一种土壤堆肥芽孢杆菌和微生物菌剂及其应用

摘要

本发明公开了一种土壤堆肥芽孢杆菌(Compostibacillus humi)BLG74 CGMCC No.11219。本发明提供的一种土壤堆肥芽孢杆菌，能够在37～60℃油藏条件下以原油为唯一碳源进行生长，降解原油及及重质组分，增加流动性，从而提高采油率，而且该菌株代谢产生的生物表面活性剂、生物气体、有机酸等与原油相互作用，进一步增加原油在油藏内的流动性，提高原油采收率。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物采油技术领域，特别涉及一种土壤堆肥芽孢杆菌和微生物菌剂及其应用。

背景技术

微生物提高石油采收率技术(MEOR)是利用微生物在油藏中的生命活动及其代谢产物来提高原油产量和原油采收率的一种生物技术，具有实施成本低、操作简单、经济效益显著等特点，受到人们的广泛重视。利用微生物提高原油采收率就是将油藏作为一个大的发酵场，通过向油藏中添加菌液、营养剂及微生物代谢产物，促进微生物在油藏内生长繁殖，利用微生物与原油直接作用降低原油粘度增加原油流动性，利用微生物代谢产生的生物气、表面活性剂、有机酸改善原油物性，从而提高原油采收率。

假单孢菌和芽孢杆菌是目前研究较多的具有乳化原油能力的菌株。在油田开采领域展示出很好的应用前景。假单孢菌和芽孢杆菌分别在申请公布号CN104371940A和CN102757994A有所记载，可乳化原油的假单胞菌和芽孢杆菌生长温度多为30～40℃，不能适应较高温度的油藏应用。

在实现本发明的过程中，发明人发现现有技术至少存在以下问题：现有技术中的可提高原油采收率的菌株对温度的适应范围窄，不能满足较高温度的油藏应用。

发明内容

本发明的所解决的技术问题在于，提供一种能满足较高温度的油藏应用的土壤堆肥芽孢杆菌和微生物菌剂及其应用。技术方案如下：

在第一方面，本发明公开了一种土壤堆肥芽孢杆菌(Compostibacillus humi)BLG74。该土壤堆肥芽孢杆菌从我国华北油田地层水中分离得到的一株土壤堆肥芽孢杆菌。已于2015年8月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其分类命名为：土壤堆肥芽孢杆菌(Compostibacillus humi)BLG74，保藏号为CGMCC No.11219。保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

本发明从我国华北油田地层水中分离到一株土壤堆肥芽孢杆菌(Compostibacillus humi)BLG74，系统发育分析显示与土壤堆肥芽孢杆菌(Compostibacillus humi)DX-3的亲缘关系最近(99.6％相似性)，代表土壤堆肥芽孢杆菌的一个新菌株。由于菌种分离于油藏内部，与油藏具有较好的配伍性，并适用于油藏温度38～60℃，适应温度范围比较广。

土壤堆肥芽孢杆菌(Compostibacillus humi)BLG74具有以下特征：

土壤堆肥芽孢杆菌(Compostibacillus humi)BLG74在不含原油的大豆酪蛋白琼脂培养基或固体发酵培养基上生长良好，如图1所示，菌落呈乳黄色圆形，大小不一，直径3～4mm，表面湿润，边缘平整。菌株BLG74的细胞为杆状，大小0.4～0.5μm×2～5μm，产芽孢，革兰氏染色为阳性，兼性厌氧生长。菌株生长温度为37～60℃，pH 5～9，NaCl浓度0～7％(w/v)。最适生长条件：生长温度为45℃，pH 7.5，NaCl浓度3％(w/v)。能利用果糖，不利用葡萄糖。

本发明的土壤堆肥芽孢杆菌(Compostibacillus humi)BLG74的16S rRNA基因序列在GenBank登录号为KT246122，其基因序列如序列表所示。

该菌株BLG74的16S rRNA基因序列含有1387bp，16S rRNA基因序列在GenBank登录号为KT246122，在GenBank数据库中通过Blast方法比对，采用MEGA 4软件用邻接(Neighbor-Joining)法构建HB-1与相关模式菌株的系统发育树，如图2所示的该菌株BLG74与邻近菌株的系统发育学关系，该菌株BLG74与Compostibacillus humi GIESS002和Compostibacillus humi DX-3聚类在一个系统发育分支，序列同源性为99.6％，可确定该菌株菌属为Compostibacillus sp.，命名为土壤堆肥芽孢杆菌(Compostibacillus humi)BLG74。

需要说明的是，土壤堆肥芽孢杆菌(Compostibacillus humi)是Yu等[Int J SystEvol Microbiol.2015,65:346-352]于2015报道的一株高温芽孢杆菌新属种，模式菌为Compostibacillus humi DX-3，分离自广东污泥堆肥。

本发明的土壤堆肥芽孢杆菌(Compostibacillus humi)BLG74，可以在37～60℃条件下以原油作为唯一碳源进行生长繁殖。

在第二方面，本发明公开了一种微生物菌剂，包括上述任一项所述的土壤堆肥芽孢杆菌(Compostibacillus humi)BLG74和激活剂。

具体地，该微生物菌剂中所述激活剂包括以下组分：

质量份数为100份的油藏产出水；

质量份数为0.08～0.12份的氯化铵；

质量份数为0.16～0.22份的硝酸钠；

质量份数为0.04～0.06份的磷酸二氢钾；

质量份数为0.16～0.22份的硫酸钠；

质量份数为0.01～0.02份的硫酸镁；

质量份数为0.04～0.06份的碳酸钠；

质量份数为0.01～0.02份的醋酸钠；

质量份数为0.04～0.06份的酵母粉、酵母浸粉或酵母浸膏中的至少一种；以及

质量份数为0.08～0.12份的玉米浆；

pH值为7.5～8；

或

质量份数为100份的水；

质量份数为0.08～0.12份的氯化铵；

质量份数为0.18～0.22份的硝酸钠；

质量份数为0.03～0.06份的磷酸氢二钾；

质量份数为0.008～0.012份的硫酸镁；

质量份数为0.8～1.2份的氯化钠；

质量份数为0.20～0.30份的酵母粉、酵母浸粉或酵母浸膏中的至少一种；以及

玉米浆0.3～0.6份；

pH值为7.0～7.5；

或

质量份数为100份的水；

质量份数为0.4～0.6份的氯化钠；

质量份数为0.4～0.6份的大豆蛋白胨；以及

质量份数为0.8～1.2份的酪蛋白胨；

pH值为7.0-8.0。

优选地，所述水为油藏产出水。

具体地，所述土壤堆肥芽孢杆菌(Compostibacillus humi)BLG74在所述激活剂中的浓度为10⁵～10⁶个/mL。

在第三方面，本发明公开了土壤堆肥芽孢杆菌(Compostibacillus humi)BLG74在降解原油中的应用。

在第四方面，上述微生物菌剂在降解原油中的应用。

作为一种优选的实施方式，所述原油的油藏温度为37～60℃。

本发明实施例提供的技术方案的有益效果是：本发明提供的一种土壤堆肥芽孢杆菌，能够在37～60℃油藏条件下以原油为唯一碳源进行生长，降解原油及及重质组分，增加流动性，从而提高采油率，而且该菌株代谢产生的生物表面活性剂、生物气体、有机酸等与原油相互作用，进一步增加原油在油藏内的流动性，提高原油采收率。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明提供的土壤堆肥芽孢杆菌(Compostibacillus humi)BLG74的菌落和菌体形态图；

图2为本发明基于16S rRNA基因序列构建的系统发育树；

图3为本发明提供的土壤堆肥芽孢杆菌(Compostibacillus humi)BLG74在含有原油的发酵培养基中的乳化能力对照图；

图4为本发明提供的土壤堆肥芽孢杆菌(Compostibacillus humi)BLG74在含有原油的TSA培养基中的乳化能力对照图；

图5为本发明提供的土壤堆肥芽孢杆菌(Compostibacillus humi)BLG74的发酵液乳化液体石蜡效果图；

图6为本发明提供的土壤堆肥芽孢杆菌(Compostibacillus humi)BLG74作用前原油碳组分气相色谱图；

图7为本发明提供的土壤堆肥芽孢杆菌(Compostibacillus humi)BLG74作用后原油碳组分气相色谱图；

图8为本发明提供的土壤堆肥芽孢杆菌(Compostibacillus humi)BLG74作用前后原油碳组分分析图。

具体实施方式

为使本发明的技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂，均市售可得。

实施例1

本实施例提供一种土壤堆肥芽孢杆菌(Compostibacillus humi)BLG74的分离筛选及鉴定，包括以下步骤：

步骤1，将含有原油的富集培养基在105℃下高压蒸汽灭菌30min，然后将采集自华北油田58℃油藏的采出水(即油藏产出水)10mL置于经过灭菌的含有原油的富集培养基中，在温度58℃、转速200rpm的摇床中振荡培养，富集以原油为碳源的菌株。之后在富集琼脂培养基上进行平板划线分离纯化，获得以原油为碳源的单菌落。

所用含有原油的富集培养基和富集琼脂培养基的配方分别为：

含有原油的富集培养基：蒸馏水100mL(即100g)；氯化铵0.12g；硝酸钠0.22g；磷酸二氢钾0.06g；硫酸钠0.22g；硫酸镁0.02g；碳酸钠0.06g；醋酸钠0.02g；酵母粉0.06g；玉米浆0.12g；原油10g；该富集培养基的pH值为7.5。

富集琼脂培养基：蒸馏水100mL(即100g)；氯化铵0.08g；硝酸钠0.16g；磷酸二氢钾0.04g；硫酸钠0.16g；硫酸镁0.01g；碳酸钠0.04g；醋酸钠0.01g；酵母粉0.04g；玉米浆0.08g；琼脂2.0g；该富集培养基的pH值为7.5。

步骤2，将步骤1所得以原油为碳源的菌株分别接种到含有原油105℃灭菌30min的发酵培养基和大豆酪蛋白(TSA)培养基，培养基的装液量为250mL三角瓶装液量100mL。在温度58℃、转速200rpm(转/min)的摇床中振荡分别培养72小时和7天(d)，测定发酵液表面张力和原油的粘度。通过检测菌株的原油乳化降粘能力，获得乳化原油较好的菌株BLG74，其发酵液表面张力为32.02～34.51mN/m，原油粘度降粘率为35.6～39.5％。

所用发酵培养基配方为：

蒸馏水100mL(即100g)；氯化铵0.12g；硝酸钠0.22g；磷酸氢二钾0.06g；硫酸镁0.012g；氯化钠1.2g；酵母粉0.3g；玉米浆0.6g；该发酵培养基的pH值为7.5。

所用大豆酪蛋白(TSA)培养基配方为：

蒸馏水100mL(即100g)；NaCl 0.6g；大豆蛋白胨0.6g；酪蛋白胨1.2g；pH7.5。

所筛的土壤堆肥芽孢杆菌(Compostibacillus humi)BLG74在不含原油的大豆酪蛋白琼脂培养基或固体发酵培养基上生长良好，菌落呈乳黄色圆形，大小不一，直径3～4mm，表面湿润，边缘平整。菌株BLG74的细胞为杆状，大小0.4～0.5μm×2～5μm，产芽孢(菌落和菌体形态见附图1)，革兰氏染色为阳性，兼性厌氧生长。菌株生长温度为37～60℃，pH5～9，NaCl浓度0～7％(w/v)。最适生长条件生长温度为45℃，pH 7.5，NaCl浓度3％(w/v)。

实施例2

本实施例提供一种土壤堆肥芽孢杆菌基因提取和16S rRNA系统发育树的构建方法，包括以下步骤：

步骤1，将菌株BLG74接种到105℃灭菌30min的发酵培养基中，在45℃、120r/min恒温摇床上培养24h获得菌株BLG74的母液。发酵培养基配方为：

油藏产出水100ml(即100g)；氯化铵0.1g；硝酸钠0.2g；磷酸氢二钾0.05g；硫酸镁0.01g；氯化钠0.1g；酵母粉0.25g；玉米浆0.5g；该发酵培养基的pH值为7.5。

步骤2，将步骤1中的发酵液在10000g高速离心机中离心30min，得到菌株BLG74沉淀，将离心收集后的菌株BLG74沉淀用MP的试剂盒SPIN Kit for Soil(MPBiomedicals LLC,Solon,OH,USA)提取总DNA，按照说明操作，所得该菌株的基因组置于-20℃保存。

步骤3，将步骤2中的菌体基因进行进行PCR扩增，使用Qubit双链DNA定量检测试剂盒(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)对提取的DNA进行定量和质量监控，采用引物前导链(forward chain)(5′-GTGYCAGCMGCCGCGGTA-3′)和滞后链(reverse chain)(5′-CTTGTGCGGKCCCCCGYCAATTC-3′)扩增16S rRNA基因V4-V5区。

步骤4，利用Illumina MiSeq高通量测技术对步骤2中的16S rRNA的基因序列进行测定，菌株BLG74的16S rRNA基因序列含有1387bp，其GenBank登录号KT246122，其16S rRNA基因序列与GenBank中的序列进行比对，发现与堆肥芽孢杆菌属成员具有较高的序列相似性。利用Neighbor-Joining方法对构建的系统发育树(见图2)表明为堆肥芽孢杆菌属的新成员，与土壤堆肥芽孢杆菌(Compostibacillus humi)DX-3的16S rRNA(JX274434)具有99.6％相似性，说明二者为同源性，且为不同于土壤堆肥芽孢杆菌模式菌DX-3的新菌株，命名为土壤堆肥芽孢杆菌(Compostibacillus humi)BLG74。

实施例3

本实施例提供一种土壤堆肥芽孢杆菌(Compostibacillus humi)BLG74原油乳化降粘试验的效果，包括以下步骤：

步骤1，将菌株BLG74接种到105℃灭菌30min的发酵培养基中，在45℃、120rpm恒温摇床上培养24h获得菌株BLG74的母液。

步骤2，将菌株BLG74的接种母液按照1％(w/v)的用量接种于添加5g原油105℃灭菌30min的100mL的发酵培养基中，发酵培养基配方为：

蒸馏水100mL(即100g)；氯化铵0.08g；硝酸钠0.18g；磷酸氢二钾0.03g；硫酸镁0.008g；氯化钠0.8g；酵母粉0.2g；玉米浆0.3g；该发酵培养基的pH值为7.5。

在58℃条件下培养3d，如图3所示，原油明显被乳化，而未接菌株BLG74的对照培养基中原油未见乳化，并测定微生物作用后的的乳化液表面张力，实验结果见表1。

步骤3，将菌株BLG74的接种母液按照1％(w/v)的用量接种于加有5g原油105℃灭菌20min的大豆酪蛋白(TSA)培养基中，大豆酪蛋白(TSA)培养基配方为：

蒸馏水100mL(即100g)；NaCl 0.4g；大豆蛋白胨0.4g；酪蛋白胨0.8g；pH7.5。

于58℃条件下培养3d，如图4所示，原油明显被乳化，而未接菌株的对照培养基中原油未见乳化，测定乳化液表面张力和乳化能力，结果见表1。

步骤4，将菌株BLG74的接种母液按照1％(w/v)的用量分别接种于加有50g原油105℃灭菌20min的100mL的发酵培养基和大豆酪蛋白(TSA)培养基中，于58℃条件下培养7d后的测定原油粘度，结果见表1。

测定表面张力采用JYW-200表界面张力仪(河北省承德市鼎盛试验机公司)，将培养72小时后的样品去除原油，取发酵液测定表面张力。

测定培养液的乳化能力：在室温25℃下，将培养72小时后的发酵培养基4mL培养液与1mL液体石蜡置于10mL离心管中，剧烈振荡1min后静置24小时，乳化层略有分层(请参见图5)，乳化力大于90％。

原油粘度测定采用DV-III+pro布氏旋转黏度计，先将原油加热到50℃充分融化后用离心机在2000rpm条件下离心20min去除游离水，在50℃、6.0rpm条件下恒温10min后测定原油的黏度。

表1乳化降粘实验结果

由实施例3可知，本方面提供一种土壤堆肥芽孢杆菌(Compostibacillus humi)BLG74对原油具有乳化降粘的作用。

实施例4

本实施例提供一种土壤堆肥芽孢杆菌(Compostibacillus humi)BLG74降解原油的实验效果，包括以下步骤：

步骤1，菌株BLG74接种到105℃灭菌30min的发酵培养基中，在45℃、120r/min恒温摇床上培养24h获得菌株BLG74的母液。

步骤2，分别将100mL的发酵培养基和大豆酪蛋白(TSA)培养基加到250mL三角瓶中，并分别添加10g原油，然后在105℃灭菌30min。

步骤3，将菌株BLG74接种母液按1％(w/v)接种量分别接种于灭菌的发酵培养基或大豆酪蛋白(TSA)培养基中，58℃、120rpm条件下培养，以不接种菌液的样品作为对照。发酵培养基和大豆酪蛋白(TSA)培养基配方分别为：

蒸馏水100mL(即100g)；氯化铵0.1g；硝酸钠0.2g；磷酸氢二钾0.05g；硫酸镁0.01g；氯化钠1.0g；酵母粉0.25g；玉米浆0.5g；该发酵培养基的pH值为7.5。

蒸馏水100mL(即100g)；NaCl 0.5g；大豆蛋白胨0.5g；蛋白胨1.0g；该TSA培养基的pH为7.5。

步骤4，将步骤3中的实验样品培养20d后，向培养液中加入20mL石油醚，充分震荡后，转移到分液漏斗中，静置后收集上层溶液，并将其置于已称重的50mL离心管中。

步骤5，再取10mL石油醚冲洗三角瓶，将冲洗液转移到分液漏斗中，静置后收集上层溶液，并将其置于步骤4中的50mL离心管中。

步骤6，再利用10mL石油醚冲洗分液漏斗，将冲洗液放置于步骤5中50mL离心管中。

步骤7，将步骤6中已称重的50mL离心管中的溶液置于68℃的条件下蒸发掉石油醚，直至残留的石油组分干燥至恒重，称重。石油的降解率计算公式如下：H＝(m₁－m₂)/m₁×100％

式中：H为降解菌对石油的降解率(％)；m₁为对照样品的残油质量(g)；m₂为降解后的残油质量(g)。

菌株BLG74在含10g原油的发酵培养基培养20天后，m₁为9.95g，m₂为5.89g，原油降解率为40.8％。在含10g原油的大豆酪蛋白(TSA)培养基培养20天后，m₁为10g，m₂为3.88g，原油降解率为61.2％。

实施例5

本实施例提供一种土壤堆肥芽孢杆菌(Compostibacillus humi)BLG74与原油作用后原油正构烷烃的解效果，包括以下步骤：

步骤1，菌株BLG74接种到105℃灭菌30min的发酵培养基中，在45℃、120r/min恒温摇床上培养24h获得菌株BLG74的母液。

步骤2，将菌株BLG74的接种母液按1％(w/v)接种于105℃灭菌30min含有5g原油的100mL的发酵培养基中，发酵培养基配方为：

蒸馏水100mL(即100g)；氯化铵0.1g；硝酸钠0.2g；磷酸氢二钾0.05g；硫酸镁0.01g；氯化钠1.0g；酵母粉0.25g；玉米浆0.5g；该发酵培养基的pH值为7.5。

于58℃条件下培养7d，并做不添加菌液的样品作为空白对照。

步骤3，利用GC-112A气相色谱仪对微生物作用前后原油组分进行测定分析。

色谱柱：PEG-20M毛细管色谱柱，30m×0.25mm×0.33μm。

气相色谱条件：载气99.99％氮气。进样口温度300℃。柱箱温度初温40℃，升温速率2℃/分钟，温度达到200℃后采用6℃/min的升温速率并一直升温到290℃，保持20min，分流进样，分流比10:1，进样量1μL，载气N₂流速1.0mL/min。

菌株BLG74作用前后原油组分分析结果见图6和图7。菌株BLG74作用后原油长链烃(C20～C34)(重质组分)的相对含量降低，轻质组分增加(见图8)，菌株BLG74作用后可以提高原油的流动性。

实施例6

本实施例提供一种土壤堆肥芽孢杆菌(Compostibacillus humi)BLG74生物气测定，包括以下步骤：

步骤1，菌株BLG74接种到105℃灭菌30min的发酵培养基中，在45℃、120rpm恒温摇床上培养24h获得菌株BLG74的发酵母液。

步骤2，将菌株BLG74的接种母液1％(w/v)接种于发酵培养基中，并将实验样品置于厌氧培养瓶中，连接气体收集袋，发酵培养基配方为:

蒸馏水100mL(即100g)；氯化铵1.0g；硝酸钠0.2g；磷酸氢二钾0.05g；硫酸镁0.01g；氯化钠1.0g；酵母粉0.25g；玉米浆0.5g；该发酵培养基的pH值为7.5。

于58℃条件下培养7d，培养过程中利用气体收集袋对产生的气体进行收集和测量，共收集气体280mL。

步骤3，对步骤1中收集到的气体，利用HP6890Plus四阀五柱气相色谱仪对气进行气体组分分析。气体组分测定结果见表2。

测定条件为：柱温50℃，进样口温度100℃，载气为氮气。

表2气体组分分析结果

菌株BLG74产生的生物气体能够增加地层压力，部分气体溶于原油使其膨胀，降低原油粘度，改善其流动性，从而提高原油的采收率。

实施例7

以实施例3中步骤1获得的母液为例，本实施例提供一种土壤堆肥芽孢杆菌(Compostibacillus humi)BLG74室内物模试验，该菌株可以以原油为唯一碳源生长代谢，降解原油，并且提高原油采收率的幅度，包括以下步骤：

步骤1，利用Φ2.5×100cm的岩心管，进行人工填砂，岩心渗透率为43.5×10^-3m²、孔隙度为31.8％、含油饱和度为82.56％，开展土壤堆肥芽孢杆菌(Compostibacillushumi)BLG74提高采收率的物模试验。

步骤2，利用步骤1制备的岩心首先开展水驱试验，直至含水98％，测定水驱采收率为42.35％。

步骤3，然后进行微生物工作液驱，微生物工作液为菌株BLG74的母液(来自实施例3中步骤1获得的母液)1％(w/v)接种于105℃灭菌30min的发酵培养基中，于58℃、转速120rpm的摇床中振荡培养36小时后获得，发酵培养基配方为：

油藏产出水，100mL(即100g)；氯化铵0.1g；硝酸钠0.2g；磷酸氢二钾0.05g；硫酸镁0.01g；氯化钠1.0g；酵母粉0.25g；玉米浆0.5g；该发酵培养基的pH值为7.5。

微生物工作液注入量为1.0PV。

步骤4，微驱后的岩心在60℃条件下恒温放置7d后进行水驱，直至含水98％，测定采收率为53.78％。利用土壤堆肥芽孢杆菌(Compostibacillus humi)BLG74可以在水驱基础上提高采收率11.43％。

本发明实施例提供的土壤堆肥芽孢杆菌(Compostibacillus humi)BLG74能够以原油作为唯一碳源进行生长繁殖，在37℃～60℃的温度下代谢产生脂肽类生物表面活性剂，二氧化碳、氮气和甲烷等生物气体，以及乙酸、丙酸、丁酸等小分子有机酸。在发酵培养基上菌株的乳化能力达到90％以上。在含10g原油的发酵培养基培养20天后，原油降解率为40.8％，在含10g原油的TSA培养基培养20天后，原油降解率为61.2％。在添加原油的发酵培养基和大豆酪蛋白培养基上分别培养72h和7d后表面张力和原油粘度分别降低46.94％和35.6％。利用土壤堆肥芽孢杆菌(Compostibacillus humi)BLG74可以在水驱基础上提高采收率11.43％。本发明的微生物菌株是从华北油田油井采出液中筛选得到的一株属于土壤堆肥芽孢杆菌的新菌株(Compostibacillus humi)BLG74，能够以原油为唯一碳源进行生长，使原油乳化并降低原油粘度，提高原油在油藏内的流动性，与油藏环境具有较好的适应性。

以上所述仅是为了便于本领域的技术人员理解本发明的技术方案，并不用以限制本发明。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国石油集团经济技术研究院

<120> 一种土壤堆肥芽孢杆菌和微生物菌剂及其应用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 土壤堆肥芽孢杆菌菌株（Compostibacillus humi）BLG74的16S

rRNA基因的前导链

<400> 1

gtgycagcmg ccgcggta 18

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 土壤堆肥芽孢杆菌菌株（Compostibacillus humi）BLG74的16S

rRNA基因序列的滞后链

<400> 2

cttgtgcggk cccccgycaa ttc 23

<210> 3

<211> 1387

<212> DNA

<213> 土壤堆肥芽孢杆菌菌株（Compostibacillus humi）BLG74的16S rRNA基因序列

<400> 3

ctaactgatt ccttcgggat gacgttagtg gatctagcgg cggacgggtg agtaacacgt 60

gggcaacctg cctgtaagac cgggataact tgcggaaacg tgagctaata ccggataatg 120

atttctgccg catgacagga atctgaaaga cggcgcaagc tgtcacttac agatgggccc 180

gcggcgcaat agctagttgg tggggtaacg gcctaccaag gcgacgatgc gtagccgacc 240

tgagagggtg atcggccaca ctgggactga gacacggccc agactcctac gggaggcagc 300

agtagggaat cttccgcaat ggacgaaagt ctgacggagc aacgccgcgt gagcgaagaa 360

ggtcttcgga tcgtaaagct ctgttgtcag ggaagaacaa gtacgagagt aactgctcgt 420

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cgtaggtggc aagcgttgtc cggaattatt gggcgtaaag cgcgcgcagg cggtccttta 540

agtctgatgt gaaagcccgc ggcttaaccg cggagggtca ttggaaactg gaggacttga 600

gtgcagaaga ggagagtgga attccacgtg tagcggtgaa atgcgtagag atgtggagga 660

acaccagtgg cgaaggcgac tctctggtct gtaactgacg ctgaggcgcg aaagcgtggg 720

gagcaaacag gattagatac cctggtagtc cacgccgtaa acgatgagtg ctaggtgtta 780

gggggtttcc gccccttagt gctgaagtta acgcattaag cactccgcct ggggagtacg 840

gccgcaaggc tgaaactcaa aagaattgac gggggcccgc acaagcggtg gagcatgtgg 900

tttaattcga agcaacgcga agaaccttac caggtcttga catcctctga ccaccctaga 960

gatagggctt tcccttcggg gacagagtga caggtggtgc atggttgtcg tcagctcgtg 1020

tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc ttgagattag ttgccagcat 1080

tcagttgggc actctagtct gactgccgca gacaatgcgg aggaaggtgg ggatgacgtc 1140

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tacgttcccg ggccttgtac acaccgcccg tcacaccacg agagttggta acacccgaag 1380

tcggtga 1387