基于芘衍生物的分子荧光探针在生物大分子检测上的应用研究

摘要

酶作为具有生物催化功能的大分子物质，与生命过程紧密相关。胰蛋白酶作为人体肠道内最重要的消化酶，参与众多的生理过程，其含量异常可能会引起胰腺癌、胰腺炎等众多疾病。乙酰胆碱酶在神经中枢和外围神经系统中起着非常关键的作用，其含量是否正常与一些神经肌肉疾病和阿尔茨海默病等紧密相关。因此，快速准确的对这些酶实施检测具有很重要的现实意义。传统的检测方法仪器昂贵、操作复杂且无法快速实时检测，因而开发一种简单快速灵敏的可视化检测方法具有很重要的意义。
　　分子荧光探针由于其选择性灵敏度高、原位实时快速、对样品检测无损等优点，在环境科学以及生命科学领域的应用中受到人们高度关注。芘作为最重要的荧光基团之一，其量子产率高，容易形成稳定的激基缔合物，已被广泛的应用在各种分子荧光探针的设计中。
　　针对上述两种生物大分子的检测，本文主要做了以下两部分工作：
　　1.合成了芘的衍生物3-(芘-1-氧基)丙磺酸钠(Pypos)，采用荧光光谱法实现了对胰蛋白酶的检测。该法以精蛋白为底物，带负电荷的Pypos分子由于静电作用在表面带正电荷的精蛋白周围规整排列，形成芘的激基缔合物，在胰蛋白酶作用下，精蛋白被迅速水解使得 Pypos分子解聚为单体态，通过这种excimer-monomer转换实现对胰蛋白酶的检测。同时对胰蛋白酶的活性进行了实时监测，紫外灯下裸眼检测限可达0.5μg/mL。最后对胰蛋白酶抑制剂的抑制效率进行了实时监测，其半数抑制效率浓度IC50为0.4977U/mL。
　　2.合成了芘的衍生物3-(4-(1-芘基)丁酰)丙基三甲基溴化铵(Py-Ch)，利用芘丁酸/Py-Ch的探针体系实现了对乙酰胆碱酯酶的检测。芘丁酸/Py-Ch以一定浓度混合后形成激基缔合物，在乙酰胆碱酯酶作用下Py-Ch被水解为芘丁酸和胆碱，激基缔合物消失，利用芘分子从excimer到monomer之间的转换实现对乙酰胆碱酯酶的可视化检测。最后研究了磷农药马拉硫磷对乙酰胆碱酯酶的抑制作用，结果表明该体系可潜在的用于对乙酰胆碱酯酶抑制剂的检测。
　　上述两种简单、快速、高选择性的可视化检测方法有很高的潜在应用价值。

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1绪论

1.1荧光分子探针

1.2荧光分子探针的响应机理

1.3基于芘的分子荧光探针

1.4胰蛋白酶及其检测

1.5 乙酰胆碱酯酶及其检测

1.6本课题的提出及研究内容

2 原料试剂与仪器

2.1原料与试剂

2.2主要实验设备仪器

3 探针的合成与表征

3.1水溶性探针Pypos的制备

3.2 探针3-[4-(1-芘基)丁酰]丙基三甲基溴化铵(Py-Ch)的制备

4 芘的衍生物探针Pypos对胰蛋白酶的检测

4.1前言

4.2 样品配制及光谱测试

4.3探针Pypos与精蛋白的相互作用

4.4 Pypos/Protamine与胰蛋白酶的相互作用

4.5 胰蛋白酶抑制剂对体系的作用

4.6本章小结

5芘衍生物芘丁酸和Py-Ch对乙酰胆碱酯酶的检测

5.1样品配制

5.2芘丁酸和Py-Ch的相互作用及条件筛选

5.3乙酰胆碱酯酶的检测

5.4抑制剂磷农药作用的研究

5.5本章小结

结论

参考文献

致谢

个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果