一种同时表达靶向CD19和CD20的CAR与PD1-CD28嵌合受体的慢病毒载体

摘要

本发明涉及分子生物学领域，具公开了一种同时表达靶向CD19和CD20的CAR与PD1‑CD28嵌合受体的慢病毒载体。所述慢病毒载体通过同时高效表达靶向CD19和CD20的CAR和PD1‑CD28嵌合体，使该载体感染的T细胞不仅可以靶向识别表达CD19和CD20的肿瘤细胞，而且可以解除PD‑L1/PD1介导的免疫抑制，从而发挥更强地杀伤肿瘤细胞的能力。进一步地，本发明优化了载体中关键元件的选择和连接顺序，提高靶向CD19和CD20的CAR和PD1‑CD28嵌合体在人类T细胞中的表达效率。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体地说，涉及一种同时表达靶向CD19和CD20的CAR与PD1-CD28嵌合受体的慢病毒载体。

背景技术

近年来，抗CD19的CAR-T在治疗复发，耐药，难治B细胞白血病和淋巴瘤方面取得了举世瞩目的成就，引起世界各国肿瘤临床医生的极大兴趣。但是仅靶向CD19的CAR-T治疗B细胞来源肿瘤会导致肿瘤细胞CD19低表达或不表达，从而导致肿瘤细胞免疫逃逸而产生复发和耐药。因此同时靶向CD19和CD20的CAR可以同时靶向B细胞来源肿瘤的CD19和CD20两个靶点，因此对于B细胞来源肿瘤尤其是CD19 CAR-T治疗失败的患者，双靶点CAR-T会取得较好的治疗效果。 CD19和CD20是B细胞系的细胞，包括正常的B细胞，前B细胞，B细胞淋巴瘤和白血病细胞，特异性表达的两个膜蛋白,其他细胞和组织都不表达CD19和CD20。研究表明，阻断PD-L1/PD1介导的免疫抑制将会是CAR-T成功用于治疗恶性肿瘤的关键。

阻断PD-L1和PD1的结合，理论上就可以消除PD1信号对T细胞的抑制，激活T细胞的免疫反应，起到抗肿瘤的效果。目前，FDA批准了两个抗PD1的单抗Nivolumab和Pembrolizumab用于治疗其他疗法已失败的转移性非小细胞肺癌和黑色素瘤。虽然我国黑色素瘤的发病率并不高，但肺癌是我国第一大癌，同时也是死亡率最高的癌症。其中的非小细胞肺癌，生存率极低。5年生存率不容乐观。目前，国家食品药品监督总局(CFDA)尚未批准Nivolumab和Pembrolizumab在国内临床使用。而且Nivolumab和Pembrolizumab需要多次使用，对大多数患者来说，医疗负担过重。

针对PD-L1的单抗也能起到类似的抗肿瘤效果。根据目前已经报道的临床研究，MPDL3280A(anti-PD-L1人源单抗)在治疗黑色素瘤，非小细胞肺癌，直结肠癌(colorectalcancer)和膀胱癌(bladder cancer)都取得了不同程度的疗效。MEDI4736是另外一个人源抗 PD-L1单克隆抗体，它能阻断PD-L1和PD1的结合，使得T细胞能够识别和杀死肿瘤细胞。对于MEDI4736的临床抗肿瘤效果正在多个中心展开，其中也包括非小细胞性肺癌和头颈部肿瘤。

鉴于抗PD-L1/PD1抗体免疫治疗在我国的应用问题，急需提供一种可替代的治疗产品及方法。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种同时表达靶向CD19和CD20的CAR与PD1-CD28嵌合受体的慢病毒载体及其构建方法与应用。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明提供一种同时表达靶向CD19和CD20的CAR与 PD1-CD28嵌合受体的慢病毒载体。

PD1和CD28都属于CD28蛋白家族的成员。T细胞激活不仅需要抗原结合到TCR(T细胞受体)激活的信号，同时还需要共刺激分子(如CD28)提供的防止免疫无能(anergy)的信号。CD28是CD4⁺>H和CD8⁺CTL细胞的主要共刺激受体，而PD1是防止活化的T>

进一步研究发现，PD1-CD28嵌合受体能够把PD-L1/PD1传导的本来是抑制T细胞活性的信号，转换成刺激T细胞激活的信号。而且，肿瘤组织表达大量PD-L1，PD1-CD28嵌合受体借助于PD-L1提供的信号，化抑制为刺激，促进T细胞的抗肿瘤活性。

本发明将靶向CD19和CD20的CAR与PD1-CD28嵌合受体共同构建于同一慢病毒载体进而转入患者T细胞，使该基因修饰的T 细胞不仅可以靶向识别表达CD19和CD20的肿瘤细胞，还可以解除肿瘤细胞表达的PD-L1对T细胞的免疫抑制，实现了良好的抗肿瘤效果。

进一步地，由于慢病毒感染外周血T细胞的效率普遍不高，而且多个目的基因在同一载体上表达时，所表达的蛋白活性及表达效率亦会下降。

为了促进靶向CD19和CD20的CAR和PD1-CD28嵌合受体在T细胞中均可进行高效的表达，本发明进一步优选了慢病毒载体启动子种类以及这两个目的基因的连接方式，以求对T细胞发挥最佳的感染效率。

基于此目的，本发明通过在慢病毒表达载体中，使两个目的基因共用一个启动子EF1α，并在两者间使用Furin-linker-spacer-F2A进行连接，使得该慢病毒载体产生的慢病毒可以高效感染外周血T细胞，而且靶向CD19和CD20的CAR与PD1-CD28嵌合体可以分别表达于该T 细胞表面。

更为具体地说：所述慢病毒载体携带两个目的基因，先通过转染试剂转染293ft细胞产生慢病毒，然后慢病毒感染外周血T细胞，进而将两个目的基因整合进T细胞基因组，从而实现这两个目的基因在T 细胞内表达。

所述Furin-linker-spacer-F2A在本文中可简称为2A肽，在图3中表示为F2A。

由于Furin和F2A肽的剪切作用，上游蛋白(靶向CD19和CD20的 CAR)的C端仅含有1到3个额外的氨基酸残基，下游蛋白(PD1-CD28 嵌合体)的N端仅含有额外的脯氨酸残基。经实验研究后，这些氨基酸残基不影响这两个蛋白正常表达。

进一步地，所述慢病毒载体优选为所述慢病毒载体选自启动子为 EF1α的慢病毒载体。如此，则无需对慢病毒载体的启动子进行替换，直接使用慢病毒载体自带的EF1α启动子即可。

自带EF1α启动子的慢病毒载体可通过商业途径购买获得。例如，在本发明的具体实施方式中，所使用的自带EF1α启动子的慢病毒载体为pCDH-EF1-Luc2-T2A-tdTomato，购自武汉淼灵生物科技有限公司。

所述靶向CD19和CD20的CAR的氨基酸序列如SEQ ID NO.1 所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述2A肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述PD1-CD28的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

第二方面，本发明提供前述慢病毒载体的构建方法，包括如下步骤：

(1)将表达靶向CD19和CD20的CAR与PD1-CD28嵌合受体的核苷酸序列使用Furin-linker-spacer-F2A进行连接，合成融合基因，合成所述融合基因时在其两端分别包含XbaI和SalI酶切位点，并将其装载在质粒上；

(2)利用XbaI和SalI双酶切步骤(1)所述质粒，切胶回收目的基因片段；

(3)利用XbaI和SalI双酶切慢病毒原始载体，切胶回收的载体片段；

(4)利用DNA连接酶将步骤(2)回收的目的基因片段与步骤(3) 回收的载体片段连接，即得。

进一步地，为了进一步提高两个目的基因的表达效率，本实验室又对比了多个在T细胞中高效表达的启动子。而后研究发现，EF1ɑ启动子相较于其他本领域常用的强启动子，具有显著优势。

因此在本发明所述方法中，优选所述慢病毒原始载体自带EF1α启动子。

第三方面，本发明提供了前述慢病毒载体在抗肿瘤治疗中的应用，以及其在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明涉及到的原料或试剂均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到具体实施方式。

本发明的有益效果在于：

本发明提供了一种同时表达靶向CD19和CD20的CAR与 PD1-CD28嵌合受体的慢病毒载体，使该载体感染的T细胞不仅可以靶向识别表达CD19和CD20的肿瘤细胞，而且可以解除PD-L1/PD1介导的免疫抑制，从而发挥更强地杀伤肿瘤细胞的能力。进一步地，本发明优化了载体中关键元件的选择和连接顺序，使得这两个目的基因均能在人类T细胞中高效表达。

附图说明

图1为本发明实施例2中CD19&CD20CAR和PD1-CD28在载体中的多种连接方式的组合示意图。

图2为实施例2中18种慢病毒载体感染外周血T细胞后表达 CD19&CD20CAR和PD1-CD28T细胞的百分比，其中，纵坐标表示表达这两个目的基因的T细胞百分比。

图3为实施例2中优选的慢病毒载体结构示意图，其中，F2A表示 Furin-linker-spacer-F2A的组合。

图4为实施例3中两个目的基因位置调换前后的慢病毒载体感染外周血T细胞后表达CD19&CD20CAR和PD1-CD28T细胞的百分比， 17-1表示图2中的17号载体，17-2表示图2中的17号载体两个目的基因调换位置后的载体，其中，纵坐标表示表达这两个目的基因的T细胞百分比。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

本实施例用于说明本发明所述慢病毒载体的构建方法。

1、原料

原始载体pCDH-EF1-Luc2-T2A-tdTomato：购自武汉淼灵生物科技有限公司。

XbaI和SalI内切酶：购自New England Biolabs(Beijing)LTD.。

2、载体的构建

(1)将表达靶向CD19&CD20的CAR与PD1-CD28嵌合受体的核苷酸序列使用Furin-linker-spacer-F2A进行连接，合成融合基因，合成这段基因时在两端分别包含XbaI和SalI酶切位点，并装载在pUC57载体上；

(2)XbaI和SalI双酶切包含目的基因的pUC57载体，切胶回收目的基因片段；

(3)利用XbaI和SalI双酶切原始载体pCDH-EF1-Luc2-T2A-tdTomato，切胶回收约6.5kb的载体片段；

(4)用DNA连接酶连接回收的目的基因片段和载体片段，即得。

实施例2

本实施例用于说明在构建载体的过程中，对载体中关键元件的选择和连接顺序的优化。

本实施例对多种在T细胞高效表达的启动子以及两个目的基因的主要的连接方式进行组合尝试(详见图1)。

合成图1中的18种目的基因序列，通过XbaI和SalI双酶切构建于pCDH-EF1-Luc2-T2A-tdTomato载体，将18种构建好的慢病毒载体进行慢病毒包装，进而感染外周血T细胞，靶向CD19&CD20的CAR和 PD-1的抗体进行流式染色，通过流式细胞仪进行分析。结果如表1和图2所示。

需要说明的是，由于pCDH-EF1-Luc2-T2A-tdTomato载体自带启动子EF1α，当使用其他启动子时，需首先在其他启动子序列的两端引入包含ClaI和XbaI的酶切位点序列，然后通过ClaI和XbaI双酶切合成的核苷酸序列，同时使用这两个酶双酶切 pCDH-EF1-Luc2-T2A-tdTomato载体获得约9kb的载体片段，然后将双酶切后的启动子序列和酶切后的载体片段通过DNA连接酶进行连接，从而构建包含不同启动子的慢病毒载体。

表1 18种慢病毒载体感染外周血T细胞后CD19&CD20CAR和PD1-CD28阳性T细胞比例

通过比较实验结果，发现17号载体的构建方式能够实现 CD19&CD20CAR和PD1-CD28在T细胞中均进行高效表达，且意外发现其表达比例显著高于其他组合方式。

因此，本发明优选该组合方式构建所述慢病毒载体(图3)。

实施例3

本实施例与实施例1的区别在于，将CD19&CD20CAR和 PD1-CD28在载体中的基因位置进行调换，实验发现，位置调换后，目的蛋白的表达效率不受影响(图4)。

应当理解的是，对上述实施例所用试剂或原料的用量进行等比例扩大或者缩小后的技术方案，与上述实施例的实质相同。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 北京市肿瘤防治研究所

<120> 一种同时表达靶向CD19和CD20的CAR与PD1-CD28嵌合受体的慢病毒载体

<141> 2017-11-30

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 944

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 1

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 1015

Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile

202530

Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser

354045

Ser Ser Val Asn Tyr Met Asp Trp Tyr Gln Lys Lys Pro Gly Ser Ser

505560

Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro

65707580

Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile

859095

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp

100 105 110

Ser Phe Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

115 120 125

Gly Ser Thr Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

130 135 140

Ser Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro

145 150 155 160

Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr

165 170 175

Ser Tyr Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu

180 185 190

Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln

195 200 205

Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr

210 215 220

Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Asp Tyr

225 230 235 240

Tyr Cys Ala Arg Ser Asn Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Trp Phe Phe Asp

245 250 255

Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly

260 265 270

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

275 280 285

Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln

290 295 300

Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr

305 310 315 320

Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu

325 330 335

Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys

340 345 350

Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu

355 360 365

Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala

370 375 380

Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

385 390 395 400

Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys

405 410 415

Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln

420 425 430

Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser

435 440 445

Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln

450 455 460

Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu

465 470 475 480

His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp

485 490 495

Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr

500 505 510

Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr

515 520 525

Lys Leu Glu Ile Thr Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys

530 535 540

Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

545 550 555 560

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

565 570 575

Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp

580 585 590

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

595 600 605

Glu Gln Phe Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

610 615 620

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

625 630 635 640

Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

645 650 655

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu

660 665 670

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

675 680 685

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

690 695 700

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

705 710 715 720

Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn

725 730 735

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

740 745 750

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Met Phe Trp Val Leu Val

755 760 765

Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala

770 775 780

Phe Ile Ile Phe Trp Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile

785 790 795 800

Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp

805 810 815

Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

820 825 830

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

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Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

850 855 860

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

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Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

885 890 895

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

900 905 910

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

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Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

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<210> 2

<211> 2832

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

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gccgaggacg ctgctaccta ctactgtcaa cagtggtcct tcaatccccc tacctttggc 360

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cattgggtga aacagacccc tggccagggc ttagaatgga ttggcgctat ttaccctggc 600

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ggcgtgagct ggatcaggca acctcctaga aaaggcctgg agtggctggg agtgatttgg 1020

ggctccgaaa ccacctacta taactccgcc ctgaagtcca ggctgaccat tatcaaggac 1080

aatagcaagt cccaggtgtt tctcaagatg aacagcctcc agaccgacga tacagccatt 1140

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ccttatacat tcggaggagg caccaagtta gaaatcaccg aatccaagta cggccccccc 1620

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ctctacagca gactgaccgt cgataagagc agatggcaag agggcaatgt gttctcctgt 2220

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ggaaaaatgt tctgggtcct cgtcgtggtg ggaggcgtgc tcgcttgcta ctccctgctc 2340

gtgaccgtcg ccttcatcat cttctgggtg aagagaggca ggaaaaagct gctctatatc 2400

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

atgcagattc cccaggcccc ttggcctgtg gtgtgggccg tgctgcagct gggatggagg 60

cctggctggt tcctggacag ccccgacaga ccctggaatc cccccacctt ttcccctgcc 120

ctgctcgtgg tgacagaggg cgacaacgcc accttcacct gcagcttctc caacaccagc 180

gagagcttcg tcctgaactg gtacaggatg agccccagca accagaccga caagctggcc 240

gccttccctg aggacagaag ccagcccggc caggactgca ggtttagagt gacccagctg 300

cccaatggca gagacttcca catgagcgtg gtgagggcca gaaggaatga cagcggcacc 360

tatctgtgcg gcgccatcag cctggctcct aaagcccaga tcaaggagtc cctgagggcc 420

gagctgaggg tgaccgagag gagagctgaa gtgcccaccg ctcactgccc ctcccctctg 480

tttcccggcc ctagcaaacc cttctgggtg ctggtggtgg tgggcggagt gctggcctgc 540

tacagcctcc tggtgaccgt cgccttcatc atcttctggg tgagaagcaa gaggagcaga 600

ctcctgcaca gcgactacat gaacatgacc cctaggaggc ctggccccac cagaaagcat 660

taccagcctt acgccccccc cagagacttt gccgcctaca ggtcctga 708