基于氧化透明质酸-II型胶原和自体浓缩骨髓有核细胞的关节软骨修复材料及制备方法

摘要

本发明涉及一种基于氧化透明质酸‑II型胶原和自体浓缩骨髓有核细胞的关节软骨修复材料及制备方法，由氧化透明质酸、II型胶原蛋白和自体浓缩骨髓有核细胞制成，材料中的自体浓缩骨髓有核细胞具有自我更新及成软骨分化潜能，参与软骨缺损修复，因此具有很好的软骨损伤修复效果，修复组织呈透明软骨样，修复组织表面平整度、与邻近正常软骨的整合程度、II型胶原蛋白含量、GAG含量、钙化软骨层及软骨下骨形态等方面均明显优于空白对照组，有临床转化的潜能。

说明书

技术领域

本发明属于医学材料领域，涉及基于氧化透明质酸-II型胶原和自体浓缩骨髓有核细胞的关节软骨修复材料，还涉及该材料的制备方法和应用。

背景技术

关节软骨是衬附在关节表面的薄层致密结缔组织，其表面光滑，质地坚固而富有弹性，是人体关节重要的负重组织。而正常的关节软骨由于无血管、神经及淋巴分布，损伤后难以自行修复，至今仍然缺乏有效的修复策略。而临床工作中，关节软骨损伤的发生率较高，Widuchowski回顾性分析25,124例膝关节镜手术病例，发现60％病例存在软骨损伤。软骨损伤已成为导致关节疼痛、功能障碍甚至肢体残疾的重要原因。现阶段临床常用的损伤软骨修复策略主要包括：关节腔清理、微骨折、软骨移植、软骨细胞移植、骨软骨移植等，但以上修复策略长期疗效欠佳，治疗效果难以令人满意。软骨组织工程技术是关节软骨损伤修复较为理想的方法，但现阶段组织工程技术用于软骨修复仍存在诸多问题，如：程序较复杂；修复组织力学属性较差、与宿主组织整合欠佳以及纤维软骨退变等。因此，探索更为简便且具有更优修复效果的软骨组织工程策略具有重要意义。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种基于氧化透明质酸-II型胶原和自体浓缩骨髓有核细胞的关节软骨修复材料；本发明的目的之二在于提供基于氧化透明质酸-II型胶原和自体浓缩骨髓有核细胞的关节软骨修复材料的制备方法；本发明的目的之三在于提供基于氧化透明质酸-II型胶原和自体浓缩骨髓有核细胞的关节软骨修复材料的应用。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1.基于氧化透明质酸-II型胶原和自体浓缩骨髓有核细胞的关节软骨修复材料，由氧化透明质酸、II型胶原蛋白和自体浓缩骨髓有核细胞制成。

优选的，氧化透明质酸、II型胶原蛋白和自体浓缩骨髓有核细胞的加入量按每5×10⁶个自体浓缩骨髓有核细胞加入100mg>

优选的，所述100mg/ml的氧化透明质酸由每100mg氧化透明质酸加入1ml PBS溶液，经完全溶解制得。

更优选的，所述II型胶原蛋白由以下方法制备：将冻干软骨粉按质量体积比为20:1(g：L)用浓度为4M盐酸胍溶液搅拌混悬，搅拌后置于4℃条件下，消化软骨粉基质中的粘多糖至匀浆状态；消化完全后，将消化产物在4℃、8000rpm条件下离心20min，弃上清液，收集沉淀物，加水溶解，然后加入相当于盐酸胍溶液体积3/50倍的醋酸，加入相当于冻干软骨粉重量0.1倍的胃蛋白酶，加水至终体积为盐酸胍溶液的2倍，调节pH值于2.5-3之间，然后在4℃条件下消化48h；消化完毕后于立式高速离心机中8000rpm离心20min，弃沉淀，收集上清液；接着向上清液中缓慢倒入浓度为1.5M的NaOH溶液并搅拌至pH值为7.5时停止倒注，加入NaCl使其终浓度为3M，4℃条件下，8000rpm离心20min，收集沉淀物；沉淀物分装至透析袋中待透析液电导率，接近纯水电导率时结束透析；将透析袋内粘稠胶状溶液在4℃条件下，立式高速离心机8000rpm离心20min，收集沉淀物至无菌容量瓶中，加入0.15mol/L的盐酸溶液，溶解3天后白色沉淀蛋白分散、溶解呈凝胶状，搅拌均匀，分装，冻干，备用。

更优选的，所述氧化透明质酸由以下方法制备：配制成质量分数为2％的透明质酸溶液，然后加入0.1g/ml的高碘酸钠溶液，搅拌，避光条件下完全氧化反应6小时，然后加入乙二醇终止反应，再将反应液灌入透析袋中至电导率接近纯水时结束透析，获得氧化透明质酸。

更优选的，自体浓缩骨髓有核细胞由以下方法制备：对目前动物进行麻醉，然后用已经使用1000U/ml肝素预湿的注射器抽取骨髓血，然后将抽取的抗凝骨髓液加入等体积的无菌PBS液，混匀，混匀后将骨髓液沿管壁缓慢注入到含等体积的浓度为1.073g/ml的Percoll胞分离液中，注入过程保持分离液与混合液体之间界面的完整，接着采用Percoll密度梯度离心法获取自体浓缩骨髓有核细胞，先以2000rpm的速度离心混合液体15min，吸取有核细胞层，加入PBS溶液洗涤吸取的有核细胞，以1500rpm的速度离心洗涤细胞5min，弃上清。再次加入PBS吹打洗涤细胞，1000rpm速度离心5min，弃上清，加入PBS重悬即得。

2、所述基于氧化透明质酸-II型胶原和自体浓缩骨髓有核细胞的关节软骨修复材料的制备方法，具体步骤如下：将自体浓缩骨髓有核细胞先与II型胶原蛋白混合，然后再加入氧化透明质酸进行交联。

3、所述基于氧化透明质酸-II型胶原和自体浓缩骨髓有核细胞的关节软骨修复材料在制备关节软骨修复材料中的应用。

本发明的有益效果在于：本发明公开基于氧化透明质酸-II型胶原和自体浓缩骨髓有核细胞的关节软骨修复材料，该材料由氧化透明质酸、II型胶原蛋白和自体浓缩骨髓有核细胞制成，植入的自体浓缩骨髓有核细胞具有自我更新及成软骨分化潜能，参与软骨缺损修复，因此制得的材料对软骨损伤具有很好的修复效果，修复组织呈透明软骨样，修复组织表面平整度、与邻近正常软骨的整合程度、II型胶原蛋白含量、GAG含量、钙化软骨层及软骨下骨形态等方面均明显优于空白对照组，有临床转化的潜能。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为SDS-PAGE电泳图(Lane1，Lane2和Lane3分别表示不同的上样量)。

图2为II型胶原蛋白水凝胶摇菌实验。

图3为骨髓间充质干细胞图(A：培养2天贴壁间充质干细胞；B：传代P3的间充质干细胞)。

图4为II型胶原与间充质干细胞充分混合图(A：II型胶原与细胞共培养诱导；B：凝胶与间充质干细胞共培养)。

图5为HA和OHA傅立叶红外光谱。

图6为CCK-8检测结果。

图7为OHA-COLII-BMSC在模具中成胶结果。

图8为猪骨髓间充质干细胞三系诱导结果(A：间充质干细胞成骨诱导；B：间充质干细胞成脂诱导；C：间充质干细胞软骨诱导)。

图9为OHA-COLII-BMSC成凝胶及培养不同时间切片结果(A：OHA-COLII-BMSC成凝胶结果；B：培养14小时后切片结果；C：培养21小时后切片结果；D：培养前凝胶切片结果；E：培养14小时凝胶切片结果；F：培养21天凝胶切片结果)。

图10为软骨修复组织评分结果(A：MOCART评分结果；B：O`Driscoll评分结果；C：ICRS评分结果)。

图11为氧化透明质酸的制备及与II型胶原蛋白产生交联反应原理图。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。

实施例1、氧化透明质酸II型胶原仿生凝胶的制备

(1)软骨Ⅱ型胶原蛋白水凝胶的提取及鉴定

a.制备软骨粉：获取新鲜贵州小香猪膝关节透明软骨，于-20℃冰箱冷冻12h，将冷冻软骨集于玻璃皿中，置于真空冷冻干燥机中，24h后冻干(温度降至-66℃，压强降至1Pa)，冷冻干燥后软骨片，倒入液氮低温粉碎机，持续充入液氮，软骨片粉碎成干燥软骨粉末，收集软骨粉至密封袋保存待用；

b.Ⅱ型胶原蛋白的提取：称取20g冻干软骨粉置于烧杯中，倒入1L 4M盐酸胍溶液搅拌混悬，磁力搅拌器持续搅拌并置于4℃冰箱中，消化软骨粉24h后基质中的粘多糖至匀浆状态；消化完全后，将消化产物在4℃离心8000rpm×20min，弃上清液，收集沉淀物至烧杯中，加水至1500ml刻度处，然后量取60ml醋酸加入烧杯中，加入2g胃蛋白酶，加水至2000ml刻度处，调节pH值于2.5-3之间，置于冰箱中4℃条件下磁力搅拌消化48h；胃蛋白酶消化完毕后于立式高速离心机中离心8000rpm×20min，弃沉淀，收集上清液；接着向上清液中缓慢倒入1.5M NaOH溶液并行搅拌至pH值为7.5时停止倒注，加入NaCl使其终浓度为3M，4℃条件下，离心8000rpm×20min，收集沉淀物；沉淀物分装至透析袋中(直径25mm,分子量3500)，两端用尼龙线扎紧，双蒸水透析，前48h每6h更换一次透析液，之后每12h更换一次，总透析时间大约5d。电导率仪实时监测透析液电导率，待透析液电导率，低于生理盐水，接近纯水电导率时结束透析；将透析袋内粘稠胶状溶液移至离心筒，4℃条件下，立式高速离心机离心8000rpm×20min，收集沉淀物至无菌容量瓶中，加入0.15mol/L的盐酸溶液，溶解3天后白色沉淀蛋白分散、溶解呈凝胶状，搅拌均匀，在超菌工作台中，分装至不同容量灭菌玻璃密封瓶中，4℃保存待用；

取适量胶原蛋白水凝胶进行冻干，按公式(湿重-挥发液体重量)/(湿重体积)，计算出II型胶原水凝胶w/v，结果显示，采用本实施例的方法制得II型胶原蛋白检测质量分数为10％(w/v)。

将提取的II型胶原蛋白经过SDS-PAGE凝胶电泳后，结果如图1所示。结果显示，提取的蛋白仅显示一条条带，随着上样量的增多，条带浓度呈梯度增强，条带分子量约120KD，为软骨II型胶原蛋白所特有蛋白条带，在其它分子量上无明显杂带显影，说明提取的II型胶原蛋白纯度较高。

II型胶原蛋白水凝胶用2M NaOH调节中性后，置于LB培养基中，多次进行摇菌实验，虽有部分胶原溶解于培养基中底部，但摇菌管中上部培养基透明清亮，与阳性和阴性管对比，均显示出无污染阴性结果(图2)。

骨髓间充质干经过密度梯度离心后，分离的细胞培养基进行重悬，培养2d换液冲洗掉漂浮淋巴细胞和红细胞，贴壁的细胞即为获取的骨髓间充质干细胞，细胞呈多角形、长梭形，原代细胞细胞分裂象多见(图3中A)，4-5天后即形成多个细胞集落。经过传代培养后，细胞增长更加旺盛，长梭形细胞经5-7天在培养瓶中即可形成80％-90％细胞融合度，呈编织状、漩涡状排列。(图3中B)

II型胶原与间充质干细胞充分混合后，凝胶块可沉浸于培养基中，少量凝胶块可发生溶解，但并非污染引起的浑浊，更换培养基时需小心更换，避免吹打，凝胶块以物理连接团聚，强度较低，结构松散(图4中A)。在光学显微镜下照相可见胶原纤维排列松散，在凝胶块边缘可见丝样胶原纤维，长短均一，在凝胶块的细胞呈圆形，脱落于培养板上的细胞变延长，开始分裂增殖。(图4中B)

(2)透明质酸的氧化

透明质酸的氧化：取4g透明质酸溶解200ml纯水中，在磁力搅拌器上搅拌6h完全溶解，配制成质量分数为2％的透明质酸溶液，待用；取2g高碘酸钠加入20ml纯水中溶解后，倒入配制的2％透明质酸溶液中，持续搅拌，铝箔纸包裹避光，室温(18～25℃)环境下完全氧化反应6小时；量取乙二醇20ml加入烧杯中反应1h，终止氧化反应，将反应液灌入透析袋中(直径25mm，分子量3500)，两端扎紧，双蒸水透析，前48h每6h更换一次透析液，之后每12h更换1次。电导率仪实时监测透析液电导率，待透析液电导率，接近纯水电导率时结束透析，获得氧化透明质酸，将透析液倒入冻干盘中置于-20℃冰箱中，预冷冻12h结冰后，置于真空冷冻干燥机中冷冻干燥24h(温度降至-66℃，压强降至1Pa)，最后将干燥的氧化透明质酸以100mg为单位分装至EP管中，密封胶带密封，Co 60辐照消毒。

透明质酸经高碘酸钠氧化后呈透明液态，冻干后呈海绵状，将冻干的透明质酸和未经氧化的透明质酸，经溴化钾压片法，行傅立叶红外光谱检测，在波长1750发生特征性改变，表明透明质酸上的羟基被高碘酸钠特异性的氧化成醛基(图5)。

将氧化后透明质酸可完全溶解于培养基中，猪骨髓间充质干细胞在0.5mg/ml，1.0mg/ml，1.5mg/ml氧化透明质酸培养体系中进行培养48h后，行CCK-8检测，与空白对照组进行对照无明显差异，证明其无明显细胞毒性和增殖活性减弱(图6)。

(3)氧化透明质酸II型胶原仿生凝胶的制备

a.取辐照消毒的氧化透明质酸100mg，加入1ml PBS溶液，使其完全溶解待用。

b.取1g II型胶原蛋白，加入75μl NaOH(2M)，神经剥离子搅拌均匀，移液枪加入100μl溶解氧化透明质酸，充分搅拌。将其填充至不锈钢模具孔中(直径8mm，厚3mm)，2min后氧化透明质酸II型胶原蛋白(OHA-COLII)完全成胶呈凝固状。置于-20℃冰箱中预冻24h后，置于真空冻干机中进行冻干呈海绵状。送至第三医科大学中心实验室，离子溅射仪给样品镀10nm金膜，扫描电镜观察剖面。其余凝胶块浸于生理盐水的培养皿中，置于37℃培养箱中培养14d，观察溶胀和溶解情况(图7)。

猪骨髓间充质干细胞三系诱导：取传代培养的间充质干细胞。

a)成骨诱导：当细胞融合度达到80-90％时，用质量分数0.25％的胰酶进行消化；将消化下来的干细胞按照2×10⁴cells/cm²的细胞密度接种六孔板中，接种前将孔板中放入0.1％明胶包被的玻片，每孔加入2mL完全培养基。当细胞融合度达到60-70％，将孔内完全培养基吸走。分别向六孔板中加入2mL成人骨髓间质干细胞成骨诱导分化完全培养基，每隔3d换液，诱导3w后茜素红进行染色。结果如图8中A所示，结果显示骨髓间充质干细胞经过成骨诱导后，分泌的钙结节被茜素红红染。

b)成脂诱导：细胞接种方法同上，细胞融合度达到100％，将间质干细胞完全培养基吸走，向六孔板中加入2ml骨髓间充质干细胞成脂诱导分化培养基A液。诱导3d后，吸走六孔板中的A液，加入2ml骨髓间质干细胞成脂诱导分化培养基B液。24h后，吸走B液，换回A液进行诱导。A液和B液交替作用4次后(15d)，继续用B液维持培养5d直到脂滴变得足够大、圆，固定后油红O染色。结果如图8中B所示，结果显示经过成脂诱导后，细胞胞体变大，细胞铺展，细胞核淡染，细胞浆内产生大量的脂肪颗粒，较大的脂肪颗粒可发生融合，形成脂肪滴。

c)成软骨诱导：细胞接种方法同上，细胞融合度达到100％，将间质干细胞完全培养基吸走，向六孔板中加入2ml骨髓间充质干细胞成软骨诱导分化培养基，培养21d，固定后阿立新兰染色。染色后用镊子取出六孔板中玻片，在光学显微镜下拍照观察诱导情况；结果如图8中C所示，结果显示成软骨诱导后，间充质干细胞形态发生改变，由长梭形变为铺路石样，分泌GAG被阿里新兰染成浅蓝色，细胞核不着色。

取培养至第三代的猪骨髓间充质干细胞，倒掉培养基，PBS冲洗2遍后，0.25％胰酶消化3min，细胞呈球状，轻拍瓶壁细胞脱落悬浮，2ml完全培养基终止消化。1000rpm×3min离心后，2ml培养基重悬，细胞计数板计数细胞，取5×10⁶再次离心至2ml>

在孔板中培养至14d，21d分别取标本，10％福尔马林固定24h后，行HE染色，在光学显微镜下观察切片情况；培养至第14d取标本一枚戊二醛固定，50％、70％、80％、90％乙醇梯度脱水各15min，再用100％乙醇脱水3次，每次30min；叔丁醇置换每次30min，共置换3次。冷冻干燥仪干燥样品，用双面胶带将样品粘到样品台上，离子溅射仪给样品镀10nm金膜，扫描电镜观察标本剖面情况。结果如图9所示，结果显示，培养14d、21d后在培养基中仍保持了凝胶的完整(图9中B和C)，切片显示间充质细胞均匀分布于凝胶块中，无明显减少(图9中D、E和F)。固定后脱水，凝胶块固缩呈团块状，剖面扫面电镜显示固缩球形细胞分布于凝胶中(图9中A)。

实施例2、仿生凝胶复合自体浓缩骨髓有核细胞修复软骨缺损实验

为了探索仿生凝胶复合自体浓缩骨髓有核细胞修复关节软骨损伤的效果，设计了一步法修复软骨缺损的动物实验，通过仿生凝胶复合自体浓缩骨髓有核细胞修复猪膝关节软骨缺损。以贵州小香猪为实验动物，首先在全麻下于髂脊处抽吸获取骨髓，通过骨髓分离液分离获取自体浓缩骨髓有核细胞，并和II型胶原蛋白混合，再加入氧化透明质酸进行交联。通过手术方式于膝关节股骨滑车处制备直径为8mm的全厚软骨缺损模型，将混合细胞的水凝胶植入软骨缺损部位。术后1、3、6月通过MRI、大体观察、体视显微镜及病理切片进行观察分析。通过本部分动物实验，探索该策略修复软骨缺损的实验效果，验证该策略的可行性，为后期的临床运用提供基础。

具体实验方法如下：

将40头贵州小香猪按照随机数表法随机分为A、B两组，每组20膝，共40膝，避免修复关节继发性损伤，仅一侧关节施行手术；A组为空白对照组(单纯透明软骨缺损组)；B组为实验组(II型胶原蛋白-氧化透明质酸水凝胶复合自体骨髓浓缩有核细胞修复组)；每组膝关节于4个时间点(1、3、6及12月)取材进行观察、检测及评价，每个取材时间点选取5个膝关节样本。

贵州小香猪自体浓缩骨髓有核细胞的获取：肌注陆眠宁4ml进行基础麻醉，3％戊巴比妥钠溶液按0.2mL/kg剂量耳静脉注射，麻醉贵州小香猪；将麻醉后的贵州小香猪置于手术台上，取侧卧位，对侧髂前上棘区备皮、消毒、铺巾。使用16号骨髓穿刺针于髂嵴处刺入，感觉到落空感后再进针约1cm，取出针芯，用已经使用肝素(1000U/ml)预湿的20ml注射器(肝素2ml)抽取骨髓血。根据抽吸量的多少适当调整穿刺针的位置及深度，共抽吸约20ml，送实验室进行自体浓缩骨髓有核细胞分离；将抽取的抗凝贵州小香猪骨髓液注入50ml离心管中，再加入等体积的无菌PBS液，混匀。将混匀后的骨髓液沿离心管壁缓慢注入到含等体积的Percoll(1.073g/ml)细胞分离液中，注入过程缓慢进行，保持分离液与混合液体之间界面的完整。防止因速度过快使骨髓液与Percoll细胞分离液混合，影响分离效果。采用Percoll密度梯度离心法获取自体浓缩骨髓有核细胞：以2000rpm的速度离心混合液体15min，可见液体分层现象：自上至下分别为：血浆层、有核细胞层(含骨髓间充质干细胞)、透明分离液层及红细胞层。小心吸取有核细胞层(第2层的白色云雾状层)至新的离心管，加入10ml PBS溶液洗涤吸取的有核细胞，以1500rpm的速度离心洗涤细胞5min，弃上清。再次加入10ml PBS吹打洗涤细胞，1000rpm速度离心5min，弃上清。加入5ml PBS重悬，并使用细胞计数板行细胞计数，收集细胞备用；II型胶原蛋白复合骨髓浓缩有核细胞：取2×10⁶个骨髓有核细胞，置于EP管，1000rpm的速度离心5min，弃上清，加入100mg>

然后进行动物手术，具体步骤如下：

a.抽取骨髓后于对侧膝部理发器剪毛备皮，备皮范围大小约为40cm×30cm，用无菌纱布蘸抗菌洗手液反复擦洗术区至清洁无污物，碘伏壶喷洒术区。将手术动物置于动物手术台的V形槽上，取侧卧位，碘伏再次喷洒消毒，铺一次性无菌单巾。取膝关节外侧髌旁入路，纵行切开皮肤长约6cm，逐层切开皮下组织、关节囊，将髌骨向内侧脱位，显露股骨滑车；

b.用直径为8mm的自制软骨缺损套筒于股骨滑车钻一个环形的软骨缺损，深度与关节透明软骨层厚度一致。利用眼科剪将环内透明软骨剪碎呈网状，小刮匙刮除剪碎的透明软骨，并保证钙化软骨层结构的完整，并确保基底无骨髓血渗出，修整缺损的底部及边缘，制备直径为8mm的全厚软骨缺损模型；

c.用生理盐水脉冲枪冲洗造模区域以清除软骨碎削，将10μl氧化透明质酸溶液加入复合细胞的II型胶原蛋白凝胶中。神经剥离子搅拌均匀后植入软骨缺损部位，并塑形使凝胶表面与软骨表面平齐，刮除周围多余凝胶，静置2min待凝胶复合物充分成胶。复位髌骨并被动活动数次膝关节见凝胶块附着牢固，复位髌骨可吸收线加强缝合内侧支持带后脉冲冲洗，逐层缝合皮下及皮肤；

d.术后即刻予鹿醒宁1支肌肉注射催醒，兽用青霉素钾400万单位肌注预防感染。术后膝关节不做固定，每日术区碘伏消毒2次，肌注抗生素2次(兽用青霉素钾400万单位)。常规饮食饲养，每日观察动物基本情况、伤口愈合情况及行走步态等。术后4头贵州小香猪由于麻醉相关死亡(n＝2)，关节脱位(n＝1)及术后感染(n＝1)而脱离研究系列。因此，一共36头贵州小香猪完成了全部的手术及术后观察评估，因此本研究暂时终止了术后12个月的长期随访，仅随访了术后1、3及6月的修复效果。剩余的36头小香猪在术后7天基本恢复正常的行走步态，术后10天左右手术切口达甲级愈合。1月随访组，取材时间为术后33±3天；3月随访组，取材时间为术后92±1天；6月随访组，取材时间为术后183±5天。

(1)MRI评分

采用改良软骨修复组织MR观察评分系统(Modified magnetic resonance observation of cartilage repair tissue score，MOCART)，对软骨缺损的修复效果进行半定量评分，其具体的评分标准如表1所示：

表1.改良软骨修复组织MR观察评分系统(MOCART)

其评分结果如表2和图10中A所示，结果显示，空白对照组和实验组在术后1、3及6月MOCART评分分别为10±0和53.5±4.74(n＝10,p<0.001)；42±4.83和89.5±5.99(n＝10,p<0.001)；以及64±6.99和96±5.16(n＝10,p<0.001)。

表2.软骨修复组织MOCART评分

值被表示为平均值±SD,Mann-Whitney’s U-test was used.*p<0.05(Treat.Vs.Cont.)

^a在原始的MOCART中，软骨下骨板被钙化层取代.

结果表明，使用本发明制备的(II型胶原蛋白-氧化透明质酸水凝胶复合自体骨髓浓缩有核细胞修复软骨效果更好。

(2)改良O’Driscoll组织学评分：采用改良O’Driscoll组织学评分对2组实验动物软骨缺损修复效果进行半定量分析，结果如表3和图10中B所示。对照组与治疗组在术后1、3及6月改良O’Driscoll组织学评分分别为：0 vs 13.3±2.21(n＝10,p<0.001)；6.1±2.02 vs 16.8±1.4(n＝10,p<0.001)及8±1.49 vs 17.6±1.26(n＝10,p<0.001)。表面治疗组损伤软骨修复效果较对照组更优。

表3.软骨修复组织改良O’Driscoll组织学评分

值被表示为平均值±SD,Mann-Whitney’s U-test was used.*p<0.05(Treat.Vs.Cont.)

(4)改良ICRS组织学评分：使用改良ICRS组织学评分对软骨缺损修复效果进行评价分析，从缺损修复程度、新生组织与邻近软骨整合、修复组织颜色、大体观以及修复组织力学强度等方面进行评估分析，结果如表4所示。对照组及治疗组在术后1、3及6月改良ICRS组织学评分分别为：0 vs 16.6±1.78(n＝10,p<0.001)；11.3±2.71 vs 19.3±1.64(n＝10,p<0.001)以及15.1±1.85 vs 19.9±0.32(n＝10,p<0.001)。

表4.软骨修复组织改良ICRS组织学评分

Values were presented as mean±SD,Mann-Whitney’s U-test was used.*p<0.05(Treat.Vs.Cont.)

上述结果表明，通过氧化透明质酸-II型胶原仿生凝胶复合自体浓缩骨髓有核细胞对贵州小香猪软骨缺损具有良好的修复效果。软骨缺损区域被软骨样新生修复组织填充，修复组织表面平整，与邻近正常软骨整合良好。基质中细胞与正常软骨细胞形态相似，可见分裂现象，具有自我更新能力，间充质干细胞成软骨分化。修复组织内II型胶原、GAG含量明显高于空白对照组，其MOCART评分、O’Driscoll组织学评分及ICRS组织学评分也明显优于空白对照组，有临床转化的潜能。其原理是：将透明质酸通过高碘酸钠氧化改性透明质酸，将其羟基氧化成醛基，氧化透明质酸上的醛基与II型胶原蛋白上的氨基通过Schiff's base反应，发生化学交联而成凝胶(图11所示)，该方法克服了透明质酸不能与II型胶原蛋白发生聚合反应的问题。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。