧光蛋白EGFP转染的食管癌细胞EC-109的CL-荧光像和荧光显微镜的FM-荧光像。衬底为ITO导电玻璃。

(a)CE-109细胞的FM-荧光像(彩图)，放大倍率：×500。

(b)-(c)SE像和CL像(彩图)，放大倍率：×500，加速电压：5kV，物镜光阑No.5，束班尺寸4.5(～1×10^-9A)，PMT探测器电压：800V。

(d)-(f)SE像和CL像，放大倍率：×5000，加速电压：4kV，物镜光阑No.5，束班尺寸4.5(～1×10^-9A)，PMT探测器电压：1450V。

增强绿色荧光探针EGFP在电子束辐照下，发光较强，转染率较高，只对细胞浆染色，而不染细胞核。从(a)看出，FM-荧光像的分辨率和放大倍率低，因此不能分辨转染EC-109细胞内的细胞浆和细胞核。CL-荧光像分辨率高，(b)-(f)的低倍像(b)和高倍像(c)-(f)都能清楚地分辨有荧光蛋白的细胞浆和无荧光蛋白的细胞核。

由图6(f)还可以看出，电子束辐照对有机荧光蛋白探针有较强的淬灭作用。细胞被电子束辐照2～3分钟后，电子束聚焦区域(细胞左上角)的荧光衬度明显变暗，图像变模糊，难以分辨出染色细胞浆和未染色的细胞核。

图7.由增强绿色荧光蛋白(EGFP)转染的癌细胞EC-109的SE像、CL像和CL谱。衬底为ITO导电玻璃。

(a)和(b)：放大倍率：×4000，加速电压：2.5kV，物镜光阑：No.5，束班尺寸：4.5(1×10^-9A)，PMT探测器电压：1450V。

(c)和(d)：放大倍率×4000，加速电压：2.5kV，物镜光阑No.5，束班尺寸4.5(～1×10^-9A)，PMT探测器电压：1450V。

对比图7和图6可知，降低加速电压到2.5kV后，CL像中已没有明显的荧光淬灭现象，CL像衬度进一步增强，可清楚地观察到表达EGFP绿色荧光蛋白的细胞核分裂(a)-(b)。这为研究基因转染效果和细胞的动态活动提供了亚结构信息。

图8.由增强绿色荧光蛋白EGFP转染的癌细胞CE-109的SE像、CL像和CL谱，衬底为SiO₂-Au-Si复合膜。

(a)SE形貌像。

(b)CL荧光像。

(c)从单细胞上收集的CL谱，谱收集参数同(a)和(b)。

CL像和CL谱工作参数：放大倍率：×3000，加速电压：4kV，物镜光阑No.5，束班尺寸5.0(～2×10^-9A)，PMT探测器电压：1392V。

CL像(b)清晰地显示，孵育固定在SiO₂-Au-Si复合膜衬底上的细胞上的荧光强度分布不均匀的信息。CL谱(c)表明，可以探测到从单个细胞中发出的400nm～500nm的绿色荧光谱，而孵育固定在ITO导电玻璃上的EGFP转染的CE-109细胞则探测不到CL谱(见图6和7)。

SiO₂-Au-Si多层膜结构增强荧光量子效率是基于在纳米介质层-金属层-半导体复合结构中产生的表面等离子极化共振(SPP)效应。SiO₂-Au-Si多层膜即为这种介质层-金属层-半导体衬底的复合结构，其中，50nm～60nm厚的Au膜沉积在单晶Si衬底上，在Au膜上再沉积一层5nm～20nm厚的SiO₂介质层。入射电子辐照SPP-Au复合膜，产生的电磁波在该结构中沿金属-介质层的界面传播产生SPP效应，使与复合膜相连的荧光蛋白产生共振能量转移，改变受体(如细胞和纳米材料)的荧光强度，使细胞表面荧光的变化幅度增强，从而显示出细胞表面荧光分布不均匀的信息。

图9.由增强绿色荧光蛋白EGFP转染的癌细胞EC-109的SE像和CL，衬底为单晶Si。

(a)和(b)：放大倍率：×5000，加速电压：4kV，物镜光阑No.5，束班尺寸No.5.0(2×10^-9A)，PMT探测器电压：1392V。

以单晶Si为衬底的EC-109细胞的CL衬度明显减弱，与ITO衬底(图6和7)和SiO-AuSi复合膜衬底(图9)相比，图9(b)的CL像中的绿色荧光染色的细胞浆荧光衬度已明显减弱，也不能测出单细胞的CL谱。

图10.由4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)核酸荧光染料染色的癌细胞EC-109的SE像(a)和CL像(b)。衬底为ITO导电玻璃。放大倍率：×10000，加速电压：5kV，物镜光阑No.5，束班尺寸No.4.0(1×10^-9A)，PMT探测器电压：1398V。

DAPI蓝色荧光探针只对细胞核染色，在电子束辐照下，发光较强，转染率较高。高倍CL-荧光像(×10000)清楚显示出细胞核中发出的强荧光，以及荧光分布不均匀的信息。FM-荧光像则不能分辨出被DAPI荧光探针转染的细胞核。

图11.红色荧光探针Cy5标记的三阴性乳腺癌细胞(MB-231)膜上的HER1蛋白的SE成像(a)和CL成像(b)。衬底为SiO₂。放大倍率：×1000，加速电压：5kV，物镜光阑：No.5，束班尺寸No.5.0(2×10^-9A)，PMT探测器电压：1308V。

CL-荧光像清楚地显示出，MB-231癌细胞边缘的荧光衬度明显增强。此样品是用可特异性识别细胞表面HER1蛋白分子的核酸适配体标记上荧光探针Cy5构成的探针复合体，再用探针复合体孵育结合MB-231，对HER1蛋白标记了荧光探针。标记的细胞边缘形成的明亮荧光衬度，间接证明了该肿瘤细胞的表皮生长因子受体EGFR蛋白(HER1)在细胞膜上的高表达。

本发明的效果在于，

1.采用SEM-CL观测系统(图3)和实施步骤(图1)，观测由生物探针(包括纳米探针和荧光蛋白/荧光分子探针)标记的细胞、细胞器、细胞亚结构、单分子等超微生物结构的特异性荧光特征。

2.细胞等生物样品的阴极荧光CL像和对应的电子像(包括二次电子SE像和透射电子TE像)具有十几纳米～亚微米的分辨率，×30～×200000的放大倍率，以高分辨率和高放大倍率显示出特异性标定目标的特征信息，并将电子像和荧光CL像合成，使合成像中包含有形貌衬度、化学成分衬度和物理(光学)衬度信息，提高了图像分辨率和像衬度。

3.选择不同的衬底孵育固定细胞，获得荧光量子效率高、衬度增强的标记细胞、细胞亚结构、单一蛋白等分子等结构的CL像。衬底材料包括：

(1)ITO导电玻璃衬底：减小和消除非导电的细胞等样品的荷电现象，实现高真空下的单细胞和细胞亚结构成像，提高电子像的分辨率和衬度。

(2)SiO₂-Au-Si复合膜衬底：利用介质薄膜与金属薄膜之间，在电子束辐照下，由电子-光子耦合作用产生的表面等离子共振SPP效应，使带电荷的有机分子在细胞膜中移动，导致相连的荧光蛋白产生荧光共振能量转移，增强或改变细胞受体的荧光量子效率，以显示膜蛋白和细胞内荧光分子的位置、变化幅度和分布不均匀等信息。

(3)SiO₂衬底：得到细胞膜增强的CL像。

4.选择扫描透射方式，收集透射电子TE成像，提高电子像的分辨率。

5.采用低真空模式，减小和消除非导电样品，如细胞样品的荷电效应。

6.调整扫描电镜SEM、环境扫描电镜ESEM和阴极荧光谱仪CL的工作参数，包括采用较低的入射电子加速电压：1kV～15kV；较高的入射电流：～10^-9A，较高的光电倍增管PMT探测器电压：1000V～1450V，窄的衍射光栅1200l/mm，小的狭缝宽度：3mm～5mm，获得高分辨电子像和阴极荧光CL像，以及单细胞的紫外-可见光-红外波段的CL谱。

阴极荧光成像是一种高分辨和高放大倍率的特异性荧光成像技术，适用于各类场发射扫描电镜配置与高灵敏的阴极荧光谱仪，对由生物纳米探针、荧光蛋白/荧光染料分子探针特异性标记的单细胞、单分子和单一蛋白等细胞超微结构的表征、功能解析、病理变化、药物反应，及互作机理等提供了一种分子水平的观测方法，为单细胞、细胞亚结构、单一蛋白等生物超微结构的识别、定位、分布及下游基因调控等功能研究提供了高分辨可视化数据。

阴极荧光谱技术适于多种类型的发光材料，特别是生物纳米探针和有机荧光分子/荧光蛋白探针标定的细胞和单分子等生物超微结构、纳米药物等，以及其它具有纳米～微米尺度的发光材料，包括半导体和金属纳米结构、地质矿物、有机物、无机物、氧化物，及半导体和光电子器件等。