基于石墨烯量子点的荧光淬灭法对植物根表吸附杂环多环芳香烃的原位活体定量分析方法

摘要

本发明提供了基于石墨烯量子点的荧光淬灭法对植物根表吸附杂环多环芳香烃的原位活体定量分析方法。本发明方法能够有效避免激光诱导纳秒时间分辨法(LITRF)的紫外光在测定植物根表皮吸附PAHs时引起的光损伤，并实现对于吸附于植物根表皮N/O/S杂环多环芳烃的原位活体定量测定；同时，本发明方法的灵敏度高于传统的双光子激光共聚焦荧光显微法、固体表面荧光光谱法和光纤荧光法，能够与激光诱导纳秒时间分辨荧光光谱法达到相同数量级。

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测领域，具体而言，涉及基于石墨烯量子点的荧光淬灭法对植物根表吸附杂环多环芳香烃的原位活体定量分析方法。

背景技术

多环芳烃(Polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)作为一种具有致癌性、诱变性和毒性效应和内分泌干扰作用的持久性有机污染物，其在环境中的迁移、转化行为引起越来越广泛的关注，植物根吸收PAHs(包括N/O/S 杂环PAHs)是其进入植物体，进而通过食物链危害其它生物的重要途径。现有的研究证实，约40％的PAHs富集于植物根表皮而并未进入植物体组织内部，这会引起进一步危害。因此，为考察植物根吸收N/O/S杂环PAHs 的潜在危害，需准确定量在植物根表皮及组织内部N/O/S杂环PAHs含量。

色谱-质谱分析法作为植物体中N/O/S杂环PAHs最为有效的测定方法，具有灵敏度高、选择性好等特定，但其破坏性的萃取方式使该方法无法定量分析植物根表皮及组织内部N/O/S杂环PAHs的含量。为解决该问题，研究人员基于荧光光谱具有原位分析N/O/S杂环PAHs的能力，结合固体表面荧光光谱技术、光纤荧光光谱技术、激光诱导纳秒时间分辨技术及双光子激光共聚焦荧光显微技术，建立起了对应的植物根表皮N/O/S杂环PAHs的原位定量或可视化分析方法。

然而，固体表面荧光光谱技术和光纤荧光光谱技术无法克服植物根表的自发荧光信号的干扰，N/O/S杂环PAHs的检出限和选择性较差，无法满足实际测定的需要。

为此，基于植物体自发荧光信号寿命远小于N/O/S杂环PAHs的荧光信号的特性，研究人员结合激光诱导纳秒时间分辨荧光光谱技术扣除短寿命荧光信号的干扰，实现了植物根表皮N/O/S杂环PAHs的原位测定。然而，该方法采用266nm紫外光作为激发光源，紫外激光光子能量较高易于产生羟基自由基，进而引起植物正常生理状态改变，而此项改变将直接引起所得的N/O/S杂环PAHs在植物根表皮和组织内部的分布与实际情况不符，无法实现植物根表皮和组织内部N/O/S杂环PAHs的原位活体测定。

为了解决高光子能量光源所引发的问题，部分科研工作者使用双光子激光共聚焦荧光显微技术，该技术不使用紫外光作为激发光源，有效避免了相关的负面效应，实现了N/O/S杂环PAHs的原位可视化观测，但截至目前，该技术尚无法进行植物根表皮N/O/S杂环PAHs的定量测定。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种基于石墨烯量子点的荧光淬灭法对植物根表吸附杂环多环芳香烃的原位活体定量分析方法，本发明方法能够避免传统方法对于活体植物的损害，并实现吸附于植物根部的杂环多环芳香烃的定量检测。

一种基于石墨烯量子点的荧光淬灭法对植物根表吸附杂环多环芳香烃的原位活体定量分析方法，包括如下步骤：

(a)将模型植物的根部清洗后干燥，浸没于石墨烯量子点溶液中；取出后，选取特定植物根区域，在表皮涂覆杂环多环芳香烃溶液，待溶液挥发后，进行荧光光谱检测，得出荧光淬灭常数，并建立荧光淬灭常数与吸附于植物根表皮的杂环多环芳香烃浓度的标准曲线；

(b)将待检测植物根部清洗后干燥，浸没于石墨烯量子点溶液中，然后选取与模型植物相同的植物根区域进行荧光光谱检测，得出荧光淬灭常数，并根据标准曲线得出吸附于待检测植物根表皮的杂环多环芳香烃浓度。

优选的，本发明所述的基于石墨烯量子点的荧光淬灭法对植物根表吸附杂环多环芳香烃的原位活体定量分析方法步骤(a)中，所述模型植物为在无污染基质中生长的植物。

优选的，本发明所述的基于石墨烯量子点的荧光淬灭法对植物根表吸附杂环多环芳香烃的原位活体定量分析方法步骤(a)中，所述清洗为分别采用自来水和超纯水对模型植物的根部进行清洗；和/或，步骤(b)中，所述清洗为分别采用自来水和超纯水对待检测植物的根部进行清洗。

优选的，本发明所述的基于石墨烯量子点的荧光淬灭法对植物根表吸附杂环多环芳香烃的原位活体定量分析方法步骤(a)中，所述特定植物根区域包括分生区和伸长区。

优选的，本发明所述的基于石墨烯量子点的荧光淬灭法对植物根表吸附杂环多环芳香烃的原位活体定量分析方法，步骤(a)中，石墨烯量子点的最大荧光激发波长和发射波长分别为350nm和462nm；和/或，步骤 (b)中石墨烯量子点的最大荧光激发波长和发射波长分别为350nm和 462nm。

优选的，本发明所述的基于石墨烯量子点的荧光淬灭法对植物根表吸附杂环多环芳香烃的原位活体定量分析方法，步骤(a)中，石墨烯量子点的直径不小于5nm；和/或，步骤(b)中石墨烯量子点的直径不小于5 nm。

优选的，本发明所述的基于石墨烯量子点的荧光淬灭法对植物根表吸附杂环多环芳香烃的原位活体定量分析方法，步骤(a)中，所述石墨烯量子点溶液的用量为5～15ml，浓度为80～150mg>-1；和/或，步骤(b)>-1。

优选的，本发明所述的基于石墨烯量子点的荧光淬灭法对植物根表吸附杂环多环芳香烃的原位活体定量分析方法，步骤(a)中，所述石墨烯量子点溶液的用量为10ml，浓度为100mg>-1；和/或，步骤(b)中，所述石墨烯量子点溶液的用量为10ml，浓度为100mg>-1。

优选的，本发明所述的基于石墨烯量子点的荧光淬灭法对植物根表吸附杂环多环芳香烃的原位活体定量分析方法，步骤(a)中，是以高灵敏度荧光光谱仪进行荧光光谱检测；和/或，步骤(b)中，是以高灵敏度荧光光谱仪进行荧光光谱检测。

优选的，本发明所述的基于石墨烯量子点的荧光淬灭法对植物根表吸附杂环多环芳香烃的原位活体定量分析方法，步骤(a)中，仪器设置条件为：激发光波长350nm；发射波长扫描范围400-550nm；狭缝宽度2.00 nm；居留时间0.500ns；和/或，步骤(b)中，仪器设置条件为：激发光波长350nm；发射波长扫描范围400-550nm；狭缝宽度2.00nm；居留时间0.500ns。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明方法能够有效避免激光诱导纳秒时间分辨法(Laser induced nanosecondtime-resolved fluorescence spectra,LITRF)的紫外光在测定植物根表皮吸附PAHs时引起的光损伤，并实现对于吸附于植物根表皮N/O/S 杂环多环芳烃的原位活体定量测定；

同时，本发明方法的灵敏度高于传统的双光子激光共聚焦荧光显微法、固体表面荧光光谱法和光纤荧光法，能够与激光诱导纳秒时间分辨荧光光谱法达到相同数量级。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为不同检测方法对植物生理状态影响实验测试图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

有鉴于目前对于植物多环芳香烃吸收检测的方法所存在的无法准确的定量检测以及对植物体会带来伤害而无法进行活体检测等技术问题，本发明特提供了一种利用石墨烯量子点对植物根表皮中所吸附PAHs进行活体定量检测的方法。

石墨烯量子点的特殊性质，其在可见光激发条件下，有较强的荧光发射信号，且与有机/无机化合物结合易于产生荧光猝灭现象。基于这一原理，本发明中将石墨烯量子点与N/O/S杂环PAHs的结合作用引起的荧光猝灭现象(已证实该猝灭常数与N/O/S杂环PAHs的浓度呈线性正相关)作为依据，故此法可有效克服上述方法紫外激发光对植物体产生的负面影响、及不具备定量能力的缺陷。

具体的，本发明方法包括建立标准曲线以及根据标准曲线对待检测植物样品进行检测的步骤，具体方法参考如下：

(a)将模型植物的根部清洗后干燥；

其中，所述模型植物为与待检测植物种类相同的植物，例如所述模型植物可以为秋茄(Kandelia obovata,K.obovata)、白骨壤(Avicennia marina, A.marina)、桐花树(Aegiceras corniculatum,A.corniculatum)等；

所述模型植物优选的为在无污染基质中生长的植物，例如，可以将采集自无污染环境中生长植物的胚芽在沙床等无污染基质中培养，从而确保作为模型材料的植物不会受到任何污染；

模型植物的清洗优选的是采用自来水和超纯水依次洗涤的方法，从而除去模型植物根部的黏土、沙粒和沉积物等；然后优选的采用风干的方式将清洗后的根部进行干燥；

接着，在干燥后，选取模型植物的特定植物根区域，优选的是选择分生区和伸长区，作为进一步用于荧光检测的区域；

然后将模型植物的根部浸没于石墨烯量子点溶液中；

优选的，所述石墨烯量子点溶液中，所含石墨烯量子点的直径不小于 5nm，其大荧光激发波长和发射波长分别为350nm和462nm；

同时，所用石墨烯量子点溶液的浓度为80～150mg>-1，其用量为5～ 15ml；优选的，所用石墨烯量子点溶液的浓度为100mg>-1，用量为10>

优选的将植物根部浸没于石墨烯量子点溶液30min后，将其取出，然后向植物根的表皮涂覆杂环多环芳香烃溶液，特别是要对分生区和伸长区进行涂覆；

所述杂环多环芳香烃溶液中，作为模型杂环多环芳香烃的化合物即为待检测植物中需要检测的杂环多环芳香烃，例如二苯并噻吩、咔唑，二苯并呋喃等，而这些化合物溶解所用溶剂优选的为丙酮等易挥发溶剂；

同时，为了建立光淬灭常数与根表皮的杂环多环芳香烃浓度对应的标准曲线，本发明方法中，进一步的是以不同浓度的杂环多环芳香烃溶液在相同条件下进行多组平行实验，从而获取相应的标准曲线和线性对应关系；

待溶液挥发后，对植物根进行荧光光谱检测，并优选的采用高灵敏度荧光光谱仪进行检测，特别是对于涂覆有杂环多环芳香烃溶液的根部分生区和伸长区进行检测；

仪器设置条件优选的为：激发光波长350nm；发射波长扫描范围 400-550nm；狭缝宽度2.00nm；居留时间0.500ns；

根据荧光检测结果得出荧光淬灭常数，然后结合Stern-Volme方程 (F₀/F＝1+K_SV*C_PAHs)构建猝灭常数与吸附于植物根表皮的杂环多环芳香烃浓度关系，获得标准曲线、线性范围、相对标准偏差及相关系数等分析方法特性；

(b)将待检测植物根部清洗后干燥，浸没于石墨烯量子点溶液中，然后选取与模型植物相同的植物根区域进行荧光光谱检测，得出荧光淬灭常数，并根据标准曲线得出吸附于待检测植物根表皮的杂环多环芳香烃浓度；

待测植物的清洗、干燥以及石墨烯量子点溶液中浸没和荧光光谱检测步骤条件与所用试剂均保持均与模型植物相同，从而保证检测结果的准确性。

由于本发明的检测方法所采用的是间接测定的方法，而且所用荧光检测的激发光能量较低，因而对于待检测植物体的伤害较小，而且不会引起植物正常生理状态的改变，适用于植物的活体检测；同时，实验数据表明，猝灭常数与吸附于植物根表皮的N/O/S杂环PAHs的浓度呈线性正相关，且具有良好的相关性，因而本发明方法也能够实现精准的定量检测。

进一步的，通过对于模型化合物的调整，使得本发明检测方法不仅能够用于吸附于植物根表皮的N/O/S杂环多环芳烃(N/O/S杂环PAHs)浓度的检测，同时也能够用于吸附于植物根表皮的多环芳烃浓度的检测。

实施例1

在福建某地自然保护区内分别收集秋茄(Kandelia obovata,K. obovata)、白骨壤(Avicennia marina,A.marina)，以及桐花树(Aegiceras corniculatum,A.corniculatum)的胚芽，然后将所得胚芽在沙床上培养12个月，得到秋茄、白骨壤以及桐花树的模型植物；

分别使用自来水和超纯水对秋茄、白骨壤，以及桐花树根进行清洗，以除去黏土、沙粒和沉积物，待自然风干后，选取包括分生区和伸长区的特定区域，作为进一步荧光检测区域；

将植物根浸没于10ml 100mg mL^-1的石墨烯量子点溶液中30min，然后取出，并以50μL移液枪分别向所选定特定区域的植物根表皮涂覆不同浓度的二苯并噻吩(DBT)、咔唑(CAR)，以及二苯并呋喃(DBF)丙酮溶液；

待丙酮溶液挥发后，以FLS 920荧光光谱仪，测定石墨烯量子点在不同浓度N/O/S杂环PAHs引入根表下的荧光光谱，计算荧光淬灭常数，并得到荧光淬灭常数与吸附于植物根表皮杂环多环芳香烃浓度的线性关系以及标准曲线，以及线性范围、相对标准偏差及相关系数等分析方法特性，结果如下表1所示：

表1.本发明方法的分析特性

^a本发明方法的检出限计算方法为三倍的相对标准偏差除以斜率；^by为荧光猝灭常数F₀/F值；^cx为在根表皮吸附N/O/S杂环PAHs的浓度。

由如上表格数据可知，荧光猝灭常数与在根表皮吸附N/O/S杂环PAHs 的浓度呈强正相关，且在较大的线性浓度范围。

实验例1

(a)有效性实验

为了验证本发明方法的有效性，进行如下实验：

分别在福建某地采集秋茄、白骨壤，以及桐花树，然后将三种植物的根部分别以自来水和超纯水洗涤三次；所有的根部都注入N/O/S杂环多环芳烃(注入浓度参见表2)，然后将植物根浸没于10ml、浓度为100mg mL^-1的石墨烯量子点溶液中30min，取出，使用FLS>

同时，采用激光诱导纳秒时间分辨法(Laser induced nanosecond time-resolved fluorescence spectra,LITRF)对同批次样品进行检测，具体操作可参见现有技术(Li,R.L.；Tan,H.D.；Zhu,Y.X.；Zhang,Y.Envion.Pollut. 2017,226,135-142)；

每组实验平行进行6次，计算6次的平均值，结果如下表2所示：

表2不同方法对于N/O/S杂环多环芳烃的检测结果

由表2的检测结果可知，本发明方法与现有技术中最为精确的LITRF 检测方法相较而言，具有相接近的DBT、CAR，以及DBF检测结果，而且检出度较高，与真实水平较为接近。

由此可见，本发明方法具有较高的准确度，能够真实反应吸附于植物根表皮N/O/S杂环多环芳烃的浓度水平，是一种有希望替代传统检测方法的新手段。

(b)检测方法对植物影响实验

对未进行如上N/O/S杂环多环芳烃注入和检测的同批次实验植物进行根细胞生理状态检测，采用Evans blue染色方法，按照染色程度区分为正常细胞、受损细胞和死细胞，并分别统计各类细胞占比；

分别对经如上本发明和LITRF法检测后的植物根进行细胞生理状态检测，采用Evans blue染色方法，按照染色程度区分为正常细胞、受损细胞和死细胞，并分别统计各类细胞占比，结果如图1所示。

由图1结果可知，未进行实验的植物体根部中，正常细胞、受损细胞和死细胞的占比分别为73.4％、21.1％和5.5％(图1中1组)；

LITRF法测定植物根表皮吸附的N/O/S杂环PAHs后使得死细胞显著增至42.6％(p<0.05)(图1中3组)；

而采用本发明方法测定植物根表皮吸附的N/O/S杂环PAHs后，三类细胞比例变化较小(p>0.05)(图1中2组)。

由此可见，本方法能够保持植物体的正常生理状态。相较于传统的 LITRF而言，本发明方法适于植物的活体检测。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。