具有抗肿瘤活性的EGFR酪氨酸激酶抑制剂BF

摘要

本发明公开了具有抗肿瘤活性的EGFR酪氨酸激酶抑制剂BF

说明书

技术领域

本发明涉及嘧啶丙烯酰胺类化合物，尤其涉及具有抗肿瘤活性的EGFR>3-AZD9291及其制备方法，本发明还涉及该药作为抗肿瘤剂的应用，属于生物医药领域。

背景技术

目前发现的EGFR酪氨酸激酶(EGFR TK)可以催化ATP的高能磷酸键转移到EGFR的数个酪氨酸位点，使其磷酸化，从而激活下游的PI3K/Akt、Ras/MAPK等信号通路，促进细胞进生长增殖、代谢，抑制细胞凋亡。细胞中EGFR过度表达和突变时，会阻碍细胞程序死亡，使细胞的生长调节失控，而获得无限增殖和侵袭能力，即发展成为恶性肿瘤细胞。EGFR TKI通过与ATP竞争胞内酪氨酸激酶的结合位点,阻止受体内酪氨酸的自身磷酸化,抑制EGFR酪氨酸激酶激活，从而抑制肿瘤细胞生长、加速肿瘤细胞凋亡，抑制血管生成和肿瘤细胞浸润、转移。小分子EGFR TKI的基本结构为喹唑啉胺。EGFR TKI可分为：1)可逆性TKI主要有：吉非替尼(gefitinib)，厄洛替尼(erlotinib)，拉帕替尼(Lapatinib)，2)不可逆性TKI主要有：阿法替尼(Afatinib)，达可替尼(Dacomitinib)。目前，可逆性和不可逆性EGFR TKI对突变EGFR非小细胞肺癌短时间内具有显著的疗效，但最终均因产生获得性耐药而导致治疗失败，并没有明显延长患者的生存期。因此，开发和研制具有更强、更持久抗肿瘤活性的新型EGFR TKI将可能为突变EGFR非小细胞肺癌患者带来生机。

发明内容

本发明的目的之一是提供全新的表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR TKI)—BF₃-AZD9291及其制备方法。

本发明的目的之二是提供BF₃-AZD9291在促进肿瘤细胞凋亡中的用途，其机制是通过抑制表皮生长因子受体酪氨酸激酶磷酸化从而促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤血管生成、侵袭和转移。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明通过对不可逆性分子靶向抗癌药物—osimertinib(AZD9291)化学结构进行优化和改进，得到了全新EGFR>3-AZD9291，其由于引入两性离子有机三氟硼酸盐基团，以提高抑制剂亲水性，降低肝脏的摄取率，提高肿瘤摄取率和更小的毒副作用，同时对突变EGFR非小细胞肺癌具有较强抑制活性，并阐明其机制是通过抑制肿瘤细胞表皮生长因子受体酪氨酸激酶磷酸化，阻碍下游信号通路活化，从而抑制肿瘤细胞生长、增殖，促进肿瘤细胞凋亡。

本发明提供的一种表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂或其可药用的盐，命名为BF₃-AZD9291，所述的表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂具有式I所示的结构:

当然，可以制备本发明化合物酸加成的盐，这些盐包括在本发明之中。

本发明化合物的酸加成盐优选为药学上可接受的，与适当的酸(例如盐酸、醋酸、硫酸)形成无毒的盐，除了药物上可接受的盐以外，其它的盐也包括在本发明之中。

进一步的，本发明还提出了所述的表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂或其可药用的盐在制备促进肿瘤细胞凋亡的药物中的用途。

其中，所述的促进肿瘤细胞凋亡是通过抑制表皮生长因子受体酪氨酸激酶磷酸化而实现的。

其中，优选的，所述的肿瘤细胞为EGFR突变的非小细胞肺癌细胞。

更进一步的，本发明还提出了一种制备以上所述的表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂或其可药用的盐的方法，包括以下步骤：

(1)氮气保护下将(2-氯嘧啶-4-基)-1-甲基-3a,7a-二氢-1H-吲哚，4-氟-2-甲氧基-5-硝基苯胺和对甲苯磺酸混合于2-戊醇中，100-110℃下机械搅拌反应2-3h，冷却到室温后，抽滤，滤饼用2-戊醇洗涤，抽干得到浅棕色固体，通过柱层析分离提纯，采用甲醇和二氯甲烷按照体积比1:100混合得到的洗脱剂洗脱，最终得到浅黄色针状固体，即化合物一；

(2)将化合物一，N,N,N'-三甲基乙二胺和N,N-二异丙基乙胺混溶于DMF溶剂中搅拌，115-125℃反应3-5h，冷却室温后将溶液倒入冰水中稀释，用二氯甲烷萃取三次，合并有机相并用饱和食盐水洗三次，将有机相采用无水硫酸钠干燥，抽滤，旋干后通过柱层析分离提纯，采用甲醇和二氯甲烷按照体积比3:100混合得到的洗脱剂洗脱，最终得到红棕色针状固体，即化合物二；

(3)将化合物二，铁粉和氯化铵加入到圆底烧瓶中，与烧瓶中的乙醇和水的混合溶液混溶，加热回流反应2-4h，冷却抽滤，将滤液浓缩旋干，通过SCX柱分离提纯，洗脱液为甲醇氨溶液，得到棕色固体，即化合物三；

(4)将化合物三和二异丙基乙胺溶于二氯甲烷中，在冰盐浴下搅拌滴加丙烯酰氯的二氯甲烷溶液，反应0.5-1.5h，然后室温下加氢氧化钠水溶液继续反应3-5h，抽滤，收集固体干燥得到产物，即化合物四；

(5)在室温氮气保护下将化合物四置于圆底烧瓶中，加入无水四氢呋喃溶解；另取圆底烧瓶中加入无水四氢呋喃和碘甲基硼酸频哪醇酯，并反复冲洗枪头，将碘甲基硼酸频哪醇酯四氢呋喃溶液缓慢加入化合物四的溶液里，搅拌10-14h后抽滤得到白色固体，即化合物五；

(6)将化合物五放入圆底烧瓶，依次加入KHF₂水溶液，HCl水溶液，去离子水和DMF溶液，在40-50℃下反应2h，冷却后加入NH₄OH水溶液猝灭，用滴管滴加到小硅胶柱上分别用水和乙酸乙酯洗涤，收集洗涤液用无水乙醚萃取，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤旋干，得到固体产物，即为式I所示的表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂。

本发明通过对osimertinib(AZD9291)化学结构进行优化和改进，得到了全新EGFR>3-AZD9291，经生物活性评价，本发明EGFR>3-AZD9291能够有效抑制肿瘤细胞的增殖，具有优秀的抗肿瘤活性，在临床上可作为抗肿瘤剂应用。

本发明还提供了一种抗肿瘤的药物组合物，该药物组合物由有效量的本发明化合物或其可药用的盐与药学上可接受的载体配合而成，也即是说，将药学上可接受用量的本发明化合物与药学上可接受的载体或稀释剂配合后，按本领域常规的制剂方法将其制备成任意一种适宜的药物组合物。将有效量的本发明化合物与药学上可接受的载体或稀释剂配合后，按本领域常规的制剂方法将其制备成任意一种适宜的药物组合物。通常该组合物适合于口服给药和注射给药，也适合其他的给药方法。该组合物可以是片剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、锭剂、栓剂，或口服液等液体制剂形式。根据不同的给药方法，本发明药物组合物可以含有0.1％-99％重量，优选10-60％重量的本发明化合物。

附图说明

图1为本发明EGFR TKI-BF₃-AZD9291化合物的分离路线图；

图2为BF₃-AZD9291的高效液相色谱(HPLC)结果；

图3为BF₃-AZD9291的核磁图谱结果；

(1)1H-NMR；(2)19F-NMR

图4为BF₃-AZD9291的质谱结果；

图5为通过MTT法测定BF₃-AZD9291处理24小时后的细胞活力结果；

图6为通过MTT法测定BF₃-AZD9291处理48小时后的细胞活力结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1EGFR>3-AZD9291的制备

所述的BF₃-AZD9291的分子结构式如式I所示:

制备流程图如图1所示，具体制备方法如下：

(1)氮气保护下将50g(2-氯嘧啶-4-基)-1-甲基-3a,7a-二氢-1H-吲哚，38.03g 4-氟-2-甲氧基-5-硝基苯胺和37.09g对甲苯磺酸混合于580ml 2-戊醇，105℃下机械搅拌反应2.5h，冷却到室温后，抽滤，滤饼用2-戊醇洗涤，抽干得到浅棕色固体，通过柱层析分离提纯，采用甲醇和二氯甲烷按照体积比1:100混合得到的洗脱剂洗脱，最终得到浅黄色针状固体即化合物一，产率85％；

(2)将65g化合物一，19.65gN,N,N'-三甲基乙二胺和26.93N,N-二异丙基乙胺混溶于600mlDMF溶剂中搅拌，120℃反应4h，冷却室温后将溶液倒入冰水中稀释，用50ml二氯甲烷萃取三次，合并有机相并用饱和食盐水洗三次，将有机相加无水硫酸钠干燥，抽滤，旋干后通过柱层析分离提纯，采用甲醇和二氯甲烷按照体积比3:100混合得到的洗脱剂洗脱，最终得到红棕色针状固体，即化合物二，产率62％；

(3)将3.22g化合物二，9.62g铁粉和氯化铵加入到圆底烧瓶中，与烧瓶中的120mL乙醇和30ml水的混合溶液混溶，加热回流反应3h，冷却抽滤，将滤液浓缩旋干，通过SCX柱分离提纯，洗脱液为0.35M的甲醇氨溶液，得到棕色固体，即化合物三，产率85％；

(4)将1.7g化合物三和0.73ml二异丙基乙胺溶于50ml二氯甲烷中，在冰盐浴下搅拌滴加0.34ml丙烯酰氯的1ml二氯甲烷溶液，反应1h，然后室温下加30ml 0.5g氢氧化钠水溶液继续反应4h。抽滤，收集固体干燥得到产物，即化合物四，产率39％；

(5)室温下氮气保护将9.2mg化合物四置于25ml圆底烧瓶中，加入2ml无水四氢呋喃溶解；另取25ml圆底烧瓶中加入2ml无水四氢呋喃和3μl的碘甲基硼酸频哪醇酯，并反复冲洗枪头。将碘甲基硼酸频哪醇酯四氢呋喃溶液在5min左右缓慢加入化合物四溶液里，搅拌12h后抽滤得到白色固体，即化合物五，产率49％；

(6)将化合物五放入圆底烧瓶，依次加入3M，300μl的KHF₂水溶液，4M，300μl的HCl水溶液，200μl去离子水和600μl>4OH水溶液猝灭，用滴管滴加到小硅胶柱上用分别用水和乙酸乙酯洗涤，收集洗涤液用无水乙醚萃取，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤旋干，得到固体产物，即化合物六，即所述的表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂BF₃-AZD9291，产率85％。

BF₃-AZD9291的高效液相色谱(HPLC)结果如图2所示，从HPLC结果可以看出，本发明制备得到的BF₃-AZD9291药物纯度单一，无杂质。BF₃-AZD9291的核磁图谱以及质谱结果分别如图3以及图4所示。

实施例2AZD9291和BF₃-AZD9291对EGFR>

1、供试化合物：AZD9291和BF₃-AZD9291(由实施例1方法制备)

2、试验方法：

取对数生长期的EGFR二次突变的非小细胞肺癌细胞H1975细胞，以10000个/孔接种于96孔板中，于37℃5％CO₂条件下培养24小时后，给药组加入供试化合物BF₃-AZD9291，使其终浓度分别为0.0125、0.125、1.25、2.5、5、10、20、40μM,空白对照组为0.08％二甲基亚砜，于37℃5％CO₂条件下培养24小时和48小时后，采用MTT比色法，于波长490nm处测定吸光度OD值。根据OD值计算药物对肿瘤细胞生长的半数抑制率(IC50)。

3、试验结果

图5为通过MTT法测定BF₃-AZD9291处理24小时后的细胞活力结果，从图5结果可以看出BF₃-AZD9291可较强地抑制H1975细胞生长，IC50＝0.019±0.00439μM，说明BF₃-AZD9291与原型药AZD9291相比(IC50＝0.0208±0.00616μM)，对EGFR>

图6为通过MTT法测定BF₃-AZD9291处理48小时后的细胞活力结果，从图6结果可以看出BF₃-AZD9291可较强地抑制H1975细胞生长，IC50＝0.014063±0.003716μM，说明BF₃-AZD9291与原型药AZD9291相比(IC50＝0.017333±0.004006μM)，对EGFR>

以上结果说明，本发明化合物BF₃-AZD9291与AZD9291相比，对二次突变的非小细胞肺癌细胞系H1975具有更强的抑制增殖作用。