一种羧基封端的聚乙二醇修饰的介孔二氧化硅纳米颗粒的制备及其用途

摘要

本发明提供一种羧基封端的聚乙二醇修饰的介孔二氧化硅纳米颗粒的制备方法，将双端羧基封端的聚乙二醇(HOOC‑PEG‑COOH)溶于水中，加入1‑乙基‑(3‑二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCl)，搅拌10‑15min后加入N‑羟基琥珀酰亚胺(NHS)，反应活化0.5‑1h后，再逐滴缓慢加入氨基修饰的介孔二氧化硅纳米粒子(CMS‑NH2)，室温反应4‑12h，离心，用蒸馏水洗涤3‑5次，分散于水中保存，得到羧基封端的聚乙二醇修饰的介孔二氧化硅纳米颗粒CMS‑PEG‑COOH。本发明通过酰胺键将具有双端羧基封端的聚乙二醇修饰到介孔二氧化硅纳米粒子表面，提高纳米粒子的胶体稳定性。该材料修饰纳米粒子后，其末端含有羧基官能团可以与许多靶向分子结合以实现药物的靶向输送。

说明书

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种羧基封端的聚乙二醇修饰的介孔二氧化硅纳米颗粒的制备方法及其用途。

背景技术

具有高度胶体稳定性的纳米介孔二氧化硅颗粒由于其具有优异的结构性质，如巨大的表面积，可调节的孔径，规则的孔结构以及在内外表面上的易于改性而引起了人们的广泛关注。这些非常有吸引力的特征使得介孔二氧化硅纳米粒子成为一种有前景的，广泛适用于输送催化剂，药物和其他功能性分子。此外，胶体介孔二氧化硅纳米粒子的内外表面可修饰功能基团，可有效的应用于药物输送。一方面，通过细调主客体间的相互作用使纳米粒子内部孔表面的功能化。另一方面，纳米粒子外表面的功能基团修饰不影响孔径和孔体积，纳米颗粒表面功能化修饰在的胶体稳定性及其与环境的相互作用中起重要作用。此外，使用特别具有刺激响应基团或靶向配体修饰介孔二氧化硅纳米粒子可以使载药体系具有可控或靶向药物递送的能力。例如使材料具有外部或内部的生物刺激响应性如pH，温度，光，氧化还原，磁性，酶和竞争性结合响应等。

静脉给药时，在生理条件下对刺激响应性药物递送系统(DDS)的外表面的大量蛋白质吸附以及二氧化硅被网状内皮系统(RES)识别为外来入侵物将导致介孔二氧化硅纳米粒子从循环中快速清除。因此，为了提高二氧化硅纳米粒子的运输，生物相容性和稳定性，急需要在纳米材料表面修饰具有生物相容性聚合物来保护纳米粒子。聚乙二醇(PEG)可以通过包裹有序介孔材料形成屏蔽效应，使它们有可能逃脱RES的吸收，延长体内循环时间，提高增强的渗透和保留(EPR)效应。聚乙二醇修饰的介孔二氧化硅纳米粒子具有高度亲水性以及可生物降解性使其成为体内应用的理想材料，特别是在癌症治疗中。本发明设计通过酰胺键将具有羧基封端的聚乙二醇修饰到介孔二氧化硅纳米粒子表面，提高纳米粒子的胶体稳定性。该材料修饰聚乙二醇后，其末端含有羧基官能团可以与许多靶向分子结合以实现药物的靶向输送。在进一步的工作中，我们将修饰一个靶向分子，并研究载药和控制释放的性质。

发明内容

本发明的目的在于提供一种输送抗肿瘤药物的羧基封端的聚乙二醇修饰的介孔二氧化硅纳米颗粒的制备方法，从而有效控制药物释放，降低药物副作用。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种羧基封端的聚乙二醇修饰的介孔二氧化硅纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤：

将双端羧基封端的聚乙二醇(HOOC-PEG-COOH)溶于水中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCl)，搅拌10-15min后加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，反应活化0.5-1h后，再逐滴缓慢加入氨基修饰的介孔二氧化硅纳米粒子(CMS-NH₂)，室温反应4-12h，离心，用蒸馏水洗涤3-5次，分散于水中保存，得到羧基封端的聚乙二醇修饰的介孔二氧化硅纳米颗粒CMS-PEG-COOH。

优选地，所述HOOC-PEG-COOH与CMS-NH₂的质量比为(1-5)：1，HOOC-PEG-COOH、EDC与NHS的摩尔比为(0.1-0.5)：1：1。

优选地，所述HOOC-PEG-COOH的制备方法包括以下步骤：

称取PEG溶于二甲基甲酰胺(DMF)中，待PEG完全溶解后，加入马来酸酐，再加入吡啶催化，反应6-15h，减压蒸干DMF，将浓缩液滴入冰乙醚沉淀，过滤，用冰乙醚洗涤2-4次，溶于3-5ml的CH₂Cl₂，滴入50-100ml冰乙醚沉淀，用乙醚洗涤2-4次，得到棕黄色固体粉末HOOC-PEG-COOH，低温真空干燥，-20℃避光干燥保存。

优选地，所述氨基修饰的介孔二氧化硅纳米粒子(CMS-NH₂)的制备方法包括以下步骤：

将无水乙醇，水与表面活性剂混合，加入到碱溶液，搅拌均匀，控制pH值在9.5-10.5，在40-90℃下加入正硅酸烷基酯，15-30min后再加入氨基硅烷偶联剂，继续搅拌2h，自然冷却至室温，离心，水和乙醇分别洗涤，过滤后加入到除模板剂中，回流，分离，洗涤，真空干燥，得介孔二氧化硅纳米颗粒CMS-NH₂。

优选地，所述PEG的分子量为1000-20000；所述PEG与马来酸酐的摩尔比为1：(2-10)；PEG与吡啶的质量比为1：(0.03-0.05)。

优选地，所述表面活性剂为十六烷基三甲基氯化铵(CTAC)，十六烷基三甲基溴化铵、十六烷基三乙基溴化铵、三辛基甲基氯化铵、十二烷基三甲基氯化铵或十四烷基三甲基氯化铵。

优选地，所述正硅酸烷基酯为正硅酸四乙酯、正硅酸四甲酯、正硅酸四丙酯或正硅酸四丁酯。

优选地，所述氨基硅烷偶联剂为γ-氨丙基三甲氧基硅烷、γ-氨丙基三乙氧基硅烷、N-(β-氨乙基)-γ-氨丙基甲基二甲氧基硅烷、N-β(氨乙基)-γ-氨丙基三甲氧基硅烷、N-(2-氨乙基)-3-氨丙基三乙氧基硅烷、γ-氨丙基甲基二乙氧基硅烷、3-氨丙基甲基二甲氧基硅烷或N-正丁基-3-氨丙基三甲氧基硅烷。

优选地，所述碱溶液为氨水、氢氧化钠、三乙醇胺，所述水为纯水或超纯水。

优选地，所述正硅酸烷基酯：氨基硅烷偶联剂：表面活性剂：碱：水：乙醇的摩尔比为(2.5-5)：0.5：(0.7-0.8)：(1.4-5.1)：(300-400)：(10-20)。

优选地，所述除模板剂组成为含硝酸铵(NH₄·NO₃)的乙醇溶液或含盐酸的乙醇溶液，选择含盐酸的乙醇溶液，其中乙醇：盐酸(37％)(v/v)＝9：1，回流2-3次，每次2-4h。

一种羧基封端的聚乙二醇修饰的介孔二氧化硅纳米颗粒，由上述方法制备得到。

上述羧基封端的聚乙二醇修饰的介孔二氧化硅纳米颗粒在药物载体领域的应用，利用末端的羧基官能团与靶向分子进行结合，实现药物的靶向输送。

EDC和NHS作为偶联剂，在HOOC-PEG-COOH与CMS-NH₂的反应过程中起到活化羧基，催化-COOH与-NH₂反应的作用。NHS用来维持EDC的活性，因为EDC在水中易分解，反应过程中会有稳定的活性酯中间体NHS-PEG-NHS产生，该活性酯会立即与CMS-NH₂中的-NH₂反应，HOOC-PEG-COOH通过酰胺键嫁接到CMS-NH₂表面。由于反应介质是水，PEG末端的-NHS容易水解，两端羧基官能团修饰的PEG只会有一端羧基与CMS-NH₂反应，因此PEG另一端仍保留有羧基官能团，即得到CMS-PEG-COOH产物。本发明通过酰胺键将具有双端羧基封端的聚乙二醇修饰到介孔二氧化硅纳米粒子表面，提高纳米粒子的胶体稳定性。该材料修饰纳米粒子后，其末端含有羧基官能团可以与许多靶向分子结合以实现药物的靶向输送。

附图说明

利用附图对本发明作进一步说明，但附图中的实施例不构成对本发明的任何限制。

图1是本发明羧基封端的聚乙二醇修饰的介孔二氧化硅纳米颗粒的制备反应过程示意图；

图2是本发明实施例1所得CMS-NH₂(a)和CMS-PEG-COOH(b)的透射电镜图；

图3是PEG的核磁图谱；

图4是本发明实施例1所得HOOC-PEG₂₀₀₀-COOH的核磁图谱；

图5是本发明实施例1所得CMS-NH₂和CMS-PEG-COOH的吸附-脱附曲线；

图6是本发明实施例1所得CMS-NH₂和CMS-PEG-COOH的孔径分布图。

具体实施方式

为使本发明更加容易理解，下面将进一步阐述本发明的具体实施例。

实施例1

步骤一：羧基封端的聚乙二醇(HOOC-PEG-COOH)的制备

称取4g PEG₂₀₀₀(2mmol)溶于20mLDMF，加热搅拌，油浴控温在60℃，待PEG₂₀₀₀完全溶解后，加入1.961g马来酸酐(20mmol)，再加入112.8μL吡啶(1.6mmol)，反应6h。减压蒸干DMF，将浓缩液滴入冰乙醚沉淀，过滤，用冰乙醚洗涤2次，溶于5ml的CH₂Cl₂，滴入50ml冰乙醚沉淀，用乙醚洗涤2次，得到棕黄色固体粉末HOOC-PEG-COOH，低温真空干燥，-20℃避光干燥保存。

步骤二：氨基修饰介孔二氧化硅纳米粒子(CMS-NH₂)的制备

将64mL水(3.55mol)、10.5mL乙醇(0.179mol)、10.4mL 25wt％CTAC(7.86mmol)溶液在室温下剧烈搅拌10min，然后加入12.4mL三乙醇胺(0.093mol)，继续剧烈搅拌15min，直至溶液澄清用做储备液。取20mL上述储备液置于三口烧瓶中，油浴加热至60℃，随后在搅拌下2-3min内逐滴加1.454mLTEOS(6.5mmol)，反应15min后，加入0.152mL的APTES(0.65mmol)，继续在60℃搅拌反应2h。冷却至室温，离心(10000r，15min)，乙醇洗涤两次。将所得产物再分散于含有5mL盐酸与45mL的乙醇溶液中，60℃回流提取2h以除去CTAC，重复回流提取两次，最后用乙醇，水交替洗涤5-6次，分散于水溶液中配制成5mg/mL的溶液备用。

步骤三：羧基封端的聚乙二醇修饰的介孔二氧化硅纳米粒子的制备

将HOOC-PEG-COOH(100mg，0.05mmol)溶于10mL水中，滴加30mg EDC，搅拌10min后加入20mg NHS，反应活化1h后，再逐滴缓慢加入10mL CMS-NH₂(5mg/mL)，室温反应12h，离心(10000r，10mim)，用蒸馏水洗涤3次，分散于水中配制成5mg/mL的溶液。

上述反应过程如图1所示。

实施例2

步骤一：羧基封端的聚乙二醇(HOOC-PEG-COOH)的制备

称取4g PEG₂₀₀₀(2mmol)溶于20mLDMF，加热搅拌，油浴控温在60℃，待PEG₂₀₀₀完全溶解后，加入0.98g马来酸酐(10mmol)，再加入112.8μL吡啶(1.6mmol)，反应6h。减压蒸干DMF，将浓缩液滴入冰乙醚沉淀，过滤，用冰乙醚洗涤2次，溶于5ml的CH₂Cl₂，滴入50ml冰乙醚沉淀，用乙醚洗涤2次，得到棕黄色固体粉末HOOC-PEG-COOH，低温真空干燥，-20℃避光干燥保存。

步骤二：氨基修饰介孔二氧化硅纳米粒子(CMS-NH₂)的制备

将64mL水(3.55mol)、10.5mL乙醇(0.179mol)、10.4mL 25wt％CTAC(7.86mmol)溶液在室温下剧烈搅拌10min，然后加入12.4mL三乙醇胺(0.093mol)，继续剧烈搅拌15min，直至溶液澄清用做储备液。取40mL上述储备液置于三口烧瓶中，油浴加热至60℃，随后在搅拌下2-3min内逐滴加1.454mLTEOS(6.5mmol)，反应15min后，加入0.152mL的APTES(0.65mmol)，继续在60℃搅拌反应2h。冷却至室温，离心(10000r，15min)，乙醇洗涤两次。将所得产物再分散于含有5mL盐酸与45mL的乙醇溶液中，60℃回流提取2h以除去CTAC，重复回流提取两次，最后用乙醇，水交替洗涤5-6次，分散于水溶液中配制成5mg/mL的溶液备用。

步骤三：羧基封端的聚乙二醇修饰的介孔二氧化硅纳米粒子的制备

将HOOC-PEG-COOH(100mg，0.05mmol)溶于10mL水中，滴加30mg EDC，搅拌10min后加入20mg NHS，反应活化0.5h后，再逐滴缓慢加入5mL CMS-NH₂(5mg/mL)，室温反应12h，离心(10000r，10mim)，用蒸馏水洗涤3次，分散于水中配制成5mg/mL的溶液。

实施例3

步骤一：羧基封端的聚乙二醇(HOOC-PEG-COOH)的制备

称取4g PEG₂₀₀₀(2mmol)溶于20mLDMF，加热搅拌，油浴控温在60℃，待PEG₂₀₀₀完全溶解后，加入0.49g马来酸酐(5mmol)，再加入112.8μL吡啶(1.6mmol)，反应6h。减压蒸干DMF，将浓缩液滴入冰乙醚沉淀，过滤，用冰乙醚洗涤2次，溶于5ml的CH₂Cl₂，滴入50ml冰乙醚沉淀，用乙醚洗涤2次，得到棕黄色固体粉末HOOC-PEG-COOH，低温真空干燥，-20℃避光干燥保存。

步骤二：氨基修饰介孔二氧化硅纳米粒子(CMS-NH₂)的制备

将64mL水(3.55mol)、10.5mL乙醇(0.179mol)、10.4mL 25wt％CTAC(7.86mmol)溶液在室温下剧烈搅拌10min，然后加入12.4mL三乙醇胺(0.093mol)，继续剧烈搅拌15min，直至溶液澄清用做储备液。取20mL上述储备液置于三口烧瓶中，油浴加热至60℃，随后在搅拌下2-3min内逐滴加1.454mLTEOS(6.5mmol)，反应15min后，加入0.304mL的APTES(1.3mmol)，继续在60℃搅拌反应2h。冷却至室温，离心(10000r，15min)，乙醇洗涤两次。将所得产物再分散于含有5mL盐酸与45mL的乙醇溶液中，60℃回流提取2h以除去CTAC，重复回流提取两次，最后用乙醇，水交替洗涤5-6次，分散于水溶液中配制成5mg/mL的溶液备用。

步骤三：羧基封端的聚乙二醇修饰的介孔二氧化硅纳米粒子的制备

将HOOC-PEG-COOH(100mg，0.05mmol)溶于10mL水中，滴加30mg EDC，搅拌10min后加入20mg NHS，反应活化0.5h后，再逐滴缓慢加入5mL CMS-NH₂(5mg/mL)，室温反应4h，离心(10000r，10mim)，用蒸馏水洗涤3次，分散于水中配制成5mg/mL的溶液。

采用动态光散射仪(DLS)对实施例1所得CMS-NH₂和CMS-PEG-COOH的:粒径及电位进行测试，测试结果如表1所示。

表1 CMS-NH₂和CMS-PEG-COOH纳米粒子的粒径电位

氨基功能化的介孔二氧化硅纳米粒子水合粒径为134.2nm，PDI 0.081，具有良好的分散性，电位为44.3mV，带正电主要是由于氨基修饰的介孔二氧化硅表面存在大量的氨基官能团。纳米粒子表面进一步修饰双端羧基的聚乙二醇后，CMS-PEG-COOH电位降低可能是HOOC-PEG-COOH与CMS-NH₂表面的氨基发生酰胺化反应，HOOC-PEG-COOH逐渐嫁接到CMS-NH₂表面后，粒子表面的聚乙二醇的末端羧基官能团逐渐增加，导致纳米粒子的电位由正电位变为负电位。

CMS-PEG-COOH的水合粒径为251.7nm，相较于CMS-NH₂明显增加了117.5nm，这可能归因于末端羧基的质子化，导致PEG链段的伸展。PDI>2相比，分散性有所降低。从粒径与电位的变化证明了CMS-PEG-COOH成功制备。对实施例1所得CMS-NH₂及CMS-PEG-COOH进行透射电镜表征，表征结果如图2所示，CMS-NH₂呈现出球形形貌并且分布均匀，粒子大小相对均一，平均粒径约为90nm，此外，可看到明显的蠕虫状的介孔孔道。经过HOOC-PEG-COOH的修饰改性后，平均粒径约为120nm，并没有显著改变其形貌和粒径，但是相较于CMS-NH₂所呈现的明显的介孔结构，CMS-PEG-COOH的介孔结构变得模糊几乎看不见，是由于聚合物HOOC-PEG-COOH对介孔二氧化硅纳米粒子的包裹，引起了孔道的闭塞。

图3和图4分别为PEG和实施例1所得HOOC-PEG-COOH的核磁图谱。图4中δ＝3.46-3.83处特征峰(a：-OCH₂CH₂-)是HOOC-PEG₂₀₀₀-COOH和原料PEG的共有特征峰，δ＝3.71处特征峰(b：-CH₂CH₂OC＝O，β位亚甲基氢原子)与a处重叠，即b包含于a中。δ＝6.20-6.41处特征峰(d：-CH＝CH-)为马来酸酐参与反应带来的双键峰，δ＝4.35-4.38处特征峰(c：-CH₂OC＝O)为产物的特征峰，c与d共同存在，以及c和a处的峰面积比为1：46.7，而理论上HOOC-PEG₂₀₀₀-COOH上c和a处的氢原子的个数比为1：44，表明PEG两端的羟基已经转化为含双键的羧基。

为了更进一步了解所得到的纳米材料的结构及其表面特性，对CMS-NH₂和CMS-PEG-COOH做了氮气吸附-脱附分析。图5是实施例1所制备的CMS-NH₂和CMS-PEG-COOH的吸附-脱附曲线，可以看出该图呈现的是典型的介孔IV型吸附-脱附曲线，且在0.8P/P0均出现迟滞环，表明CMS-NH₂和CMS-PEG-COOH的介孔结构。通过相应的公式计算，如表2中所示，CMS-NH₂和CMS-PEG-COOH的BET(Brunauer-Emmett-Teller)比表面积分别为655m²/g和475m²/g，BJH(Barrett-Joiner-Halenda)孔体积分别为0.98cm³/g和0.62cm³/g。这两种介孔二氧化硅纳米粒子所呈现的巨大的比表面积和孔容为其在药物递送中的应用奠定了基础。图6为CMS-NH₂和CMS-PEG-COOH的孔径分布图，通过相应公式计算得到两者的BJH孔径分别为5.95nm和5.25nm。以上数据表明CMS-NH₂和CMS-PEG-COOH应用在药用载体方面具有巨大前景。

表2 CMS-NH₂和CMS-PEG-COOH的氮气吸附脱附数据分析

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。