一种识别检测甲醛的芘衍生物荧光探针分子及其制备方法和应用

摘要

本发明提出了一种识别检测甲醛的芘衍生物荧光探针分子及其制备方法和应用，该制备方法合成步骤简单，只需通过一步反应，产率较高。本发明提供的荧光探针本身在HEPES缓冲体系中没有荧光，但可与甲醛发生特异性反应，生成具有强荧光的产物，从而实现对甲醛的专一选择和定量分析。通过荧光光谱仪研究了探针B1在HEPES缓冲体系中与醛类、氨基酸类的识别特性。结果表明：探针B1对甲醛具有高效专一的选择性。该探针对甲醛的最低检出限为0.107μM，在生物分子检测领域具有广阔的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及甲醛检测剂，特别是指一种识别检测甲醛的芘衍生物荧光探针分子及其制备方法和应用。

背景技术

甲醛是一种公认的强毒性物质，对生物细胞具有极大伤害作用，长期摄入甲醛污染的食品会造成中枢神经的麻痹，进一步造成肺水肿、肝昏迷、肾衰竭等一系列危害。世界卫生组织已经确认甲醛为致畸、致癌物质，长期接触和摄入会导致基因突变。甲醛的检测方法比较多，目前常见的实验室检测方法有分光光度法和色谱法。分光光度法参照NY/T1283-2007、SC/T3025-2006、GB/T 5009.49-2008和SN/T2183-2008标准，采用乙酰丙酮测定甲醛，但是该方法结果容易受到温度和反应时间的影响。色谱法主要有高效液相色谱法和气相色谱法。这些方法灵敏度高、选择性好，但是需要复杂的前处理操作以及预浓缩处理，特别是所需仪器比较昂贵，对操作人员的技术要求比较高，目前基层实验室和检测站无法普及，故此常规的仪器检测方法不能满足现场快速筛查分析的需求。

荧光探针具有选择性好、灵敏度高、操作简便快速、对检测物损伤少等优点已被广泛应用于检测环境和生物体系中的金属阳离子、阴离子、生物体内活性小分子等方面。荧光探针是一种将分子间的相互作用转换为易识别的光学信号传递给外界的工具。荧光探针与特定目标分析物发生作用后，荧光信号会发生明显变化从而达到检测目的。本申请一种基于2-aza-Cope重排反应设计了一种荧光探针，从而实现对甲醛的特异性识别检测。

发明内容

本发明提出一种识别检测甲醛的芘衍生物荧光探针分子及其制备方法和应用，解决了现有技术中常规的甲醛检测剂不能应用于实际医疗中，制备方法复杂细胞毒性大的技术问题。

本发明的技术方案是这样实现的：

一种识别检测甲醛的芘衍生物荧光探针分子，所述芘衍生物荧光探针的结构式如下：

。

所述的识别检测甲醛的芘衍生物荧光探针分子的制备方法的合成路线为：

。

具体步骤为：

（1）将烯丙基三氟硼酸钾溶于氨甲醇溶液中，在N₂保护下，常温搅拌10-30分钟，得混合溶液；

（2）将1-芘甲醛溶于氨甲醇溶液中，加入水后，再加入到步骤（1）得到的混合溶液中，常温反应10-20小时后，经硅胶柱层析分离即得芘衍生物荧光探针分子B1。

所述步骤（1）中，氨甲醇溶液的浓度为7 mol/L，烯丙基三氟硼酸钾和氨甲醇的质量比为1：（10-60）。

所述步骤（2）中，1-芘甲醛、氨甲醇、水的质量比为（1-10）：（20-80）：1。

所述烯丙基三氟硼酸钾和1-芘甲醛的摩尔比为（2-8）:1。

所述步骤（2）中，硅胶柱层析所用洗脱剂体积比为，乙酸乙酯：石油醚=1：（3-10），芘衍生物荧光探针分子的产率为60-90%。

所述的识别检测甲醛的芘衍生物荧光探针分子，作为特异性识别细胞内甲醛的应用。

本技术方案能产生的有益效果：

（1）本申请所选用的荧光团芘具有发射波长在可见光区内、较高的荧光量子产率、细胞毒性低、原料简单易得等诸多优点。

（2）本申请的探针B1检测甲醛的机理是探针B1分子结构上烯丙氨基可以与甲醛发生特异性反应形成亚胺，亚胺在随后的2-aza-cope重排反应中水解生成具有强荧光的1-芘甲醛。

（3）本申请选用“烯丙氨基”作为甲醛的特异性反应基团，原料1-芘甲醛与烯丙基三氟硼酸醛反应生成带有烯丙氨基的探针B1，探针B1本身没有荧光，当与足量的甲醛发生反应后释放出强烈的荧光信号；本申请探针B1可以在纯的HEPES缓冲体系中对甲醛实现专一性识别，克服了其他探针检测甲醛需要大量有机溶剂参与的缺点，更有利于在生物体系中的应用。

（4）本申请探针B1对甲醛的最低检出限为0.107 μM，细胞毒性低，可以成功的应用于细胞中对外源性甲醛进行荧光成像。

附图说明

图1为本发明的荧光探针B1核磁共振氢谱图。

图2为本发明的荧光探针B1核磁共振碳谱图。

图3为本发明的荧光探针B1荧光选择性图，激发波长390 nm。

图4为本发明的荧光探针B1识别甲醛的抗干扰性图，激发波长390 nm，发射波长472 nm。

图5为本发明的荧光探针B1识别甲醛的荧光滴定图，插图为最低检测限图，激发波长390 nm，发射波长472 nm。

图6为本发明的荧光探针B1应用于细胞中对外源性甲醛进行荧光成像图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

一种识别检测甲醛的芘衍生物荧光探针分子的制备方法：

单口烧瓶中，将烯丙基三氟硼酸钾（148 mg，1 mmol）溶于12.4 mL的氨甲醇溶液（浓度为7 mol/L）, 氮气保护条件下，常温搅拌15 min。将1-芘甲醛（115 mg，0.5 mmol）溶于19.2mL的氨甲醇溶液（浓度为7 mol/L），并加入115 μL的水，将该反应液注入到烯丙基三氟硼酸钾的氨甲醇溶液中，常温反应10 h。反应完毕后，通过旋转蒸发仪减压去除溶剂得到粗产品。经硅胶柱层析分离（洗脱液为乙酸乙酯：石油醚=1:3，体积比）得到黄色固体88 mg即为产物B1，产率为65%。

核磁共振测定：1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 2.53 (q, J = 8.0 Hz, 1 H),2.63 (q, J = 6.7 Hz, 1 H), 5.07 (m, 3 H), 5.87 (m, 1 H), 8.06 (t, J = 8.0 Hz,1 H), 8.15 (s, 2 H), 8.22 (d, J = 12.0 Hz, 1 H), 8.32 (m, 4 H), 8.49 (d, J =8.0 Hz, 1 H); 13C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 44.48, 50.92, 117.45, 123.38,124.44, 124.48, 124.68, 125.23, 125.47, 126.54, 127.12, 127.60, 127.66,127.94, 129.85, 130.74, 131.39, 136.55, 141.06。高分辨质谱测定：HR-ESI-MS calcdfor C20H17N：271.1361, found 272.1143 [M+H+]，294.1246 [M+Na+]，310.0985 [M+K+]。

实施例2

一种识别检测甲醛的芘衍生物荧光探针分子的制备方法：

单口烧瓶中，将烯丙基三氟硼酸钾（148 mg，1 mmol）溶于43.4 mL的氨甲醇溶液（浓度为7 mol/L），氮气保护条件下，常温搅拌15 min。将1-芘甲醛（57.5 mg，0.25 mmol）溶于19.2 mL的氨甲醇溶液（浓度为7 mol/L），并加入12 μL的水，将该反应液注入到烯丙基三氟硼酸钾的氨甲醇溶液中，常温反应15 h。反应完毕后，通过旋转蒸发仪减压去除溶剂得到粗产品。经硅胶柱层析分离（洗脱液为乙酸乙酯：石油醚=1:6，体积比）得到黄色固体50.8 mg即为产物B1，产率为75%。

核磁共振测定：1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 2.53 (q, J = 8.0 Hz, 1 H),2.63 (q, J = 6.7 Hz, 1 H), 5.07 (m, 3 H), 5.87 (m, 1 H), 8.06 (t, J = 8.0 Hz,1 H), 8.15 (s, 2 H), 8.22 (d, J = 12.0 Hz, 1 H), 8.32 (m, 4 H), 8.49 (d, J =8.0 Hz, 1 H); 13C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 44.48, 50.92, 117.45, 123.38,124.44, 124.48, 124.68, 125.23, 125.47, 126.54, 127.12, 127.60, 127.66,127.94, 129.85, 130.74, 131.39, 136.55, 141.06。高分辨质谱测定：HR-ESI-MS calcdfor C20H17N：271.1361, found 272.1143 [M+H+]，294.1246 [M+Na+]，310.0985 [M+K+]。

实施例3

一种识别检测甲醛的芘衍生物荧光探针分子的制备方法：

单口烧瓶中，将烯丙基三氟硼酸钾（148 mg，1 mmol）溶于74.4 mL的氨甲醇溶液（浓度为7 mol/L），氮气保护条件下，常温搅拌15 min。将1-芘甲醛（28.8 mg，0.13 mmol）溶于19.2 mL的氨甲醇溶液（浓度为7 mol/L），并加入12 μL的水，将该反应液注入到烯丙基三氟硼酸钾的氨甲醇溶液中，常温反应20 h。反应完毕后，通过旋转蒸发仪减压去除溶剂得到粗产品。经硅胶柱层析分离（洗脱液为乙酸乙酯：石油醚=1:6，体积比）得到黄色固体30.5 mg即为产物B1，产率为90%。

核磁共振测定：1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 2.53 (q, J = 8.0 Hz, 1 H),2.63 (q, J = 6.7 Hz, 1 H), 5.07 (m, 3 H), 5.87 (m, 1 H), 8.06 (t, J = 8.0 Hz,1 H), 8.15 (s, 2 H), 8.22 (d, J = 12.0 Hz, 1 H), 8.32 (m, 4 H), 8.49 (d, J =8.0 Hz, 1 H); 13C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 44.48, 50.92, 117.45, 123.38,124.44, 124.48, 124.68, 125.23, 125.47, 126.54, 127.12, 127.60, 127.66,127.94, 129.85, 130.74, 131.39, 136.55, 141.06。高分辨质谱测定：HR-ESI-MS calcdfor C20H17N：271.1361, found 272.1143 [M+H+]，294.1246 [M+Na+]，310.0985 [M+K+]。

应用例

荧光选择性实验：

配制pH为7.4、浓度为10 mM的HEPES缓冲溶液，并用乙醇配制浓度为1 mM的探针B1乙醇溶液。用荧光光谱仪考察了探针B1对甲醛的选择性。如附图3所示，在390 nm处激发条件下，单独的探针探针B1 (10 µM)在HEPES缓冲溶液中在472 nm处具有微弱的荧光发射强度，当加入甲醛(20 eq.)后，在472 nm处的荧光发射强度明显增强，但是加入其它物质 (20 eq.)时，溶液体系的荧光发射强度与单独探针体系的荧光发射强度相比没有明显变化。以上实验结果表明，该探针对甲醛具有较好的专一选择性。

抗干扰性实验：

配制pH为7.4、浓度为10 mM的HEPES缓冲溶液，并用乙醇配制浓度为1 mM的探针B1乙醇溶液。用荧光光谱仪考察了探针B1对甲醛的选择性的抗干扰性。在16个干净的荧光比色皿中，分别加入3000 μL的HEPES缓冲溶液和30 μL的探针B1乙醇溶液，再分别加入20个摩尔当量的甲醛和20个摩尔当量的其他分析物（各类醛类、氨基酸类、过氧化物等），在荧光光谱仪上检测，在荧光光谱仪上检测，结合实施例2的数据，绘制不同分析物对应的472 nm荧光强度的柱状图，得到荧光发射柱状图（附图4）。

经实验证明，其他分析物不干扰体系对甲醛的测定。

最低检出限实验：

良好的检出限是检验一个探针分子是否具有应用价值的标准之一。配制pH为7.4、浓度为10 mM的HEPES缓冲溶液，并用乙醇配制浓度为1 mM的探针B1溶液。固定探针B1浓度为10µM，测定其对不同浓度的甲醛的响应强度，随着甲醛浓度的增加，体系荧光发射强度在472nm处不断增强（附图5），研究发现溶液荧光发射强度在甲醛浓度为0-6 µM间呈线性（R2 =0.992），经计算(3σ/k)得出该探针分子对甲醛的检出限为0.107 μM。

探针B1对细胞外源性甲醛荧光成像实验：

将本发明探针B1应用于Eca109（食管癌细胞），对外源性的甲醛进行荧光成像，具体步骤如下：

a) 将10 µM探针B1溶液加入到育有Eca109细胞的培养液（2 mL）中，在二氧化碳培养箱中培养20 min，用HEPES缓冲溶液洗涤2次，明场成像，如附图6（B），可以看到细胞大致的轮廓；

b) 将 a)中细胞用390 nm激光激发，蓝光通道成像，得到没有荧光的附图6（A）；

c) 将10 µM探针B1溶液加入到育有Eca109细胞的培养液（2 mL）中，在二氧化碳培养箱中培养20 min，加入400 µM的甲醛水溶液后，在二氧化碳培养箱中培养2 h，用HEPES缓冲溶液洗涤2次，明场成像，如附图6（D），可以看到细胞大致的轮廓；

d) 将 c)中细胞用390 nm激光激发，蓝光通道成像，得到具有较强蓝色荧光的附图6（C）；

根据附图6所示，没有加入甲醛溶液的细胞在390 nm的激发下在蓝光通道几乎没有荧光发出。然而，另一份在加入甲醛溶液后，在390 nm的激发下在蓝光通道具有较强的荧光发出。这说明本发明探针B1可以对细胞中外源性的甲醛进行荧光成像。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。